一种普利卡那肽的制备方法
【专利摘要】本发明涉及多肽药物制备领域，尤其涉及一种普利卡那肽的制备方法。该方法包括：固相合成Fmoc-Leu-树脂；按照普利卡那肽的肽序，在Fmoc-Leu-树脂上依次偶联-Cys15、-Gly、-Thr、-Cys12、-Ala、-Val、-Asn、-Val、-Cys7、-Leu、-Glu、-Cys4、-Glu、-Asp、-Asn，制得普利卡那肽线性肽树脂，经裂解制得普利卡那肽线性粗肽；取普利卡那肽线性粗肽，经第一环化、第二环化，即得。该方法采用tBu或Acm作为半胱氨酸的侧链保护基，并通过两步环化，得到了纯度以及收率都很高、二硫键准确定位的产物，且反应条件温和，利于工业化生产。
【专利说明】一种普利卡那肽的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及多肽药物制备领域，尤其涉及一种普利卡那肽的制备方法。
【背景技术】
[0002]慢性便秘的治疗通常使用较多的是轻泻剂，但是轻泻剂不能有效改善便秘的症状，2008年一项研究显示，虽然16%~40%的便秘患者使用轻泻剂，但症状依然存在，与未使用轻泻剂的患者相比没有显著差别。2007年一项基于网络的调查显示，有47%的患者对轻泻剂不完全满意，其中82%由于疗效不佳，16%由于安全性。因此，现有的治疗还不能满足慢性便秘者的治疗需要。
[0003]目前便秘治疗的非轻泻剂包括:阿片类受体拮抗剂(如溴甲纳曲酮，仅适用于阿片诱导的便秘)、氯离子通道活化剂(如鲁比前列酮)、5_HT4受体激动剂(如普卢卡必利)、鸟苷酸环化酶刺激剂[如linaclotide，正在进行便秘型IBS (IBS-C)的III期临床研究]。但治疗慢性便秘的非轻泻剂仍有待进一步的开发。
[0004]美国Synergy制药公司于2013年I月2日宣布，其在研药物普利卡那肽用于治疗慢性特发性便秘(CIC)具有较好的耐受性，II b/ III期临床试验取得积极结果。
[0005]普利卡那肽，英文名称为Plecanatide，是一种多肽药物，其结构如式I所示:
[0006]
[0007]其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其肽序中N端第4位半胱氨酸(标记为Cys4)与第12位半胱氨酸(标记为Cys12)成环，第7位半胱氨酸(标记为Cys7)与第15位半胱氨酸(标记为Cys15)成环。
[0008]普利卡那肽是一种鸟苷酸环化酶C (GC-C)受体激动剂，其治疗机理与利尿钠肽尿鸟苷素相似，可诱导液体分泌进入胃肠道，从而增加胃肠动力。普利卡那肽为一类新的口服制剂，无需注射就可以直接口服用药，可为众多患者接受。这类制剂模仿利钠肽Uroguanylin的作用，诱导肠液分泌的胃肠道进入管腔。其作为一种可模拟胃肠液体调节肽效应的新药，对成人慢性特发性便秘的客观指标和患者自评转归有效。
[0009]但是，普利卡那肽的制备方法目前在国际上仍属空白，至今尚无适合大规模生产且收率高、杂质含量低的普利卡那肽的制备方法报道。
【发明内容】
[0010]有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种普利卡那肽的制备方法，该方法收率高，且杂质含量低，适合大规模工业化生产。
[0011]本发明提供的普利卡那肽的制备方法包括以下步骤:[0012]步骤1:固相合成Fmoc-Leu-树脂；
[0013]步骤2:按照普利卡那肽的肽序，在Fmoc-Leu-树脂上依次偶联-Cys15、_Gly、_Thr、_Cys12、_Ala、_Val、_Asn、_Val、_Cys7、_Leu、_Glu、_Cys4、_Glu、_Asp、_Asn，制得普利卡那妝线性肽树脂，经裂解制得普利卡那肽线性粗肽；
[0014]步骤3:取普利卡那肽线性粗肽，经第一环化、第二环化，即得。
[0015]作为优选，Cys4和Cys12的侧链保护基为叔丁基，Cys7和Cys15的侧链保护基为乙酰胺甲基；或Cys4和Cys12的侧链保护基为乙酰胺甲基，Cys7和Cys15的侧链保护基为叔丁基。
[0016]优选的，Cys4和Cys12的侧链保护基为叔丁基，Cys7和Cys15的侧链保护基为乙酰胺甲基，第一环化具体为:采用过氧化氢水溶液使普利卡那肽线性粗肽中Cys4和Cys12间形成二硫键，第二环化具体为:采用碘的水溶液或碘的甲醇溶液使普利卡那肽线性粗肽中Cys7和Cys15间形成二硫键。
[0017]优选的，Cys4和Cys12的侧链保护基为乙酰胺甲基，Cys7和Cys15的侧链保护基为叔丁基，第一环化具体为:采用过氧化氢水溶液使普利卡那肽线性粗肽中Cys7和Cys15间形成二硫键，第二环化具体为:采用碘的水溶液或碘的甲醇溶液使普利卡那肽线性粗肽中Cys4和Cys12间形成二硫键。
