用montanide乳化三表位肽的方法以及执行该方法的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于制备在抗癌免疫疗法中使用的施用于人受试者的疫苗制剂的方法，该疫苗制剂具有包含三个表位的优化多肽和作为佐剂的Montanide。
【专利说明】用MONTAN IDE乳化三表位肽的方法以及执行该方法的试剂盒
[0001] 本发明涉及抗癌疫苗领域。更具体地说，本发明涉及一种用于制备在抗癌免疫疗 法中使用的疫苗制剂的方法，该疫苗制剂具有优化的多肽(包含三个表位）和作为佐剂的 Montanide。
[0002] TO2007073768(A1)公开了具有序列 Vx006(YLQVNSLQTVYLEYRQVPVYLEEITGYL，SEQ ID NO: 1)的多肽，其包含三个通用肿瘤抗原衍生的优化隐蔽性肽(TERT988Y、MAGE-A248V!^ HER-2/neU4Q2Y)。与三种肽的简单混合物不同，并且与包含相同表位但顺序不同的其它多肽 不同，SEQ ID NO: 1的多肽引发针对由肿瘤细胞表达的天然表位TERT988、HER-2/neu4〇2、 MAGE-A248G9和MAGE-A248D9的多特异性CTL应答。由于几乎100 %的肿瘤表达三种抗原中的至 少一种，从而Vx006成为用于抗癌免疫疗法的出色候选物。
[0003] 免疫佐剂是被添加至疫苗制剂以提高其功效的物质。佐剂可以提高由疫苗接种而 诱导的免疫应答的强度和持续时间。IFA(不完全弗氏佐剂)是在研究中最常用的佐剂之一。 它是从不可代谢油制备。具有IFA的疫苗制剂是油包水(W/0)乳液。IFA通过在注射部位形成 储库和刺激产生浆细胞的抗体来诱导免疫应答。然而，不良反应，包括在许多情况下需要手 术介入的无菌性脓肿和一些临床前的发现表明，IFA是使实验室动物致癌的，其妨碍了 IFA 佐剂疫苗的进一步临床开发。于是，具有改进的规格和质量控制步骤的IFA型解毒佐剂变得 可用。例如，基于矿物油的Montanide? ISA 51和基于角藍稀的Montanide? ISA 7 2 0 (SEPPIC，France)乳液目前正处于针对癌症、疟疾和HIV的疫苗研究的临床研发中。但是，因 为W/0型乳液存留在注射部位，在该注射部位其倾向于引起局部反应，这些W/0乳液佐剂的 应用可能仍限于人类的治疗性疫苗和癌症疫苗领域。针对非小细胞肺癌的疫苗，使用 Montanide? ISA51VG的CIMAVax?EGF疫苗，正在进行三期研究，并已经至少在古巴获得 许可。
[0004] Montanide_?ISA 51是高度纯化的矿物油(Drakeol 6VR)和表面活性剂（二缩甘 露醇单油酸酯）的混合物。在2006年，出于对朊病毒污染的顾虑，Montanide?lSA 51的制 剂从使用由牛油中分离的油酸改变为使用由橄榄分离的油酸(Montanide? ISA 51VG)。
[0005] 用于执行油包水(W/0)乳化的疫苗的方法可通过多种程序使用不同装置如高剪切 混合器、旋涡、注射器或注射器和连接器(T-或I-连接器)来获得。用于获得乳液的方法就疫 苗的物理-化学参数和疫苗接种功效而言不是所有都为相同的。
[0006] 传统上，为了获得用Montanide?lSA 51乳化的肽，使用由连接器(I或T-连接器） 连接的两个无硅酮注射器以带来高剪切从而使水滴被捕获在周围油相中。通常情况下，肽 溶解在生理盐水溶液中（最通常为roS或0.9 % NaCl盐水缓冲液），一体积的该溶液与一体积 的_祕0扯&沮(16? I SA 51混合。然后将混合物装载至由例如通过I -连接器连接的两个无娃酮 注射器组成的装置中，其用于执行20个低速循环（即循环持续大约4秒）的预乳化步骤，随后 执行40个快速循环的乳化步骤。如下定义循环:使整个溶液(水相和佐剂)从第一个注射器 转移至另一个，随后使整个溶液转移返回其初始注射器。近来，Ascarateil和Koziol报告了 通过优化的用于自动W/0乳液过程的新设备获得的结果(Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2013)。在专利申请EP 2 322 132 A1中公开的这种装置是自动封闭系统，其允许控 制乳化过程。
