拆分雌马酚对映异构体及测定其在豆制品中含量的方法与流程

本发明属于生物化学分析检测领域，具体涉及一种拆分雌马酚对映异构体及测定其在豆制品中含量的方法。

背景技术：

雌马酚(Equol)，化学名称为7-羟基-3-(4-羟苯基)-苯并二氢呋喃，化学结构式如下，是大豆异黄酮在人体肠道中由某些细菌代谢下产生的最终代谢产物之一。近年来研究发现，雌马酚是大豆异黄酮生理功能的主要体现者，在与雌激素调节相关的疾病如乳腺癌、前列腺癌、更年期综合症、以及心血管疾病、骨质疏松症等方面具有预防和治疗作用。但又发现仅有30％-50％的人类个体能在其肠道微生物菌群作用下将大豆异黄酮代谢为雌马酚，因此，外源性补充雌马酚就显得尤为重要。雌马酚为手性化合物，有两种对映异构体，分别为R-雌马酚与S-雌马酚，由于其与雌激素受体亲和程度不同，因此二者具有不同的生物学特性，而人体代谢产生的均为S-雌马酚。因此，开发手性拆分雌马酚对映体的技术并建立食品中S-雌马酚的含量测定方法具有十分重要的意义。

雌马酚化学结构式

食品中的雌马酚通常由大豆异黄酮生物发酵代谢而来，大豆异黄酮是一类黄酮化合物，主要存在于大豆和豆制品中，目前已知可能含有雌马酚的食品为发酵型豆制品，臭豆腐与腐乳是常见的发酵型豆制品。已有研究发现，台湾地区台北市138份臭豆腐中91％的样品检出了S-雌马酚，但测定时仅依据高效液相色谱法(HPLC)法对雌马酚进行定性检测，其准确度有待进一步确证。其他雌马酚的测定方法有：酶标记免疫吸附测定法、气相色谱法、液相色谱法和液相色谱-质谱法。其中酶标记免疫吸附测定法、气相色谱法都无法检测单个对映异构体，而高效液相色谱法对于样品前处理要求较高，步骤繁琐，且可能存在假阳性的干扰。

技术实现要素：

根据现有技术中的不足，本发明利用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)开发了一种拆分雌马酚对映异构体的技术，通过优化液相色谱与质谱参数，确定了最佳分析条件，简化了提取过程，通过加入内标的方式避免了基质效应的影响，可实现腐乳与臭豆腐等发酵型豆制品中S-雌马酚的快速测定，该方法的建立可为安全膳食补充雌马酚及提升豆制品的质量提供技术支持。

本发明采用的技术方案如下：

一种拆分雌马酚对映异构体及测定其在豆制品中含量的方法，包括以下步骤：

(1)采用甲醇提取和加入内标的方法对待测豆制品进行预处理；

(2)采用高效液相色谱-串联质谱方法将预处理后的待测豆制品中的雌马酚对映异构体进行分离和检测，其中，高效液相色谱条件为：色谱柱采用多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱，流动相由A相和B相组成，A相为乙酸铵水溶液，B相为甲醇。

优选的，步骤(1)中，所述待测豆制品为发酵型豆制品，例如腐乳、臭豆腐等。

优选的，步骤(1)中，从分离和检测效果来讲，所述内标为氯霉素。

优选的，步骤(1)中，根据特定的待测样品的特性，本发明的样品预处理的方法为：将待测豆制品、氯霉素和甲醇进行混合均质，超声萃取，离心取上清液。

进一步优选的，所述待测豆制品与甲醇的添加比例为10g：(10～15)mL；

进一步优选的，所述氯霉素在待测豆制品和氯霉素混合物的浓度为0.35～0.45μg/g，较佳的为0.40μg/g。

进一步优选的，所述均质时间为1～3min，较佳的为2min。

进一步优选的，所述超声萃取时间为1～3min，较佳的为2min。

进一步优选的，所述离心条件为：转速为7000～8000rpm，离心时间为8～12min，较佳的为：转速为8000rpm，离心时间为10min。

更进一步优选的，所述样品预处理的具体方法如下：准确称取待测豆制品固形物10.0g于试管中，加入适量氯霉素-D5内标，使其浓度为0.40μg/g，加入色谱甲醇10mL后，均质2min，超声萃取2min，再以8000rpm速度离心10min，取上清液0.5mL用色谱甲醇稀释至1.0mL，装入进样瓶，待测。

