本发明属于生物化学技术领域，涉及一种饲料药物添加剂汇诺肽及其各种制品的含量检验方法，具体涉及汇诺肽各种制品生物效价含量的高效液相色谱(HPLC)检测方法。
背景技术：
汇诺肽是一种多肽类的化合物，最早由浙江汇能生物股份有限公司以那西肽为原料，通过一定化学反应得到，CAS号为1887057-00-2。该物质对革兰氏阳性菌有较强效果，对革兰氏阴性菌有一定的效果，抗球虫效果较好，并具有一定抗病毒效果，适用范围广，安全性高，可广泛用于经济动物的饲养中。
纯品汇诺肽是一种黄褐色粉末，属脂溶性物质，其分子量为1153，分子式为C48H39N11O12S6，分子结构参见下式。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术存在的上述问题，采用快速直观的HPLC测定方法，通过特殊处理，将汇诺肽制品含量结果能直接表达为生物效价含量。
本发明包括如下内容：
汇诺肽制品生物效价含量的高效液相色谱(HPLC)检测方法，包括待测样品的预处理，指定的色谱条件，测定图谱的处理分析等：
(1)用对汇诺肽有相当脂溶性的有机溶剂和缓冲液的混合溶液对其制剂进行提取，以便能完全提取汇诺肽，从而获得HPLC测定所需的待测液；
(2)指定的色谱条件为：带紫外可见分光检测器的高效液相色谱仪，乙腈：水相＝50：50的流动相；0.5mL/min～2.0mL/mim的流速；反相碳十八大分子填充柱；230nm-250nm的检测波长；
(3)将测定图谱的各个副峰的面积以面积折算系数(K)对其折算后，再用处理主峰的方法处理结果，该面积折算系数(K)为：1/2～3/4；
(4)将HPLC测定结果通过含量矫正系数(P)的平均值换算获得生物效价含量，含量矫正系数(P)为0.970～1.050。
本发明所述的提取用的混合溶液中的有机溶剂是指N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide DMF)，缓冲液是指磷酸-磷酸盐缓冲液。
以上(2)的所述水相为≤0.50％重量百分比的磷酸水溶液。
本发明的有益效果为：
1.本发明提供了采用有机溶剂与缓冲液的混合溶液高效提取汇诺肽，以获得待测样提取液的预处理方法。该处理液可用于汇诺肽制品含量测定或用于其它非测定目的。
2.本发明提供了在指定的HPLC条件下测定汇诺肽制品主成分及相关其它成分含量的方法，该方法快速实用、干扰少、测定结果重复性好，是一个有效可靠的新颖测定方法。
3.本发明用HPLC测定结果在处理后可直接代表汇诺肽制品生物效价含量的方法，以及在对测定结果进行处理时采用有效而可靠的计算方法。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
本发明涉及的汇诺肽样品由浙江汇能生物股份有限公司提供，其他所涉及的实验用试剂均采购于浙江医药试剂股份有限公司。
以本发明涉及的检测仪器、条件、方法步骤如下：
①、检验设备条件：
高效液相色谱仪(带紫外可见分光检测器)
流动相：乙氰：水相(≤0.50％重量百分比的磷酸水溶液)＝50：50；
流速：0.5mL/min-2.0mL/mim。
检测柱：反相碳十八大分子填充柱。
检测波长：230nm-250nm。
②、供试液预处理：
标准贮备液：
精密称定已知汇诺肽制品含量(或已知相当的生物效价的)的标准品于适宜的容量瓶中，加入20mL的DMF液超声至彻底溶解，用DMF液稀释到容量瓶满刻度，将其制备成1000ppm的贮备液。避光低温保存，其有效期为三个月。
标准供试液：
上述标准贮备液恢复至室温后，准确移取预先计算所需的体积数，并置于适宜的容量瓶中，加入10mL的DMF，混均匀后用甲醇液稀释到容量瓶满刻度，将其制备成50ppm的供试液，或配制成稀释系列液。
用微过滤膜滤过，以备HPLC检验测定用。该液应临用时配制，并尽可能避光。
待检样供试液：
精密称定预先计算制备50ppm浓度所需要的待检样品的相当质量，置于适宜体积的容量瓶中，加入40mL的DMF液，及10mL的磷酸磷酸盐缓冲液，将样品充分润湿。室温下用超声或用振摇法提取，完成后用DMF液稀释到容量瓶满刻度，而将其制备成约50ppm的待检样供试液。用微过滤膜滤过，供HPLC检验测定用。该液应临用时配制，并尽可能避光。为保证置信度，同一批号样应进行三个或以上的同等处理平行样。
③、样品HPLC测定：
打开HPLC仪器，按照本发明①指定的检验条件进行设定，预运行仪器以获得平稳的基线。用微量注射进样器对标准供试液和待检样供试液操作进样，每个样液每次进样20μL，以获得相应的色谱谱图。
④、测定结果的计算方法：
以峰面积外标工作曲线法或以单点峰面积外标法进行处理计算。
⑤、不同时间出峰组分在测定结果计算中的处理原则：
在处理主峰汇诺肽峰时，可直接用标准汇诺肽峰的峰面积外标法(工作曲线法或以单点计算法)进行比对计算，以求得待检样中汇诺肽的含量。
⑥、在得到汇诺肽的HPLC结果后，可以直接采用含量矫正系数(P)来计算得出其生物效价含量表达值。
对本发明方案的可行性分析如下：
1、待检样供试液对样品中待测定成分的代表性研究：
本发明中使用的用混合液高效提取处理待测样的方法是通过以下研究获得的。