[0007] 本发明人试图通过上述的通常程序用Montanide?[SA 51和包含SEQ ID N0:l的 多肽的水相获得W/0乳液。当这样做时，发明人遇到了一些不明原因的困难，如以下实验部 分示出的。由于用于用肽溶液和Montanide?获得乳液的标准程序失败了，发明人在乳化 过程中尝试了多个参数，但没有成功。最后，发明人令人惊讶地发现，仅当满足下列两个条 件时，Montanide?ISA 51VG才能够乳化SEQ No: 1的多肽：
[0008] -SEQ No: 1的多肽必须溶解在纯水而不是盐溶液中；和
[0009] -预乳化步骤必须包括至少2个非常慢的循环，每个循环持续至少6秒。
[0010] 因此，本发明涉及一种用于获得油包水乳液的方法，所述油包水乳液用于向人受 试者施用序列YLQVNSLQTVYLEYRQVPVYLEEITGYL(SEQ ID No: 1)的多肽，所述方法包括以下 步骤：
[0011] (i)通过使冻干的SEQ No: 1的多肽溶解于纯水(注射用水）中来获得抗原水相；
[0012] (ii)将一体积的所述抗原水相和一体积的Mcmtanide?lSA 51装载至包括由连 接器连接的两个注射器的装置中；
[0013] (iii)通过执行使整个制剂从一个注射器转移到另一个并且然后再返回第一注射 器的至少三个循环使制剂预乳化，其中每个循环持续至少6秒;和
[0014] (iv)通过执行至少15个附加的转移循环使制剂乳化，其中每个循环持续至多2秒。
[0015] 在本文中，"Montanide?lSA 51"表示目前市售的Montanide?lSA 51VG，以及 由其衍生的任何生物等效佐剂(例如，由从另一个来源分离的油酸或合成的油酸替换由橄 榄分尚的油酸）。
[0016] 还应该注意，在步骤(ii)中，水和油相的50/50比例可以变化。事实上，佐剂可以占 整个溶液的至多60 %。因此，除非另有规定，短语"使一体积的含水相与一体积的 Montanide? ISA 51混合"意味着"以包括50/50至40/60的W/0比例混合含水相和 Montanide?ISA 51"。
[0017] 重要的是，用于执行上述过程的注射器必须适合MontanMe⑩，即其必须是无硅 和无橡胶的（即柱塞不含任何橡胶头），并且还优选不含胶乳。可用于执行本发明的注射器 的实例是：
[0018] -OR 2mllnjekt?(编号：4606701V，来自B-Braun,德国），
[0019] -OR 5mllnjekt?(编号：4606710V，来自B-Braun，德国），
[0020] -OR 2ml Norm-Ject(编号：4020.000V0,来自Henke Sass Wolf GMBH,德国），
[0021] -OR 5ml Norm-Ject(编号：4050.000V0,来自Henke Sass Wolf GMBH,德国）。
[0022] 在根据本发明的方法中，通过用纯无菌水水合SEQ No: 1的多肽冻干糕并等待直至 溶解完成来执行步骤(i)。当该步骤在10至40°C的温度下执行时，几秒至2分钟是必要的，以 获得冻干糕的完全溶解；如果需要，可以通过用两个手指拿取小瓶施加一至几秒的温和振 荡。也可以在更低温度下例如在冰箱中（1-4°C)执行该溶解步骤。
[0023]根据一个具体的实施方案，执行步骤（i)以获得0.5-6ml，优选约lml或5ml体积的 抗原水相。
[0024]根据一个具体的实施方案，执行步骤（i)以使得SEQ No: 1的肽在抗原水相中的最 终浓度为2至20mg/ml，优选2至10mg/ml。
