一种皮卡那肽的制备方法
【专利摘要】本发明采用固液结合的方法合成皮卡那肽，其中两对二硫键采用定向方法先后形成，避免了二硫键错配情况的发生，有利于后续纯化，本发明的方法具有操作简便、自动化率高、溶剂使用量少、绿色环保等优点。
【专利说明】一种皮卡那肽的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种多肽的制备方法，具体地涉及皮卡那肽的制备方法。
【背景技术】
[0002] 皮卡那肽（Plecanatide)是一种合成的尿鸟苷素类似物(尿鸟苷素是一种促尿钠 排泄激素，能够调节胃肠道中离子和液体的转运)，皮卡那肽进入体内后与胃肠道黏膜内皮 细胞上的鸟苷酸环化酶C结合并将其激活，活化囊性纤维化跨膜传导调节蛋白（CFTR)，促 进氯化物和水分进入肠道，从而促进肠道蠕动，改善便秘症状。
[0003] Synergy公司于2010年10月6日公布其在研新药皮卡那肽（代码：SP304)治疗 胃肠道疾病的II a期临床实验结果。这项在慢性便秘患者中进行的研究显示，该药物能够 改善患者的肠道功能，促进肠道蠕动，减少腹部不适状。在试验中，没有出现腹泻等不良反 应，在试验剂量下也没有检测到皮卡那肽被系统吸收。该药物有望用于治慢性便秘（CC)、便 秘型肠道易激综合征（IBS-C)以及其他胃肠道疾病。CC和IBS-C都是常见的胃肠道疾病， 可能对患者的工作和生活质量造成严重影响。Synergy公司将继续进行皮卡那肽的其他临 床试验。
【发明内容】
[0004] 本发明采用固液结合的方法合成皮卡那肽，具有操作简便、自动化率高、溶剂使用 量少、绿色环保等优点，同时两对二硫键采用定向方法合成，避免了二硫键错配情况的发 生，有利于后续纯化。
[0005] 皮卡那肽的结构为：
[0006] H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-C ys-Leu-〇H(二硫键 4-12, 7-15)
[0007] 本发明提供了一种制备皮卡那肽的方法，包括以下步骤：
[0008] 1)将Fmoc-Leu-OH与树脂偶联,得到Fmoc-Leu-树脂；
[0009] 2)按照皮卡那肽的肽序从C端到N端依次将氨基酸原料偶联到步骤1)得到的 Fmoc-Leu-树脂上，得到肤树脂片段 H-Asn (Trt) -Asp (OtBu) -Asp (OtBu) -Cys (X) -Glu (OtBu )-Leu-Cys (Y) -Val-Asn (Trt) -Val-Ala-Cys (X) -Thr (tBu) -Gly-Cys (Y) -Leu-树脂，其中 X和 Y选自Trt、Acm、mmt或StBu,并且X不同于Y ;
[0010] 3)将步骤2)得到的肽树脂裂解并脱除除Cys外的氨基酸的侧链保护基，并分别脱 除Cys的两种保护基X和Y，经氧化分别形成两对二硫键，得到皮卡那肽。
[0011] 其中，步骤1)所述的树脂是Wang树脂或CTC树脂，所用的偶联剂为：a)所用树脂 为wang树脂时所用偶联剂为HOBT/DIC/DMAP ;b)所用树脂为2-CTC树脂时所用偶联剂为 DIPEA。
[0012] 步骤1)所述的Fmoc-Leu-树脂的替代度为0· 25?0· 55mmol/g。
[0013] 步骤2)中所用的偶联剂为H0BT/DIC。
[0014] 步骤3)中，根据反应条件不同，脱除Cys的保护基X或Y可以与裂解肽树脂并脱 除除Cys外的其他氨基酸的侧链保护基同时进行；脱除Cys的保护基X或Y也可与氧化形 成二硫键（4-12)或二硫键（7-15)同时进行；但是二硫键（4-12)和二硫键（7-15)的形成是 分别进行的，这样可避免二硫键错配(例如（4-7 )、（ 12-15 ))情况的发生，有利于后续纯化。
[0015] 其中可使用含5%TFA的裂解液，优选TFA :DCM=5 :95 (V/V)将肽片段从CTC树脂上 裂解下来或将侧链保护基mmt脱除。
[0016] 可使用含95%TFA的裂解液，优选TFA :EDT :水=95 :2. 5 :2. 5(V/V)将肽片段从CTC 树脂或wang树脂上裂解下来，或将侧链保护基Trt、OtBu、tBu或mmt脱除。
