一种检测中药代煎液中邻苯二甲酸二（2‑乙基）己酯的方法与流程

本发明属于中药分析
技术领域：
，具体涉及应用高效液相色谱法检测中药代煎液中邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯的方法。
背景技术：
：塑化剂即邻苯二甲酸酯类化合物(PAEs),别名酞酸酯，因为它能够增强塑料的韧性和可塑性，降低加工温度，所以被广泛运用于塑料包装。在一定条件下，PAEs能够从塑料包装中迁移出来，医用塑料包装中残留的PAEs可能会向药品中迁移造成污染。PAEs被人体摄入后会干扰机体正常的内分泌功能，长期在体内积蓄会导致更加严重的后果。在“塑化剂”事件曝光之后，国内的食品、酒水饮料以及食用油等接连被检测出PAEs存在。由于PAEs的广泛存在以及对人体正常功能的损害，使得对于PAEs的研究受到重视。目前国内医院普遍提供的中药代煎服务使用医用塑料袋包装药液，而目前对于中药代煎液灌装温度与PAEs溶出风险之间联系的研究仍处于空白。邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)是常见的PAEs之一，常作为增塑剂用于热塑性塑料的生产。以往PAEs检测方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)和液相色谱-质谱法等，分析方法多采用外标法。以往PAEs检测方法存在以下缺点：检测时间过长，出峰时间不稳定，价格昂贵，检测成本较高，不易推广。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种定性检测中药代煎液中邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯的方法，利用高效液相色谱建立稳定可靠的实验方法定性检测中药代煎剂中邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)。本发明的技术方案如下：一种定性检测中药代煎液中邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯的方法，包括如下步骤：(1)标准溶液配制：精密称取邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯标准品，用甲醇溶解定容，再用甲醇稀释成实验所需标准溶液浓度；(2)样品处理与净化：将中药煎煮成药液，所述药液在90-100℃下灌装于医用PVC塑料袋中，室温下放置15h-30h后，取40-60g药液在玻璃容器中，加入正己烷萃取；待静置分层后得到水相和有机相，取水相再加入正己烷萃取；收集有机相，用无水硫酸钠去除水分并过滤至蒸发皿中；用少量正己烷洗涤容器和无水硫酸钠，一并过滤至蒸发皿；将蒸发皿在60-80℃水浴中蒸干，用甲醇定容得到样品溶液，供HPLC分析；(3)定性分析：流动相选择：乙腈、甲醇、水的质量比例在90-93：9-11：0.2-0.6；柱温设定为28-31℃；流速选定为0.9-1.1mL/min；波长选定为224nm；在所述条件下对DEHP标准溶液和样品溶液进行分析，以峰面积为纵坐标(y)，质量浓度为横坐标(x)，计算组分的回归方程、相关系数和线性范围，并确定检出限，定性检测中药代煎液中邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯。色谱条件优化：流动相的选择：根据流动相尝试不同配比，结果发现增加甲醇或水的配比，检测峰与前面的溶剂峰交错在一起，甚至出现所有峰叠在一起分不清彼此，而且峰型也不大好，分离效果明显不加；如果增加乙腈比例，峰型变好，分离效果开始增加，到了某一程度后峰型便开始保持不变。但是乙腈加的量越多，出峰的时间也就越长。乙腈、甲醇、水的质量比例在90-93：9-11：0.2-0.6较好。柱温的选择：色谱柱温度对保留时间有较大影响。升高柱温可明显提高各组分的分离度。当温度升高时，出峰时间明显的提前。虽然在进标准液时能够减少时间，但是在进样品时，出峰的提前有可能会被样品前面的杂质峰干扰，影响实验的准确性。而且温度太高会损伤色谱柱。所以最终设定柱温为28-31℃。流速的选择：流速是色谱条件中的重要因素。流速增加，使得分析测试时间缩短，但样品出峰早会导致与前面峰重叠，分离效果不好。同样流速过慢会使得分析测试时间增长，而且峰会拖长，峰型和塔板数都不好，因此，最终流速选定为0.9-1.1mL/min。检测波长的选择：根据紫外扫描，邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯在224nm和244nm附近都有较大的吸光度。根据液相测试，波长在224nm时的峰更好，所以最终波长设定在224nm。根据本发明的方法，优选的是，步骤(1)所述邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯标准品的重量为50-100mg。根据本发明的方法，优选的是，步骤(1)所述标准溶液的浓度为0.5mg/L，1mg/L，2mg/L，5mg/L，10mg/L。标准溶液可以提前配置好，保存于冰箱冷藏室中，0-5℃。根据本发明的方法，优选的是，步骤(2)所述的玻璃容器为分液漏斗。或者可以是其他方便萃取操作的漏斗。根据本发明的方法，优选的是，步骤(2)中所述的萃取操作为剧烈震荡3-10min，静止20-50min。静止后可以打开盖子放气，让溶剂里面的气泡减少一些。根据本发明的方法，优选的是，步骤(2)所述药液与正己烷的体积比为3-6:1。根据本发明的方法，优选的是，步骤(2)所述的中药代煎液是将以中药煎药机加自制蒸馏水3000-5000mL煎煮0.5-2小时。优选的是，步骤(3)所述的流动相比例为：乙腈、甲醇、水比例在90：10：0.5。本方法在15分钟内完成检测。所需设备价格普通，出峰稳定。本研究采取高效液相色谱来定性检测中药代煎剂包装袋溶出痕量PAEs的，减少实验过程中带来的系统误差。