[0025] 在一个具体的实施方案中，通过使一体积的抗原水相装载至第一注射器并且使至 少一体积的MfmtanMe(g)iSA 51装载至第二注射器，然后通过连接器桥接两个注射器来执 行步骤(ii)，以使得最终的水相/Montanide?ISA 51的比例被包含在50/50至40/60之间。 从小瓶转移液体的最简单的方法是使用注射器和针头。但是，这种方法有刺破的风险。另一 个更安全的解决方案是使用小瓶适配器，如来自West Pharmaceutical Services, Inc或 Promepla(Monaco)的13mm或20mm的小瓶适配器。例如，可以按照如下描述的程序来执行步 骤(ii):
[0026] ?在通过泡罩包装处理小瓶适配器时，从小瓶适配器包装中移除盖；
[0027] ?将适配器连接至小瓶;使用泡罩包装来处理适配器。通过向下按压使适配器装 到小瓶上，直至尖钉穿透弹性塞和适配器卡好。移除并丢弃泡罩包装；
[0028] ?扭动适配器上的注射器上；
[0029] ?抽取1体积(通常是lml)的无菌Montanide?ISA 51VG至注射器，1中并去除空 气。使注射器保持塞在小瓶上；
[0030] ?用新的小瓶适配器和第二注射器重复相同的操作以从小瓶抽取一体积的抗原 水溶液至注射器?^° 2中；
[0031] ?从适配器上移除注射器N° 2,并将其连接到连接器；
[0032] ?非常缓慢地推动柱塞，以从系统排出最多空气(此步骤也可以用注射器N°1而不 是注射器，2来执行）；
[0033] ?从适配器上移除注射器N° 1，并将其扭到连接器上；以使该系统为乳化做好准 备。
[0034] 根据一个优选的实施方案中，在步骤（? )中使用的连接器是I-连接器。这种连接 器的非限制性实例是：
[0035] -由Green Peptide(Japan)开发的用于专利申请ΕΡ 2 322 132 Α1中公开的乳化 的I-连接器，
[0036] -来自 Didanorm(France)的编号 DIDRACDLLFT 的连接器，
[0037] -来自 Promep la (Monaco)的 I-连接器（编号：0DG0015ST)，和
[0038]-来自Smiths medical(US)的I-连接器(编号:MX494)，其是具有0.2ml的近似填充 量和近似5cm的总长度的非DEHP制成的、无乳胶、耐脂质的非PVC连接器。
[0039]如已经提到的，所要求保护的方法的预乳化步骤(步骤（iii))包括至少两个慢循 环，其中每个循环对应于整个制剂(抗原相加佐剂)从一个注射器到另一个注射器并且然后 返回第一注射器的转移，并且持续至少6秒;在一个优选的实施方案中，该步骤包括3个至20 个循环，例如3、4、5、6、7、8、9、10或20个循环。这些慢循环的每一个优选持续6至30秒，更优 选8至15秒和甚至更优选8至12秒，例如8、9、10、11或12秒。值得注意的是，当如上所述执行 慢循环时，5个慢循环对于预乳液步骤是足够的，这与包括20个慢循环的通常程序相反。因 此，至少当手动执行预乳化步骤时，步骤（? )的循环个数优选为3至8,优选4至6,甚至更优 选5。
[0040] 本发明人已观察到，一旦正确地执行预乳化，经典的乳化步骤产生令人满意的乳 液，即使执行不超过15-20个快速转移循环。当然，可以执行增加数量的快速循环，例如至少 20个循环、至少30个循环、至少40个循环和至多60个循环，甚至更多。在前述叙述中，"快 (rapid)"或"快速(fast)"循环持续0.5至2秒、至多2秒、优选小于1.5秒、更优选小于1秒、甚 至更优选小于〇. 7秒(尽可能快）。
