一种新的代谢物轮廓分析全二维液质联用方法及其检测试剂盒与流程

本发明涉及分析化学领域，是用一种全二维超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术对非转基因大豆、转基因大豆、茶叶以及银杏叶进行全二维UPLC高温高速分析得到其全二维代谢轮廓谱的新方法。

同时，本发明公开的检测试剂盒，是一种对非转基因大豆、转基因大豆等多种生物类样品中的代谢物进行全二维代谢轮廓谱分析的新技术。

背景技术：

近年来，现代色谱法已经成为分析化学领域中复杂体系组分分析分离的重要工具之一。对于复杂样品中各组分的分离，一种分离模式往往不能提供足够的峰容量和色谱峰分辩率。因此，将不同模式的分离方法组合起来，构建多维色谱分离系统是解决这一问题的有效途径。自1984年多维分离的概念提出以来，随着色谱方法的不断完善、柱切换控制等技术的发展，多维分离技术得到了较快发展，并已在生物、化学以及环境等诸多科学领域得到应用。全二维气相色谱/质谱技术是最先商品化的多维分离技术，其在石油、植物挥发油、血浆等样品的分离和研究等方面已表现出明显的优势。相对于气相色谱只能分析挥发性或半挥发性样品组分来说，二维液相色谱因其可分析复杂体系组分中多种不挥发性物质而具有更广阔的应用前景，在复杂体系样品研究领域占有越来越重要的地位。

相对于操作复杂、程序冗繁，并且样品组分易损失和污染的离线二维液相色谱技术，全二维在线液相色谱技术被越来越关注。随着接口与控制技术的发展，全二维在线液相色谱技术实现的关键在于样品组分在两种分离模式之间的转换，如何将分离机理不同而又相互独立的两支色谱柱串联起来，构成一个整体的高效分离分析系统成为科研工作者们的研究重点。一般认为，全二维液相分离应满足3个条件：(a)样品的每一个组分都将在不同模式下进行分离；(b)所有的样品组分都以相等的比例从第一维分离系统转移到第二维分离系统中；(c)在第一维分离系统中已经得到的分辨率基本维持不变。这也同时是传统的中心切割技术与全二维技术的区别。

由于全二维液相色谱通常采用两种不同的分离机理(具有正交性)的色谱柱以分析样品，即利用样品组分的不同结构特性把复杂混合物分离成单一组分，这些特性包括分子量大小、等电点、亲水性以及特殊分子间亲和作用等，在一维分离系统中不能分离或部分分离的组分，经过第一维的色谱柱分离后进入接口中，通过浓缩、捕集或定量环切割后被切换进入第二维的色谱柱中，其可能在二维系统中利用不同分离原理得到更好的分离，从而使得分析方法的峰容量、分离能力和分辨率得到极大的提高。但是，由于不同分离机理的色谱柱往往使用的是不同的流动相体系。因此，如何使一维色谱的洗脱产物在进入第二维分析系统时，能够具有更好的兼容性是目前的研究热点之一。

基于不同的分析目的，我们可以采用不同分离机理的柱系统构建全二维液相色谱分离系统。本发明公开了一种新的代谢物轮廓分析全二维液质联用方法。采用全二维超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术对非转基因大豆、转基因大豆、茶叶以及银杏叶进行全二维UPLC高温高速分析得到其全二维代谢轮廓谱的新方法。同时，本发明公开的检测试剂盒，是一种对非转基因大豆、转基因大豆等多种生物类样品中的代谢物进行全二维代谢轮廓谱分析的新技术。这种新方法及其检测试剂盒，在对非转基因大豆、转基因大豆、茶叶以及银杏叶进行全二维代谢轮廓谱分析时具有耗时短、高峰容量、高分辨率以及高灵敏度等特点。

技术实现要素：

本发明的目的是开发一种新的代谢物轮廓分析全二维液质联用方法，所述的新方法可基于全二维超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术对非转基因大豆、转基因大豆、茶叶以及银杏叶进行全二维UPLC高温高速分析得到其全二维代谢轮廓谱。该方法具有高灵敏度、高分辨率、高峰容量以及高通量的特点，适于多种生物样本的全二维代谢轮廓谱分析。

同时，本发明亦开发了一种对非转基因大豆、转基因大豆等多种生物类样品中的代谢物进行全二维代谢轮廓谱分析的试剂盒。使用该试剂盒检测非转基因大豆、转基因大豆等多种生物类样品中全二维代谢轮廓谱的方法具有检测成本低，重复性好，稳定性高，快速高效等特点。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种新的代谢物轮廓分析全二维液质联用方法。采用全二维超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(2D-UPLC Q-TOFMS)联用技术对非转基因大豆、转基因大豆、茶叶以及银杏叶进行全二维UPLC高温高速分析得到其全二维代谢轮廓谱。