[0018]现有技术中， 多肽偶联过程中，半胱氨酸常采用Trt作为侧链保护基，但由于Trt的体积较大，造成拥挤，反应位点不易暴露，使得偶联效果下降，最终造成线性肽纯度下降，收率偏低。本发明提供的制备方法在合成线性肽过程中，采用tBu或Acm作为半胱氨酸的侧链保护基，为了能够准确定位环化Cys4和Cys12采用相同的侧链保护剂，而Cys7和Cys15采用相同的侧链保护基。其中，tBu体积较小，能有效的降低空间位阻引发的偶联困难，利于提高收率；而Acm在酸性条件下稳定在裂解时不被脱除，就使得裸露的半胱氨酸在第一环化时能够定位环化。
[0019]优选的，第一环化中，过氧化氢水溶液中，过氧化氢的摩尔-体积浓度为8.8mmol/L ~13.2mmol/L。
[0020]优选的，第一环化中过氧化氢与普利卡那肽线性粗肽的摩尔比为(8~12):1。
[0021]更优选的，第一环化中过氧化氢与普利卡那肽线性粗肽的摩尔比为10:1。
[0022]优选的，第一环化的时间为2h。
[0023]优选的，第二环化中，碘的甲醇溶液中，碘的质量-体积浓度为4.19g/L~8.18g/L0
[0024]更优选的，碘的甲醇溶液pH值为3.0。
[0025]优选的，第二环化中，碘与普利卡那肽线性粗肽的摩尔比为(3~6):1。
[0026]更优选的，第二环化中，碘与普利卡那肽线性粗肽的摩尔比为5:1。
[0027]优选的，第二环化的时间为lh。
[0028]目前，多肽的环化方法多采用一步氧化法，但一步氧化易造成定位不准从而产生过多杂质，不利于纯化分离，收率不高，也不利于工艺的放大。而本发明提供的方法通过两步环化，中间过程无需纯化，就得到了纯度以及收率都很高的、二硫键准确定位的产物，且反应条件温和，利于工业化生产。
[0029]作为优选，偶联中，-Thr采用的侧链保护基为叔丁基，-Asn采用的侧链保护基为三苯甲基，-Glu采用的侧链保护基为叔丁氧基，-Asp采用的侧链保护基为叔丁氧基。
[0030]在本发明的步骤2中，在脱除保护的Fmoc-Leu-树脂上依次偶联Fmoc-Cys (Acm)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr (tBu) -0H> Fmoc-Cys (tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn (Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys (Acm)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-OH、Fmoc-Cys (tBu) -0H> Fmoc-Glu (OtBu) -0H> Fmoc-Asp (OtBu) -OH 和Fmoc-Asn (Trt) -OH制得普利卡那肽线性肽树脂。
[0031]作为优选，本发明步骤2采用固相合成法偶联。
[0032]作为优选，Fmoc-Leu-树脂中树脂采用Wang树脂。
[0033]优选的，Fmoc-Leu-Wang的替代度为 0.4mmoI /g ~0.8mmol/g。
[0034]更优选的，Fmoc-Leu-Wang的替代度为 0.5mmol/g。
[0035]作为优选，偶联的偶联试剂为HOBt与DIC的混合物，或H0Bt、PyBop与DIPEA的混合物，或HATU、HOAt与DIPEA的混合物。
[0036]作为优选，裂解的裂解试剂中包括:三氟乙酸、苯甲硫醚、苯酚、1，2-乙二硫醇、水
和二异丙基硅烷。
[0037]优选的，裂解试 剂中，各组分的体积分数为:
[0038]三氟乙酸70~75%、苯甲硫醚5~8%、苯酚5~8%、1，2_乙二硫醇5~10%、三异丙基硅烷3~6%，余量为水。
[0039]更优选的，裂解试剂中各组分的体积比为:三氟乙酸:苯甲硫醚:苯酚:7jC:1,
2-乙二硫醇:三异丙基硅烷=75:5:5:4:8:3。
[0040]作为优选，第二环化后还包括纯化的步骤。
[0041 ] 优选的，纯化采用RP-HPLC。
[0042]更优选的，RP-HPLC纯化色谱中，流动相A相为体积分数为0.1%的TFA水溶液，流动相B相为乙腈。