[0017] 可使用I2溶液，优选含300mmol/l I2的乙醇溶液将侧链保护基Acm脱除。
[0018] 可使用β -巯基乙醇溶液，优选含20% β -巯基乙醇和0. IM N-甲基吗啉的DMF或 水溶液将侧链保护基StBu脱除。
[0019] 步骤3)中形成二硫键的条件为各种可使脱去侧链保护基的Cys之间形成二硫键 的氧化条件，包括但不限于空气或氧气氧化、DMSO氧化、I 2氧化或H2O2氧化。
【具体实施方式】
[0020] 本文的术语"肽树脂"是指多肽的C端连有树脂、N端的氨基连有Fmoc保护基的多 肽树脂。
[0021] 本文中"二硫键（4-12)"是指在皮卡那肽氨基酸序列中第4位Cys与第12位Cys 之间形成的二硫键；"二硫键（7-15)"是指在皮卡那肽氨基酸序列中第7位Cys与第15位 Cys之间形成的二硫键。
[0022] "裂解肽树脂"是指将肽片段从树脂上裂解下来。
[0023] 本发明中所用缩写及其含义列于下表：
[0024]
【权利要求】
1. 一种制备皮卡那肽的方法，包括以下步骤： 1) 将Fmoc-Leu-OH与树脂偶联，得到Fmoc-Leu-树脂， 2) 按照皮卡那肽的肽序从C端到N端依次将氨基酸原料偶联到步骤1)得到的 Fmoc-Leu-树脂上，得到肤树脂片段 H-Asn (Trt) -Asp (OtBu) -Asp (OtBu) -Cys (X) -Glu (OtBu )-Leu-Cys (Y) -Val-Asn (Trt) -Val-Ala-Cys (X) -Thr (tBu) -Gly-Cys (Y) -Leu-树脂，其中 X和 Y选自Trt、Acm、mmt或StBu,并且X不同于Y， 3) 将步骤2)得到的肽树脂裂解并脱除除Cys外的氨基酸的侧链保护基，并分别脱除 Cys的两种保护基X和Y，经氧化分别形成二硫键（4-12)与二硫键（7-15)，得到皮卡那肽。
2. 权利要求1的方法，其中步骤1)所述的树脂是Wang树脂或CTC树脂。
3. 权利要求1的方法，其中步骤3)中，脱除Cys的保护基X或Y可以与裂解肽树脂并 脱除除Cys外的其他氨基酸的侧链保护基同时进行；脱除Cys的保护基X或Y也可与氧化 形成二硫键（4-12 )或二硫键（7-15 )同时进行；二硫键（4-12 )和二硫键（7-15 )的形成是分 别进行的。
4. 权利要求1的方法，其中步骤3)中可使用含5%TFA的裂解液，优选TFA :DCM=5 :95 (V/V)将肽片段从CTC树脂上裂解下来或将侧链保护基mmt脱除；可使用含95%TFA的裂解 液，优选TFA :EDT :水=95 :2. 5 :2. 5 (V/V)将肽片段从CTC树脂或wang树脂上裂解下来，或 将侧链保护基Trt、OtBu、tBu或mmt脱除。
5. 权利要求1的方法，其中步骤3)中可使用I2溶液，优选含300mmol/ll2的乙醇溶液 将侧链保护基Acm脱除。
6. 权利要求1的方法，其中步骤3)中可使用β-巯基乙醇溶液，优选含20%β-巯基乙 醇和0. IM N-甲基吗啉的DMF溶液或水溶液将侧链保护基StBu脱除。
7. 权利要求1-6任一项的方法，其中步骤3)中氧化形成二硫键是采用空气或氧气氧 化、DMSO氧化、I2氧化或H 2O2氧化的方法。
8. 权利要求7的方法，其中步骤1)中所用的偶联剂为：a)所用树脂为wang树脂时所 用偶联剂为HOBT/DIC/DMAP ;b)所用树脂为2-CTC树脂时所用偶联剂为DIPEA。
9. 权利要求7的方法，其中步骤2)中所用的偶联剂为H0BT/DIC。
10. 权利要求1的方法，其中步骤1)中Fmoc-Leu-树脂的替代度为0. 25?0. 55_〇1/ g°
【文档编号】C07K1/04GK104211777SQ201310209459
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年5月30日 优先权日:2013年5月30日
【发明者】宓鹏程, 潘俊锋, 马亚平, 袁建成 申请人:深圳翰宇药业股份有限公司