本发明的待测豆制品通过甲醇提取，操作步骤简单，时间较短；加入氯霉素内标避免了基质效应的影响，使得分离和检测结果准确、可靠。

优选的，步骤(2)中，所述多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱采用CHIRALCEL OJ-RH手性柱；所述CHIRALCEL OJ-RH手性柱优选的型号为：粒径为5μm，柱内径为4.6mm，柱长为150mm。

步骤(2)中，为了得到更高的灵敏度，增强质谱的离子化效率，所述乙酸铵水溶液中的乙酸铵的含量为8～12mmol/L，较佳的为10mmol/L。

步骤(2)中，采用等度洗脱方式进行洗脱，A相：B相的体积比为70～80：30～20，优选A：B＝80:20；优选流速为0.8～1.2mL/min，更优选为1.0mL/min；优选柱温为20～40℃，更优选为40℃，此温度下，雌马酚分离良好，保留时间缩短，峰面积较大；优选进样量为5μL。

步骤(2)中，质谱检测参数主要包括干燥气温度、碎裂电压与碰撞能量等，这些参数可以使样品母离子获得最大传输效率和子离子在质谱中有较高的响应强度，提高检测方法的灵敏度直接影响着检测灵敏度与准确度。优选的质谱条件为：离子源：电喷雾离子源(ESI)，采用负离子模式检测。干燥气：高纯N₂，干燥气温度：300～400℃，干燥气流速：8～12L/min，雾化压力：25～35psi，毛细管电压：3500～4500V。采用多反应监测(MRM)模式。

进一步优选的，干燥气温度：350℃，干燥气流速：10L/min，雾化压力：30psi，毛细管电压：4000V。

通过对雌马酚标准溶液的扫描检测，得到m/z 241[M-H]^-为母离子，并对碎裂电压(Fragmentor)、碰撞能量、干燥气体温度等进行了优化，氯霉素定量时的破碎电压为120V，碰撞能量为15V，氯霉素定性时的破碎电压为120V，碰撞能量为35V，R-雌马酚定量时的破碎电压为60V，碰撞能量为6V，R-雌马酚定量时的破碎电压为60V，碰撞能量为9V，S-雌马酚定量时的破碎电压为60V，碰撞能量为6V，S-雌马酚定量时的破碎电压为60V，碰撞能量为9V，最终确定质谱参数见表1。

上述技术方案中的一个技术方案具有如下有益效果：

(1)本发明利用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)开发了一种拆分雌马酚对映异构体的方法，通过优化液相色谱参数，确定了较佳的分析条件，从而简化了提取过程，通过加入内标的方式避免了基质效应的影响；该方法可有效避免假阳性结果的出现，能够实现豆制品中S-雌马酚的快速测定，该方法的建立可为安全膳食补充雌马酚及提升豆制品的质量提供技术支持。

(2)本发明对色谱柱进行了研究，试验结果发现CHIRALCEL OJ-RH手性柱可以有效拆分雌马酚异构体，分离效果好且有良好的色谱峰形，较Nucleodexβ-PM等其他手性色谱柱分离优异。

(3)本发明对流动相进行了研究，为了得到更高的灵敏度，增强质谱的离子化效率，本发明的流动相的A相选择乙酸铵水溶液，B相选择甲醇，使用该流动相，色谱峰形对称，灵敏度高，可以有效拆分雌马酚对异构体，保留时间较长，分离度较高，可满足准确测定单个对映体的要求。