[0041 ] 本发明还涉及一种用于获得含有SEQ ID N〇:l的Vx006多肽和:Monmnide?ISA 51的油包水乳液的试剂盒，其中所述试剂盒包含至少lmg(例如2mg或10mg)的SEQ ID No: 1 的冻干多肽，至少lml的Montanide?lSA 51(例如3ml的Montanide?lSA 51)，两个无娃 和无橡胶的注射器，I-连接器和描述根据前述权利要求任一项所述的方法的通告。任选地， 该试剂盒还可以包括一瓶注射用水和/或小瓶适配器。还可以包括在获得所述乳液后用于 接种患者的无菌针头。试剂盒中的注射器可以是，例如2ml和5ml的注射器。任选地，冻干的 Vx006多肽可以用Vx006的无菌水溶液来代替。
[0042] 本发明的另一个方面是含有SEQ ID N〇:l的多肽和Montanide?ISA 51的油包水 乳液，其中在所述乳液中的肽浓度范围为1至1 〇mg/ml。
[0043] 乳液可以通过包括DvX的不同参数来进行表征，其中X为0至100,并且其是X%体积 的样品的最大粒径(直径）。例如，Dv50是存在50%样品体积低于该粒径的最大粒径，以及 Dv90是存在90%样品体积低于该粒径的最大粒径。在根据本发明的乳液的一个优选实施方 案，Dv50为低于3μηι，优选低于2μηι，且更优选约1 · 2μηι。对于这样的乳液，DV90通常低于5μηι， 优选低于3μηι，更优选低于2μηι。
[0044] 通过下面的图和实施例来进一步说明本发明。
[0045] 附图简述
[0046] 图1:溶液中的Vx006。A:在注射用水中；Β:在PBS缓冲液中；C:在0.9 % NaCl盐水缓 冲液中。 实施例
[0047] 使用下列材料和方法执行实施例：
[0048] 肽：肽通过BACHEM(Basel，Switzerland)合成。Vx006(SEQ ID No: 1)在冻干前已在 铵溶液中制备。
[0049] ⑩ ISA51VG 由 SEPPIC(Castres，France)提供， 批号 T 134201。
[0050] Micelle kun和乳化设备：在SEPPIC(Castres,France)使用Micelle kun的样机 (在EP 2 322 132 A1中描述的）。2 ml的无硅酮注射器由BBraun生产和销售（编号 4606701V)。〗-连接器由didactic GROUP(Etainhus,France)生产和销售（编号RACDLLFTF)。 [0051 ] 乳液表征:为了表征乳液，通常使用两个测试;液滴试验和测量液滴尺寸。
[0052] 液滴试验:液滴试验允许检测乳液类型:W/0(水相液滴在油性基质中）或0/W(油 (佐剂)液滴在水相中）。在具有清水的烧杯中，在水的表面上铺放1滴乳液并且轻轻混匀。 [0053] 如果乳液液滴停留在表面上，则其是W/0乳液。
[0054]如果乳液分散于水中，则其是0/W乳液。
[0055]液滴尺寸：在分散相中的液滴尺寸通过激光散射粒度计来检测。乳液粒径用 Malvern的Mastersizer S来测量。
[0056] 平均粒径通过以下表示：
[0057] -Dv 50是指：50%的颗粒的体积的尺寸比Dv50小，
[0058] -Dv 90是指:90%的颗粒的体积的尺寸比Dv90小。
[0059]实施例1:使用SEPPIC推荐的程序乳化安慰剂
[0060] 乳化M〇IltailMe?ISA 51VG需要盐水相。已知使用盐水缓冲液（如ros和0 · 9%的 NaCl)允许产生比纯水更稀的乳液。为了举例说明这一点，发明人比较了由五个独立的操作 者制备用Mk)ntanide?ISA 51VG与纯水或0.9%的NaCl盐水溶液制备的乳液。将0.7ml的安 慰剂溶液装入无硅酮注射器并将〇.7ml的Monatnide?iSA 51VG装入第二注射器。在将两 个注射器连接到I-连接器后，应用经典程序，即20个慢循环，随后40个快循环。在分散相中 的液滴尺寸通过激光散射粒度计来检测。乳液粒径用Malvern的Mastersizer S来测量。 [0061 ] 表1表明，采用0.9%NaCl的Dv50和DV90显著低于采用水的Dv50和DV90。所测量的 具有Montanide?