本发明涉及到一种舒肝丸中木香、厚朴的含量测定方法，属中药技术领域。具体的，涉及一种舒肝丸中和厚朴酚、木香羟内酯、去氢木香内酯、厚朴酚四种成分同时测定的含量测定方法。
背景技术：
舒肝丸为理气剂，具有舒肝和胃，理气止痛之功效。主治肝郁气滞，胸肋胀满，胃脘疼痛，嘈杂呕吐，嗳气泛酸。该药物由川楝子、醋延胡索、片姜黄、白芍(酒炒)、沉香、枳壳(炒)、木香、砂仁、陈皮、豆蔻仁、茯苓、姜厚朴、朱砂组成，药效明确。舒肝丸(大蜜丸)标准最早收录在《中国药典》1985年版，2000年版中增加水蜜丸规格，2005年版增加水丸规格，并对标准进行修订，检验内容同现行标准，2010年版第二增补本中增加小蜜丸规格，检验内容同《中国药典》2005年版，未作修定。该药物现行标准为《中国药典》2015年版，记载了该药物的组方、制法及质量控制方法。该药物所含药味多，《中国药典》2015年版中的含量测定项中，样品经过复杂的处理过程后，仅对白芍中芍药苷进行了含量测定，舒肝丸处方中木香、厚朴中的和厚朴酚、木香羟内酯、去氢木香内酯、厚朴酚并未进行测定。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供了一种同时测定舒肝丸中木香、厚朴的含量测定方法，本发明采用高效液相色谱法测定木香、厚朴中和厚朴酚、木香羟内酯、去氢木香内酯、厚朴酚四种成分含量。
本发明含量测定方法采用高效液相色谱法，该方法如下：
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈-0.05％磷酸，体积比为47∶53；检测波长为230-240nm，流速为1ml/min，理论板数按和厚朴酚峰计算应不低于2000-5000；
对照品溶液的制备 取和厚朴酚对照品、木香羟内酯对照品、去氢木香内酯对照品、厚朴酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml分别各含10、12、25、20μg的混合溶液，即得；
供试品溶液的制备 取舒肝丸水蜜丸，研细，取0.8g，精密称定；或取小蜜丸或大蜜丸，剪碎，取0.8g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，加热回流30-120分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液10μl与供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本发明含量测定方法中，检测波长优选为230nm；理论板数优选为按和厚朴酚峰计算应不低于3000；供试品制备中加热回流时间优选为90分钟。
为了验证测定含量方法的稳定性、准确性、专属性及系统适应性，对方法进行了以下方法学验证试验，以确保该含量测定方法可以作为舒肝丸的质量控制。
1仪器与试药
1.1仪器
高效液相色谱仪：Waters e2695；色谱柱：Thermo Accliam(5μm，4.6mm×250mm)；电子天平：Mettler AE163；Mettler AE240；超纯水仪：Integral 10(Millipore)。
1.2试药与试剂
对照品：和厚朴酚、木香羟内酯、去氢木香内酯、厚朴酚(均购自中国食品药品检定研究院；制备阴性对照用药材：川楝子、醋延胡索、白芍(酒炒)、片姜黄、木香、沉香、豆蔻仁、砂仁、姜厚朴、陈皮、枳壳(炒)、茯苓、朱砂购自市场，经河北省药品检验研究院主任药师段吉平鉴定为正品。
试剂：甲醇、乙腈(色谱纯，Merck公司)；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。
2方法确定
2.1色谱条件的确定
2.1.1测定波长的选择 分别称取和厚朴酚、木香羟内酯、去氢木香内酯、厚朴酚对照品适量，用甲醇溶液配制成适宜浓度的对照品溶液，在200nm～400nm进行光谱扫描。结果表明，厚朴酚与和厚朴酚在210nm波长附近有末端最大吸收，去氢木香内酯与木香羟内酯在220-240nm波长附近有最大吸收。在200～220nm波长下，对样品进行测定，结果待测成分与杂质峰分离较差，因此选用待测成分响应较强且无杂质峰干扰的230-240nm作为测定波长，此波长下各待测成分与杂质峰分离良好，阴性无干扰，其中230nm效果最好。
2.1.2流动相的选择
样品处方中药味多，成分复杂，杂质多，性质相近的成分多，流动相以甲醇作有机相时，未能得到良好分离，结合提取方法考察及色谱条件的考察，最终选择乙腈作为有机相，根据各待测成分的极性及出峰时间，将比例设为乙腈-0.05％磷酸溶液，体积比为47∶53，分离良好。
2.2对照品溶液的制备
供试品溶液的溶剂为甲醇溶液，故对照品溶液的稀释选择甲醇溶液。
2.3供试品溶液的制备方法