同时，本发明公开了一种新的检测非转基因大豆、转基因大豆、茶叶以及银杏叶中代谢物的全二维代谢轮廓谱的试剂盒，该试剂盒由二部分构成：(1)缓冲液一第一维液相色谱使用的缓冲液为含醋酸铵、甲酸铵或碳酸氢铵的乙腈或甲醇水缓冲溶液；(2)洗脱液-乙腈或甲醇。使用该试剂盒检测非转基因大豆、转基因大豆等多种生物类样品全二维代谢轮廓谱的方法具有检测成本低，重复性好，稳定性高，快速高效的特点。

具体步骤如下，

1)采集非转基因大豆、转基因大豆、茶叶以及银杏叶样本若干。

2)样品预处理：将待测样品液氮搅拌研磨成粉，并冻干称量，精确称量60mg样品于2mL离心管中，加入1.5mL 70％甲醇水超声1小时，12000转离心15分钟后，用0.22μm有机滤膜过滤后直接上样分析，预处理过程简单快速、重复性好。

3)选取试剂盒最佳组成：第一维液相色谱缓冲液和洗脱液均选择10mM甲酸铵乙腈水体系；也可选择醋酸铵或碳酸氢铵和乙腈(甲醇)体系，但这些体系的分析速度较慢且各组分的分离度也较差。

4)试剂盒使用条件：色谱仪器为本实验室自行组装的全二维超高效液相色谱，包括安捷伦1260自动进样器、安捷伦1200、1260液相色谱泵、安捷伦1200系列DAD检测器和柱温箱以及VICI十通阀。第一维色谱柱为Waters ACQUITY UPLC^TM BEH Amide亲和色谱柱，第二维谱柱为Agilent C₁₈反向色谱柱。第一维和第二维柱温分别为30、60摄氏度，流速分别为0.01和0.7ml/min，质谱仪器为安捷伦6520B四级杆飞行时间质谱仪(6520B Q-TOFMS)。

5)对各组样本依次进行全二维超高效液相色谱质谱高温高速全二维代谢轮廓谱分析。

第一维液相条件为：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC^TM BEH Amide亲和色谱柱，流动相A为含10mM甲酸氨的40％乙腈水溶液，B为含10mM甲酸氨的95％乙腈水溶液；梯度洗脱条件为：0～5min为100％B相，5～200min线性变化至0％B相，保持10min，210～210.01min升至100％B相并保持39.99min；流速0.01mL/min，柱温30℃，进样量20μL。

第二维液相条件为：色谱柱为Agilent C₁₈反向色谱柱，流动相A为0.1％甲酸水溶液，B为乙腈；其液相分析条件分为三个阶段，第一阶段为0-75min，梯度洗脱条件为：初始流动相为80％A相，0～1.5min为30％A相，1.5～1.51min升至80％A相并保持0.49min；流速0.7mL/min，柱温60℃；第二阶段为75-165min，梯度洗脱条件为：初始流动相为95％A相，0～1.5min为60％A相，1.5～1.51min升至95％A相并保持0.49min；流速0.7mL/min，柱温60℃；第三阶段为165-200min，梯度洗脱条件为：初始流动相为99％A相，0～1.5min为90％A相，1.5～1.51min升至99％A相并保持0.49min；流速0.7mL/min，柱温60℃；柱后流出液经分流后进入质谱检测。

阀切换流程(图1)：经第一维亲和色谱柱分离后与流动相共流出的代谢物直接流入十通阀的20微升定量环中，随后在2分钟后经十通阀切换，被第二维液相色谱的流动相冲入第二维反相色谱柱进行分离，色谱流出物通过分流后进入质谱进行检测。于此同时，在第二维液相色谱进行分析时，第一维在2分钟后共流出的代谢物进行十通阀的另一个20微升定量环中，随后在下一个2分钟后经十通阀切换，被第二维液相色谱的流动相冲入第二维反相色谱柱进行分离。通过这种每隔2分钟切换一次十通阀流路的方法，达到将第一维共流出的代谢物不停注入十通阀上的两个定量环中，从而在每隔2分钟的阀切换中依次进入第二维液相色谱进行反向色谱分析的目的。

质谱条件为：采用电喷雾离子源正离子模式检测；脱溶剂气为高纯氮气，流量气为600L/h；脱溶剂气温度均为300℃；毛细管电压和裂解电压分别为3500V和130V，雾化器压力为25psi；质量扫描范围为80～1200m/z；每0.97秒采集一次数据以获得全二维代谢轮廓谱。

6)由于安捷伦Masshunter采集软件采集得到的数据不能直观体现全二维代谢轮廓谱的分离情况，因此数据需经GC Image LCxLC Edition Software软件转化为直观可视的二维图像。