[0043]本发明提供的普利卡那肽的制备方法包括:固相合成Fmoc-Leu-树脂；按照普利卡那肽的肽序，在 Fmoc-Leu-树脂上依次偶联-Cys15、-Gly、-Thr、-Cys12、-Ala、-Val、_Asn、-Val、-Cys7、-Leu、-Glu、-CyS4、-Glu、-Asp、-Asn,制得普利卡那妝线性妝树脂，经裂解制得普利卡那肽线性粗肽；取普利卡那肽线性粗肽，经第一环化、第二环化，即得。本发明提供的制备方法在合成线性肽过程中，采用tBu或Acm作为半胱氨酸的侧链保护基，为了能够准确定位环化Cys4和Cys12采用相同的侧链保护剂，而Cys7和Cys15采用相同的侧链保护基。其中，tBu体积较小，能有效的降低空间位阻引发的偶联困难，利于提高收率；而Acm在酸性条件下稳定在裂解时不被脱除，就使得裸露的半胱氨酸在第一环化时能够定位环化。在环化过程中，本发明通过两步环化，中间过程无需纯化，就得到了纯度以及收率都很高的、二硫键准确定位的产物，且反应条件温和，利于工业化生产。实验结果表明:本发明制备得到的普利卡那肽纯度可达99.47%，总收率可达37.88%。
【专利附图】
【附图说明】
[0044]图1示对本发明实施例13制得的普利卡那肽的色谱图。
【具体实施方式】[0045]本发明提供了一种普利卡那肽的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0046]本发明采用的试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0047]其中，本发明采用试剂的中英文名称对照如表1所示:
[0048]表1本发明采用试剂的中英文名称对照
[0049]
【权利要求】
1.一种普利卡那肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤1:固相合成Fmoc-Leu-树脂； 步骤2:按照普利卡那肽的肽序,在所述Fmoc-Leu-树脂上依次偶联-Cys15、-Gly、_Thr、_Cys12、_Ala、_Val、_Asn、_Val、_Cys7、_Leu、_Glu、_Cys4、_Glu、_Asp、_Asn，制得普利卡那妝线性肽树脂，经裂解制得普利卡那肽线性粗肽； 步骤3:取所述普利卡那肽线性粗肽，经第一环化、第二环化，即得。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Cys4和Cys12的侧链保护基为叔丁基，所述Cys7和Cys15的侧链保护基为乙酰胺甲基；或所述Cys4和Cys12的侧链保护基为乙酰胺甲基，所述Cys7和Cys15的侧链保护基为叔丁基。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述Cys4和Cys12的侧链保护基为叔丁基，所述Cys7和Cys15的侧链保护基为乙酰胺甲基，所述第一环化具体为:采用过氧化氢水溶液使所述普利卡那肽线性粗肽中Cys4和Cys12间形成二硫键，所述第二环化具体为:采用碘的水溶液或碘的甲醇溶液使所述普利卡那肽线性粗肽中Cys7和Cys15间形成二硫键。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述Cys4和Cys12的侧链保护基为乙酰胺甲基，所述Cys7和Cys15的侧链保护基为叔丁基，所述第一环化具体为:采用过氧化氢水溶液使所述普利卡那肽线性粗肽中Cys7和Cys15间形成二硫键，所述第二环化具体为:采用碘的水溶液或碘的甲醇溶液使所述普利卡那肽线性粗肽中Cys4和Cys12间形成二硫键。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述偶联中，-Thr采用的侧链保护基为叔丁基，-Asn采用的侧链保护基为三苯甲基，-Glu采用的侧链保护基为叔丁氧基，-Asp采用的侧链保护基为叔丁氧基。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Fmoc-Leu-树脂中所述树脂采用Wang树脂。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述偶联的偶联试剂为HOBt与DIC的混合物，或HOBt、PyBop与DIPEA的混合物，或HATU、HOAt与DIPEA的混合物。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述裂解的裂解试剂中包括:三氟乙酸、苯甲硫醚、苯酚、1，2-乙二硫醇、水和三异丙基硅烷。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第二环化后还包括纯化的步骤。
【文档编号】C07K1/06GK103694320SQ201310680490
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月11日 优先权日:2013年12月11日
【发明者】朱日成, 宓鹏程, 马亚平, 袁建成 申请人:深圳翰宇药业股份有限公司