的〇.9%NaCl的乳液的Dv50和DV90平均为0.5和Ι.?μπι，与之相比，采用水 的乳液的Dv50和DV90分别为0.8和1.7μπι。更重要的是，用0.9 %NaCl盐水缓冲液执行的乳液 要比用无菌水的乳液稳定的多，因为在4°C下24小时之后，所测量的具有斷)1他1他6_?的 0.9%NaCl的乳液的Dv50和DV90平均分别为1.1和1.5μπι，与之相比，采用水的乳液的Dv50和 DV90分别为3.6和8.3μπι。这些结果是根据SEPP] C，Montanide?ISA51VG生产者的建议。
[0062]
[0063]表1:用ISA51VG和纯水或0.9 %的氯化钠盐水缓冲液执行的乳液的表征(ND:未完 成）
[0064] 实施例2:Vx006溶解
[0065] Vx006通过 BACHEM(Basel, Switzerland)制备。对于临床试验，Vx006 以 GMP 级以含 有10mg冻干的肽的小瓶来生产。
[0066]为了接种疫苗至患者，添加 lml溶剂至冻干糕上以使肽再悬浮，然后将0.7ml在溶 液中的肽装入无硅酮注射器并且将0.7ml的M:Gmtanide?ISA51VG装入第二注射器中。然后 将两个注射器连接至I-连接器用于乳化程序。
[0067]在实践中，使肽溶解可能是相当大的挑战，虽然存在以下化学规则来预测肽的溶 解度(公开在例如S i gma-A 1 dr i cht的网站）：
[0068] 1.短于5个残基的肽通常可溶于水介质，除了其中所有的残基均是非常疏水的(W， I，L，F，M，V或Y)极端情况下。
[0069] 2.含有>25%的带电残基(E，D，K，R和H)和〈25%的疏水残基的亲水肽通常也溶于 水介质中，条件是该带电残基在整个序列中均匀分布。肽通常用〇. 1%的TFA/水和0.1%的 TFA/ACN溶剂系统进行纯化。因此，如果该肽溶于未缓冲或没有充分缓冲的水溶液，所得的 肽溶液可以是酸性的。在尝试其他溶解方式之前，该溶液的pH值必须接近中性。酸性肽(E+D 残基〉K+R+H残基)和碱性肽(R+K+H残基〉E+D残基)二者都是在中性pH比在酸性pH下更可溶。
[0070] 3.含有50 %至75 %的疏水残基的疏水肽可能是不溶于或仅部分溶于水溶液，即使 该序列含有25%的带电残基。最好是将这些肽首先溶于最少量的更强溶剂中，如DMF、乙腈、 异丙醇、乙醇、乙酸、4-8M的GdnHCl或脲，DMS0(如果序列不含C、W或M)和其他类似的有机溶 剂，然后缓慢添加(滴加)该溶液至搅拌的缓冲水溶液。如果所得到的肽溶液开始显示混浊， 则可能已经达到溶解度极限，继续进行将是徒劳的。
[0071] 4.含有>75 %的疏水残基的非常疏水的肽一般不溶于水溶液。这些肽通常需要初 始溶解于非常强的溶剂如TFA和甲酸，并且当加入缓冲水溶液中时可能沉淀。最终的肽溶液 可能需要更高浓度的有机溶剂或变性剂，这可能不适用于涉及活细胞的生物学研究。
[0072] 5.含有非常高(>75%)的比例的S，T，E，D，K，R，H，N，Q或Y的肽序列能够形成广泛的 分子间氢键网络并且具有在浓缩的水溶液中形成凝胶的倾向。这些肽可能必须以与步骤#3 类似的方式进行处理。
[0073] 由于SEQ ID No:l的Vx006肽包含15个疏水残基(50至75%之间），4个带电残基（〈 25%)和16个上述第5点中所列出的残基（〈75%)，其理论上需要如上述第3点中所述的处 理，但是可能是在水中部分溶解的。
[0074]根据SEPPIC的建议，该乳液施用于人类的事实（避免使用溶剂如DMS0等），上述实 施例1中呈现的结果以及溶解度预测，VX006最初用盐水缓冲液稀释。测试了两个盐水溶剂， 0.9%的氯化钠和PBS。在这两种情况下，肽在溶液中都是浑浊的，溶解不完全。更重要的且 令人惊讶地，几分钟后，该溶液变得粘稠，最后形成凝胶，阻止了肽与Montanide的任何乳 化。此外，在Vx006制造开发过程中测试了添加由Seppic开发的，并且与人类注射相容的以 及与Montanide乳液相容的几种溶剂。这些溶剂都对Vx006的溶解没有任何影响。