研究理论表明：不论采用什么方法进行含量测定，样品的前处理是十分重要的，要求是前处理获得的待检样供试液必须能稳定地代表样品的待测成分的真实含量值。即处理液的回收率较大(≥95％)且能保持一定的稳定性(RSD，CV≤2％)时，该方法才会是一个可靠的定量检验方法。
由于汇诺肽的大分子结构决定了其对提取条件有相当的敏感性，影响汇诺肽高效稳定地被提取的因素有很多，如温度、时间、pH、溶剂类型等，均会对其溶出度或者在溶出后的稳定性产生影响。前处理过程或条件控制得不好，极易造成提取不完全或形成降解。我们用不同实际含量的预混剂，按不同条件进行提取比较操作，并进行统计分析。通过影响因素的效率统计研究表明：前处理条件的不同会导致完全不同的提取液浓度情况，从而导致最终的检测结果不同。只有使用了适宜的处理条件，才能获得较高的回收值。
实验证明：
①、采用有机溶剂和缓冲溶液的混合溶液进行处理，才能达到有效率地提取。
②、不同的有机溶剂对脂溶性汇诺肽进行提取的效果不同。
③、采用合适的有机溶剂(DMF)与适宜的缓冲液混合提取汇诺肽，才可以获得最高的提取值和最稳定的提取效率。
数据研究表明：该提取方法获得的待检样供试液的平均回收率值达到102.6％，满足90％-110％的方法要求；此平均回收率的CV(％)为0.6％，明显小于2％的方法理论规定。
2、本发明测试方法可靠性研究：
本发明中使用的方法条件组合是通过以下研究获得的。
方法研究理论表明：检测方法的可行性和可靠性是决定检测结果的关键。因此需要对其进行科学的评价，下面通过方法精密度、准确度、线性范围对液相色谱测定方法进行验证：
①、精密度：
方法精密度是指分析结果的重复性或重现性。对于一个实用的定量方法，其重复性的精密度(既变异系数CV％，RSD％)必须控制在尽可能小的范围内，考虑到方法本身和操作因素外精密度大小还与待测物浓度有关，而一般指标是若浓度在≥100mg/kg时，我们用理论含量为0.5％的某批号制剂样品进行平行性实验，共检测40个平行样。测试研究数据证明表明在本发明条件下检测获得的样品测试结果的CV(％)＝0.539％，明显小于5％的要求，说明该方法的重复测试精密度完全达到方法理论规定。
②、准确度：
方法的准确度是指测定值与真实值的接近程度，通常采用添加回收率来表示。作为一个可用的定量方法，回收率一般应在80％～110％的范围内。而作为一个高效的定量方法，回收率应在控制在95％～105％的范围内，且其回收率的精密度应保持在2％以下。
通过对同一浓度样品的多次重复测试及对不同真实浓度的测试数据研究表明，本方法在汇诺肽浓度从0.1％到96.0％范围内，其样品平行测定结果精密度最差为0.30％，满足≤2％的要求；不同浓度的制剂回收率保持在102％-104％的范围内，而各个浓度的回收率精密度最差为1.24％，满足方法理论规定。
③、线性范围：
方法的线性范围表示了该方法可以应用样品测试的广泛性，在此线性范围内的样品使用本方法进行测试，有线性保障。一个有效的定量分析方法的有效线性范围，应至少保证5个浓度的统计线性相关系数r≥0.995，并且应保证不同浓度回收率的精密度RSD≤5％。
通过对汇诺肽浓度从0.1％到96.0％的范围内近15个不同真实浓度的汇诺肽样品的测试数据研究表明，回收率及回收率CV保持符合方法规定要求外，其线性相关系数r＝0.999984％，满足方法理论规定。因此认为本方法在此范围内的汇诺肽制品生物效价含量的测定均适用。
3、汇诺肽HPLC含量与生物效价含量的转换：
本发明中汇诺肽的生物效价含量用HPLC含量来转换表达的方法是通过以下研究获得的。
由于生物效价能更为准确地反映抗菌素的综合效果，抗生素的测定结果一般要求用生物效价含量来表达，含硫多肽类抗生素汇诺肽的最终结果可以用生物检定法测得其生物效价含量。
汇诺肽的HPLC测定结果表达了制剂中汇诺肽和其它成分的质量百分率。由于汇诺肽制剂抗菌效果是由制剂中汇诺肽和其它组分表达出来的能力，当制剂中汇诺肽百分率增高时，其抗菌效果会增强，同时，其它组分百分率增高也会部分地增强其抗菌效果。
如果这重百分含量与其生物效价含量间存在固定的关联性，即两者的比值保持固定值，则可以通过HPLC的结果直接换算成其生物效价含量。这种关联可以通过考察两者的比值是否保持为一个相对固定的系数，并且此系数有高精密度而加以证明。
通过对不同浓度样品的两种测试方法的结果研究表明，此比值P(含量矫正系数)确实存在。当制剂浓度在0.1％-96.0％的范围内变化时，研究结果表明含量矫正系数(P)波动很小，且含量矫正系数(P)的离散系数CV为0.954％，明显小于5％的方法理论要求，这说明汇诺肽生物效价含量可以直接用HPLC测定结果通过含量矫正系数(P)的平均值换算获得。一般含量矫正系数(P)保持0.970-1.050的范围内。
本发明采用快速直观的HPLC测定方法，通过特殊处理，将汇诺肽制品含量结果能直接表达为生物效价含量，这就大大地缩短了时间，减轻了劳动强度，减少了实验材料的消耗，因此有较大的实用性和经济价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。