供试品溶液的制备 取舒肝丸水蜜丸，研细，取0.8g，精密称定；或取小蜜丸或大蜜丸，剪碎，取0.8g，精密称定。置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，加热回流90分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4提取方式的考察
取同一批样品(大蜜丸，批号：4015087)适量，分成两份，分别精密加入甲醇25ml，一份超声处理(功率400W，频率40kHz)90分钟、另一份加热回流90分钟，按拟定色谱条件测定。结果表明加热回流比超声处理提取率略高，故选择加热回流的提取方式，见表1。
表1不同提取方式的含量测定结果
2.5提取时间的考察
取同一批样品(大蜜丸，批号：4015087)适量，分别加热回流30min、60min、90min、120min，按拟定色谱条件测定。结果表明木香含量受回流时间影响较大，而厚朴含量结果基本无差别，为确保提取完全，选择加热回流90min，见表2。
表2不同提取时间的含量测定结果
2.6提取溶剂的考察
取同一批样品(大蜜丸，批号：4015087)适量，分别以50％、70％的甲醇溶液、甲醇、稀乙醇为提取溶剂，按拟定色谱条件测定。结果表明以甲醇为提取溶剂，所测得待测成分含量较高，参照药典方法选择甲醇作为提取溶剂，见表3。
表3不同提取溶剂的含量测定结果
3方法学考察
3.1专属性试验
按处方比例和制法分别制备不含木香、厚朴的阴性样品，按供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液，按正文方法测定，并在二极管阵列检测器上分析色谱峰纯度。结果表明，方中其他药味不干扰和厚朴酚、木香羟内酯、去氢木香内酯、厚朴酚的测定，色谱图见图1。
3.2线性关系考察
分别精密称取各对照品适量，配制混合对照品溶液(和厚朴酚浓度0.02004mg/ml、木香羟内酯浓度0.02493mg/ml、去氢木香内酯浓度0.05146mg/ml、厚朴酚浓度0.03978mg/ml)，精密量取混合对照品溶液2ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照品溶液II。精密量取混合对照品溶液II 5μl、10μl，混合对照品溶液5μl、10μl、20μl注入液相色谱仪，按拟定的色谱条件测定，记录峰面积。以对照品进样量(μg)为横坐标，对照品的峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归。结果和厚朴酚、木香羟内酯、去氢木香内酯、厚朴酚线性方程分别为y＝3.724×106x-5.70×104、y＝1.650×106x-1.55×104、y＝1.131×106x-2.16×104、y＝5.315×106x-3.98×104；线性范围分别为0.02004～0.4008μg、0.02493～0.4986μg、0.05146～1.0291μg、0.03978～0.7955μg；相关系数均为0.9999，表明待测成分线性关系良好。实验结果见表4。
表4各待测成分线性关系考察结果
3.3重复性试验
取同一批样品(大蜜丸，批号：4015087)，剪碎，分别称取0.64g、0.8g、0.96g各三份，精密称定，按供试品溶液制备方法制成供试品溶液，按正文方法测定。结果表明，本方法重复性良好(结果见表5)。
表5重复性试验结果
3.4回收率试验
取已知含量的样品(大蜜丸，批号：4015087含量见重复性结果)，剪碎，取9份，每份约0.4g，精密称定，每三份为一组，分别精密加入用溶液配制的低、中、高三个浓度的混合对照品溶液25ml，低浓度(和厚朴酚：0.001203mg·ml-1；木香羟内酯：0.002493mg·ml-1；去氢木香内酯：0.004117mg·ml-1；厚朴酚：0.003182mg·ml-1)；中等浓度(和厚朴酚：0.001503mg·ml-1；木香羟内酯：0.003116mg·ml-1；去氢木香内酯：0.005146mg·ml-1；厚朴酚：0.003978mg·ml-1)；高浓度(和厚朴酚：0.001804mg·ml-1；木香羟内酯：0.003740mg·ml-1；去氢木香内酯：0.006175mg·ml-1；厚朴酚：0.004773mg·ml-1)。按供试品溶液制备项下方法制备供试品溶液，按正文方法测定，计算回收率。结果表明本方法回收率良好。见表6～9。
表6和厚朴酚回收率试验结果
表7木香羟内酯回收率试验结果
表8去氢木香内酯回收率试验结果
表9厚朴酚回收率试验结果
3.5稳定性试验
取同一供试品溶液，于0小时开始测定，以后间隔一段时间测定一次，记录峰面积。结果RSD分别为1.2％、1.5％、1.2％、0.7％，表明供试品溶液至少在24小时内稳定(结果见表10)。
表10供试品溶液稳定性试验结果
4样品测定与限度制定