[0075] 在一系列不成功的尝试后，发明人发现，该肽可完美地溶于注射用水中，并且所获 得的溶解的肽的pH与人体注射(pH约7)相容。因此，用少量（1至5ml)纯水使冻干糕水合，置 于室温（15-25Γ)，直至完全溶解（10秒至几分钟）。如果需要的话，小瓶可以轻轻搅拌以加 速溶解。也可以在低温(〇-l〇°C)下进行溶解。肽在溶液中是完全澄清的，没有观察到凝胶的 形成（图1)。
[0076] 实施例3: Vx006在 Montanide 中乳化
[0077] 然后用M〇:ntanide?ISA51VG乳化10mg/ml浓度的Vx006在纯水中的溶液。首先，将 0.7ml的肽溶液装入无硅酮注射器，并将0.7ml的Monatoide? ISA51VG装入第二注射器。在 将两个注射器连接至I-连接器后，应用SEPPIC建议的通常程序，即20个慢循环(4秒），随后 40个快循环。四个经训练用于执行乳化的操作者应用相同程序。
[0078] 然后进行液滴试验，以评估乳液。如表2所示，在大约25%的乳化中，乳液为水包油 (0/W)乳液，而不是油包水乳液(W/0)。此外，即使将肽稀释5倍(终浓度为2mg/ml)，结果仍然 是相同的，表明肽的乳化能力不是因为肽的浓度，而是因为Vx006肽的固有特性。这种可变 性在临床试验中是不可以接受的，因为水包油乳液起不到辅助接种的作用。然后
【发明人】修 改了几个参数以界定用于乳化Vx006的稳健性程序。
[0079]
[0080] 表2:用经典程序使Vx006在Montanide ISA 51中乳化。
[0081] 为了避免操作者的偏差，下面的实验使用"Micelle kun"进行，其是设想为执行可 控的乳化过程的自动装置(EP 2 322 132 A1)。该设备的样机是由SEPPIC提供。测试了三个 慢循环速度，对应于12秒为一个循环，"5"对应于6秒为一个循环，"10"为每个循环4s。然 后应用20个慢循环和40个快循环（"Micelle kun"以每个循环0.7秒的恒定速度进行快循 环）。最后，测试了两个肽浓度l〇mg/ml和2mg/ml。表3中的结果表明，"Micelle kun"总是能 在速度"〇"和"5"而不是"10"产生W/0乳液，表明在预乳化步骤施加非常慢的循环的重要性。 值得注意的是，"Micelle kun"的供应商最初设想生产具有独特"低"的速度的"Micelle kun"，但是SEPPIC要求"低"的速度可以变化，并且达到了长达12秒的循环，以确保其可用于 乳化所有的肽，包括特定肽如Vx006。事实上，来自SEPPIC的专家从未用于对预乳化步骤的 参数如SEQ ID No: 1的肽一样敏感的任何肽。
[0082]
[0083] 表3:使用Micelle kun用各种慢循环速度使Vx006在M〇lltanide?ISA 51中乳化。
[0084] 为了简化医院中疫苗的制备，本发明人决心测定获得W/0乳液所必须的最少的慢 循环次数。使用"Micelle kun"，慢循环次数减少。用"Micelle kun"允许每次获得Vx006和 M:ontaiiMe?iSA 51VG的W/0乳液的程序是:5个非常慢速度的循环(速度为"〇"），随后40个 高速(表4)循环。应注意，当这些循环以非常低的速度手动进行时(每个循环至少10-15秒）， 只有3个慢循环可能是足够的。
[0085]
[0086] 表4:测定慢循环的最小次数
[0087]最后，为了测试所定义的程序的稳健性，三个操作者应用5个非常慢的循环和40个 快循环。表5示出100 %的乳液为W/0型，是稀的且在24小时内是稳定的。有趣的是，具有 Vx006的乳液比那些没有肽的更稳定(比较以下表5中的数据和表1数据）。
[0088]
[0089] 表5:程序5+40的稳健性，手动执行