(4)通过本发明的拆分雌马酚对映异构体及测定其在豆制品中含量的方法，检测灵敏度较高，检出限和定量限均较低。

(5)通过本发明的拆分雌马酚对映异构体及测定其在豆制品中含量的方法，具有良好的回收率和精密度，雌马酚对映异构体的回收率与精密度均满足《实验室质量控制规范食品理化检测》(GB/T 27404-2008)的要求。

附图说明

图1是雌马酚拆分对映异构体典型色谱图。

图2A～图2C是拆分雌马酚对映异构体质谱参数优化图，其中，图2A：优化Fragmentor电压；图2B：优化碰撞能量；图2C：优化干燥气温度。

图3：S-雌马酚线性回归方程及相关系数。

图4：R-雌马酚线性回归方程及相关系数。

具体实施方式

实施例1

1实验部分

1.1仪器与试剂

实验中使用的主要仪器有：Agilent-1200型快速分离高效液相色谱(Agilent公司)，6410型三重串联四级杆质谱(Agilent公司)。甲醇(色谱纯，Tedia公司)，乙酸铵(分析纯，国药集团)均为色谱纯。雌马酚外消旋化合物、S-雌马酚购自Sigma公司(纯度大于98％)。氯霉素-D5(内标IS)购自AccuStandard公司(纯度99％，美国)；CHIRALCEL OJ-RH手性柱(日本Daicel公司)。

1.2HPLC-MS/MS条件

1.2.1HPLC条件

色谱柱：CHIRALCEL OJ-RH手性柱(150mm×4.6mm，5μm，日本Daicel公司)。流动相：A相为含10mmol/L乙酸铵水溶液，B相为甲醇。等度洗脱：A：B＝80:20。流速：1.0mL/min。柱温：40℃，进样量：5μL。

1.2.2MS/MS条件

离子源：电喷雾离子源(ESI)，采用负离子模式检测。干燥气：高纯N₂，干燥气温度：350℃，干燥气流速：10L/min，雾化压力：30psi，毛细管电压：4000V。采用多反应监测(MRM)模式。通过对雌马酚标准溶液的扫描检测，得到m/z 241[M-H]^-为母离子，并对碎裂电压(Fragmentor)、碰撞能量、干燥气体温度等进行了优化，最终确定质谱参数见表1。

1.3样品处理

准确称取腐乳、臭豆腐等发酵型豆制品固形物10.0g于50mL洁净离心试管中，加入适量氯霉素-D5内标，使其浓度为0.40μg/g，加入色谱甲醇10mL后，均质2min，超声萃取2min，再以8000rpm速度离心10min，取上清液0.5mL用色谱甲醇稀释至1.0mL，装入进样瓶，待测。

2结果与讨论

2.1色谱条件的优化

为了达到雌马酚对映异构体的最佳色谱分离效果，本发明对色谱柱类型、温度和流动相体系进行了优化与考察。根据已有研究结果，利用手性流动相添加剂法与手性色谱柱可以有效分离雌马酚对映异构体。但以上结果不适用于液相色谱串联质谱技术。在流动相中添加的环糊精沸点较高，容易堵塞质谱喷雾针；在使用手性色谱柱时需要利用正己烷、异丙醇等溶剂做流动相，造成质谱离子化效率很低，灵敏度较差。

本发明首先对色谱柱进行了选择考察，试验结果发现多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱CHIRALCEL OJ-RH手性柱可以有效拆分雌马酚异构体，分离效果好且有良好的色谱峰形，较Nucleodexβ-PM等其他手性色谱柱分离优异，故以下试验选择多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱CHIRALCEL OJ-RH色谱柱。

其次，对色谱柱温度进行了优化。设置柱温20-60℃(色谱柱最高耐受温度60℃)，结果发现，在20℃、30℃、40℃时随着温度的升高，雌马酚分离良好，保留时间缩短，峰面积逐渐增加，40-60℃时峰面积不再变化，但分离度变差，故以下实验采用柱温40℃。