按拟定方法对34批次样品进行检验，结果见表11。
表11木香、厚朴含量测定结果(部分)
附图说明
图1：对照品(A)、样品(B)、木香阴性样品(C)、厚朴阴性样品(D)，色谱图中1为和厚朴酚，2为木香羟内酯，3为去氢木香内酯，4为厚朴酚)。
具体实施方式
实施例1
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈-0.05％磷酸，体积比为47∶53；检测波长为230nm；流速为1ml/min，理论板数按和厚朴酚峰计算应不低于3000；
对照品溶液的制备 取和厚朴酚对照品、木香羟内酯对照品、去氢木香内酯对照品、厚朴酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml分别各含10、12、25、20μg的混合溶液，即得；
供试品溶液的制备 取舒肝丸水蜜丸，研细，取0.8g，精密称定；或取小蜜丸或大蜜丸，剪碎，取0.8g，精密称定。置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，加热回流90分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液10μl与供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例2
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈-0.05％磷酸，体积比为47∶53；检测波长为240nm；流速为1ml/min，理论板数按和厚朴酚峰计算应不低于4000；
对照品溶液的制备 取和厚朴酚对照品、木香羟内酯对照品、去氢木香内酯对照品、厚朴酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml分别各含10、12、25、20μg的混合溶液，即得；
供试品溶液的制备 取舒肝丸水蜜丸，研细，取0.8g，精密称定；或取小蜜丸或大蜜丸，剪碎，取0.8g，精密称定。置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，加热回流30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液10μl与供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例3
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈-0.05％磷酸，体积比为47∶53；检测波长为235nm；流速为1ml/min，理论板数按和厚朴酚峰计算应不低于2000；
对照品溶液的制备 取和厚朴酚对照品、木香羟内酯对照品、去氢木香内酯对照品、厚朴酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml分别各含10、12、25、20μg的混合溶液，即得；
供试品溶液的制备 取舒肝丸大蜜丸，剪碎，取0.8g，精密称定；或取小蜜丸或大蜜丸，剪碎，取0.8g，精密称定。置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，加热回流60分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液10μl与供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例4
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈-0.05％磷酸，体积比为47∶53；检测波长为230nm；流速为1ml/min，理论板数按和厚朴酚峰计算应不低于5000；
对照品溶液的制备 取和厚朴酚对照品、木香羟内酯对照品、去氢木香内酯对照品、厚朴酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml分别各含10、12、25、20μg的混合溶液，即得；
供试品溶液的制备 取舒肝丸浓缩丸，研细，取0.8g，精密称定；或取小蜜丸或大蜜丸，剪碎，取0.8g，精密称定。置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，加热回流120分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液10μl与供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
上述实施例均按照药典要求进行方法学验证，结果显示方法准确可靠、灵敏、专属，各项指标均符合质量控制的要求。