本发明方法具有的效果是：样本的采集、储存采用了标准化操作程序，避免引入人为误差；预处理过程简单，分析过程采用高温高速的全自动化在线全二维液相色谱质谱法。此方法不仅提高了对被分析物的分离分辩能力，而且大大缩短了分析时间；相比于传统的液相色谱质谱(HPLC-MS)方法，具有方法安全可靠，分析快速、高灵敏度、高峰容量以及高分辨率等特点，适于多种生物样本的全二维代谢轮廓谱分析。

附图说明

图1阀切换流程：A-切阀前；B-切阀后。。

图2银杏叶全二维代谢轮廓谱。

图3非转基因大豆全二维代谢轮廓谱。

图4转基因大豆全二维代谢轮廓谱。

图5茶叶全二维代谢轮廓谱。

具体实施方式

实施例1

1、非转基因大豆、转基因大豆、茶叶以及银杏叶样本收集

购买非转基因大豆、转基因大豆、花茶茶叶若干、采集新鲜银杏树叶若干，立即储存于超低温-80℃冰箱中，备用。

2、分析方法

2.1样本预处理

非转基因大豆、转基因大豆、茶叶以及银杏叶样本从超低温冰箱中取出后，室温条件下解冻。液氮搅拌研磨成粉，并冻干称量，精确称量60mg样品于2mL离心管中，加入1.5mL 70％甲醇水超声1小时，12000转离心15分钟后，用0.22μm有机滤膜过滤后直接上样分析。

2.2全二维超高效液相色谱质谱高温高速全二维代谢轮廓分析

第一维液相条件为：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC^TMBEH Amide亲和色谱柱，流动相A为含10mM甲酸氨的40％乙腈水溶液，B为含10mM甲酸氨的95％乙腈水溶液；梯度洗脱条件为：0～5min为100％B相，5～200min线性变化至0％B相，保持10min，210～210.01min升至100％B相并保持39.99min；流速0.01mL/min，柱温30℃，进样量20μL。

第二维液相条件为：色谱柱为Agi lent C₁₈反向色谱柱，流动相A为0.1％甲酸水溶液，B为乙腈；其液相分析条件分为三个阶段，第一阶段为0-75min，梯度洗脱条件为：初始流动相为80％A相，0～1.5min为30％A相，1.5～1.51min升至80％A相并保持0.49min；流速0.7mL/min，柱温60℃；第二阶段为75-165min，梯度洗脱条件为：初始流动相为95％A相，0～1.5min为60％A相，1.5～1.51min升至95％A相并保持0.49min；流速0.7mL/min，柱温60℃；第三阶段为165-200min，梯度洗脱条件为：初始流动相为99％A相，0～1.5min为90％A相，1.5～1.51min升至99％A相并保持0.49min；流速0.7mL/min，柱温60℃；柱后流出液经分流后进入质谱检测。

每隔2分钟进行一次阀切换，阀切换流程：经第一维亲和色谱柱分离后与流动相共流出的代谢物直接流入十通阀的20微升定量环中，随后在2分钟后经十通阀切换，被第二维液相色谱的流动相冲入第二维反相色谱柱进行分离，色谱流出物通过分流后进入质谱进行检测。于此同时，在第二维液相色谱进行分析时，第一维在2分钟后共流出的代谢物进行十通阀的另一个20微升定量环中，随后在下一个2分钟后经十通阀切换，被第二维液相色谱的流动相冲入第二维反相色谱柱进行分离。通过这种每隔2分钟切换一次十通阀流路的方法，达到将第一维共流出的代谢物不停注入十通阀上的两个定量环中，从而在每隔2分钟的阀切换中依次进入第二维液相色谱进行反向色谱分析的目的。

质谱条件为：采用电喷雾离子源正离子模式检测；脱溶剂气为高纯氮气，流量气为600L/h；脱溶剂气温度均为300℃；毛细管电压和裂解电压分别为3500V和130V，雾化器压力为25psi；质量扫描范围为80～1200m/z；每0.97秒采集一次数据以获得全二维代谢轮廓谱。

3、可视数据转换

由于安捷伦Masshunter采集软件采集得到的数据不能直观体现全二维代谢轮廓谱的分离情况，因此数据需经GC Image LCxLC Edition Software软件转化为直观可视的二维图像(图2-5)。

本发明是基于全二维超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术建立的高温高速检测非转基因大豆、转基因大豆、茶叶以及银杏叶全二维代谢轮廓谱的方法，本方法重复性好，稳定性高，具有高灵敏度、高分辨率、高通量以及高峰容量的特点。同时，本发明公开的检测试剂盒，是一种对非转基因大豆、转基因大豆等多种生物类样品中的代谢物进行全二维代谢轮廓谱分析的新技术。从图3和4中可以看出，非转基因大豆与转基因大豆的全二维代谢轮廓谱具有显著性差异。说明本发明在研究转基因大豆方法具有一定潜力。