最后，利用反相流动相对乙腈-水体系及甲醇-水体系进行了考察。结果发现，在乙腈-水体系中雌马酚保留时间仅2.5min无法拆分对映异构体；在使用甲醇-水体系作为流动相时，色谱峰形对称，灵敏度高，可以有效拆分雌马酚对异构体，保留时间在8.6-11min，分离度达到2.0。为了得到更高的灵敏度，增强质谱的离子化效率，向流动相中加入10mmol/L的乙酸铵，在相同流动相比例的条件下，S-雌马酚保留时间8.43min，R-雌马酚保留时间9.68min，分离度达到2.8，可满足准确测定单个对映体的要求。典型色谱图见图1。

2.2质谱检测条件的优化

质谱检测参数主要包括干燥气温度、碎裂电压与碰撞能量等，这些参数可以使样品母离子获得最大传输效率和子离子在质谱中有较高的响应强度，提高检测方法的灵敏度直接影响着检测灵敏度与准确度，因此对以上参数进行逐一优化。实验方法如下：首先，在选择离子检测(SIM)的模式下，输入样品母离子质荷比m/z 241，优化碎裂电压(0V～240V)，保证母离子的最大传输效率，即尽可能多到达碰撞池，具体实验结果见图2A；然后，在子离子扫描模式下，输入母离子的质荷比和不同碰撞能量(0V～40V)，考察不同碰撞能量对母离子和子离子峰强度的影响，选择子离子强度最大时的碰撞能量，同时确定最佳子离子质荷比，具体结果见图2B；在设置干燥气温度范围150℃-350℃，在MRM模式下考察最佳灵敏度时的干燥气温度，具体结果见图2C。经过以上实验，确定最佳碎裂电压、碰撞能量等参数如表1所示。

氯霉素-D5(IS)的质谱条件参考GB/T 20756-2006中的参数进行设置。

表1.内标雌马酚检测质谱参数

实施例2线性关系及检出限

取适量雌马酚外消旋化合物标准溶液与氯霉素-D5标准溶液加入空白腐乳样品中，精确配制5.0、20、100、200、500、1000μg/kg的一系列不同质量浓度的样品，按“实施例1中的1.3项”下规定方法进行处理，在优化后的条件下分别进样测定，分别以雌马酚对映异构体的定量离子峰面积平均值对内标定量离子峰面积比值为纵坐标(Y)，分别以雌马酚对映异构体浓度与内标浓度比为横坐标(X)进行线性回归(线性图见图3-图4)，得到回归方程、相关系数和线性范围；以信噪比(S/N)≥3对应的浓度为检出限，(S/N)≥10对应的浓度作为定量限，得到两个雌马酚对映异构体的检出限和定量限，结果见表2。

表2.雌马酚对映异构体的线性方程、线性范围、相关系数、定量限及检出限

实施例3加标回收率

加入雌马酚外消旋标准溶液于空白腐乳样品中，使空白加标样品浓度为200μg/kg，“1.3项”下规定方法进行处理，重复测定5次，计算其回收率及精密度，结果表明，雌马酚对映异构体的回收率与精密度均满足《实验室质量控制规范食品理化检测》(GB/T 27404-2008)的要求，结果如表3所示。

表3.添加在空白腐乳样品中的雌马酚对映异构体的回收率和精密度试验结果(n＝5)

实施例4实际样品的检测

利用实施例1中的优化后的方法对市场上7种豆制品(4种腐乳、2种臭豆腐、1种豆腐)进行了测定，其中2种臭豆腐、1种腐乳中检出S-雌马酚，含量自0.48-55.4μg/kg之间，所有样品中均未检出R-雌马酚，与已有研究结果基本一致。

结论：

本发明开发了高效液相色谱拆分雌马酚对映异构体的技术，建立了高效液相色谱串联四极杆质谱内标法测定豆制品中雌马酚的方法。本方法操作简单，检测灵敏度高，且结果可靠，可实现了豆制品中雌马酚两种对映异构体的完全拆分及快速检测，该方法的建立可为安全膳食补充雌马酚(特别是具有保健功效的S-雌马酚)及提升豆制品的质量提供技术支持。