[0090] 参考文献：
[0091] Ascarateil and Koziol:New equipment optimized for emulsified vaccine preparation in the hospital. Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2013 1(Suppl 1):P196.
【主权项】
1. 一种用于获得油包水乳液的方法，所述油包水乳液用于向人受试者施用序列 YLQVNSLQTVYLEYRQVPVYLEEITGYL(SEQ ID No: 1)的多肽，所述方法包括以下步骤： (i) 通过使冻干的SEQ No: 1的多肽溶解于纯的无菌水中来获得抗原水相； (ii) 将一体积的所述抗原水相和一体积的Montanide? ISA 51装载至包括由连接器 连接的两个注射器的装置中； (iii) 通过执行使整个制剂从一个注射器转移到另一个并且然后再返回第一注射器的 至少三个循环使制剂预乳化，其中每个循环持续至少6秒;和 (iv) 通过执行至少20个附加的转移循环使制剂乳化，其中每个循环持续至多2秒。2. 权利要求1所述的方法，其中通过用纯的无菌水在10至40 °C的温度下水合SEQ No : 1 的多肽的冻干糕并等待直至溶解完成来执行步骤(i)。3. 根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中水溶液中的肽浓度为2至20mg/ml。4. 前述权利要求任一项所述的方法，其中通过使一体积的抗原水相装载至第一注射器 并且使一体积的Montanide?ISA 51装载至第二注射器，然后通过连接器桥接两个注射器 来执行步骤(ii)。5. 前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述连接器是I连接器。6. 前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(iii)中，执行3至10个循环。7. 前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(iii)中，每个循环持续6至30秒。8. 前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(iv)中，执行20至40个循环。9. 前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(iv)中，每个循环持续0.5至2秒。10. -种用于获得含有SEQ ID N〇:l的多肽和M〇ntanide?:ISA 51的油包水乳液的试 剂盒，其中所述试剂盒包含至少lmg的SEQ ID No: 1的冻干多肽，至少lml的Mcmtanyte? ISA 51，两个注射器，I-连接器和描述根据前述权利要求任一项所述的方法的通告。11. 权利要求10所述的试剂盒，其中每个注射器是2ml的注射器。12. 权利要求10或权利要求11所述的试剂盒，其还包括一瓶注射用水和/或小瓶适配 器。13. 权利要求10至12中任一项所述的试剂盒，其还包括在获得所述乳液后用于接种患 者的无菌针头。14. 一种油包水乳液，其含有SEQ ID No:l的多肽和M〇ntanid:e?ISA 51，其中所述乳 液中的肽浓度范围为1至1 〇mg/m 1，并且其中所述乳液的Dv 50为小于3μηι。15. 权利要求14所述的油包水乳液，其中所述乳液的Dv 50为小于2μπι。
【文档编号】A61K39/39GK106061499SQ201480068373
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2014年12月18日
【发明人】让娜·梅内-雅梅
【申请人】瓦克松生物技术公司