本发明有益技术效果：本发明的提供一种定性检测中药代煎液中邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯的方法，利用高效液相色谱法建立稳定可靠的实验方法定性检测中药代煎剂中邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)；本发明以正己烷萃取100℃下灌装中药代煎药液邻苯二甲酸酯类化合物，净化、浓缩后，利用高效液相色谱法进行定性分析，该温度下灌装的中药代煎液中是否检测到DEHP存在；高效液相色谱法可以简单快速地定性检测DEHP，满足对中药代煎药液中DEHP的检测需要。附图说明图1是标准样品的色谱图。图1中，峰1为邻苯二甲酸二(2‐乙基)己酯。图2是确定检测波长时候的紫外谱图。图3是质量浓度与峰面积的线性关系图。图4是实施例的谱图。图中，峰1为邻苯二甲酸二(2‐乙基)己酯。具体实施方式为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。标准样品的色谱图见图1.分别配制含有不同浓度的系列标准样品溶液，在优化的实验色谱条件下依次进样，以峰面积为纵坐标(y)，质量浓度为横坐标(x)，计算组分的回归方程、相关系数和线性范围。并确定检出限。(见图2)。结合图3，从表1中可见，在一定样品浓度范围内，质量浓度与峰面积相关性良好，y＝25.5207*x+1.534566，R2＝0.99949。相关系数在0.999之上，线性范围相对较宽，检出限为1.534566mg/L，说明本实验方法具有较低的检测浓度，满足痕量分析要求。利用液相色谱方法研究中药汤剂包材中邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯物质，在色谱条件优化后，相关系数、线性范围和检测限方面均取得了较好的实验结果。表1浓度(mg/L)峰面积0.50713.530071.0562527.47462.02853.180015.28125140.2704510.14258.42953加标回收率和精密度选取特定浓度的样品溶液，进样量为40μL，重复6次，计算样品的加标回收率和相对标准偏差(RSD)，相对标准偏差为0.501％，说明本方法具有重复性好、准确度高的特点。123456峰面积75.0337375.7083775.5631176.1805975.6025375.86279相对标准偏差(RSD)0.501％回收率取空白清澈水样，加入邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯浓度为84.5mg/L混匀，按照方法进行处理及含量测定。回收率在合理范围内，回收率良好。稳定性试验取3份同样的供试品溶液，按照方法进行含量测定，计算相对标准偏差(RSD)123峰面积31.4689132.4465931.17413相对标准偏差(RSD)2.101％空白试验提取溶剂中的杂质、所使用的玻璃器皿和环境等均可能给中药汤剂包材中，邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯的测定带来污染，由于影响检测的各个因素经常发生变化。因此，为了较好地消除这些因素对中药汤剂包材中测定影响，使测定结果更为准确、可靠，在分析样品的同时每次均进行空白试验。操作方法是取自制蒸馏水溶剂，按实验方法进行处理，浓缩至2mL，制成空白溶剂。在3.1.4的色谱分离条件下平行测定3次，取3次测定的平均值作为该批次样品测量结果的空白校正值。经检测，未检出对应色谱峰，所以空白浓度为0。实施例：仪器与试剂Agilent1100高效液相色谱仪(脱气装置AgilentG1322A、四元泵AgilentG1311A、柱温箱AgilentG1316A、紫外检测器AgilentG1314A)；恒温水浴锅HWS-26(慧泰仪器)；电子天平(梅特勒-托利多公司ME204)；精密电子天平(梅特勒-托利多公司XS105DU)。邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯标准品(aladdin公司)；无水硫酸钠(AR凌峰公司7757-82-6)；正己烷(AR凌峰公司110-54-3)；甲醇(AR凌峰公司67-56-1)；液相甲醇和乙腈(默克公司)；自制蒸馏水。中药药液包装袋批号：SH101024(长春博雅)。取中药材(党参，黄芪和淮山药各100g)加蒸馏水4000ml放在中药煎煮机中，煎煮一小时，取药液灌入中药PVC塑料袋中，静置24小时后，从中药PVC塑料袋取出50g药液放入分液漏斗中，加10mL正己烷。剧烈震荡5min，静止30min(注意打开盖子放气，让溶剂里面的气泡减少一些)。分层后取上面的有机溶剂，而水相再加10mL正己烷，重复上面萃取步骤。收集有机相，用无水硫酸钠去除水分并过滤至蒸发皿中。用少量正己烷洗涤容器和无水硫酸钠，一并过滤至蒸发皿。70℃水浴中蒸干，甲醇定容至2mL。用精密电子天平准确称取邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯标准品约85mg，甲醇溶解定容至100mL(此为标准品母液，约850mg/L)。取母液稀释，分别配制成0.5mg/L，1mg/L，2mg/L，5mg/L，10mg/L，5种浓度的标准液。保存于4℃冰箱中。色谱条件COSMOSIL5C18-AR-II(4.6ID*150mm)；柱温30℃，检测波长224nm；流动相乙腈：甲醇：水＝90：10：0.5；流速1.0mL/min；进样量：对照20μL样品40μL。标准样品的色谱图见图1.本实施例的药液样品的图谱见图4。PAEs为非极性/弱极性化合物，难溶于水，可溶于大多数有机溶剂，常用提取剂为乙腈、甲醇和正己烷。因本实验样品为中药汤剂，甲醇、乙腈与水互溶而难以浓缩样品，故选择正己烷为提取剂。此外，PAEs属于脂溶性物质，提取液中常含有少量的脂肪、脂肪酸、色素等，选择乙腈作为洗脱液洗脱效果最佳。本研究结果表明，中药代煎剂灌装温度100℃时，药液中可以检测到塑化剂DEHP的存在，提示中药代煎药液高温下灌装会导致DEHP的溶出，欧盟规定全部邻苯二甲酸酯的成人耐受量为每天0.05mg/Kg，代煎液中含有塑化剂不仅仅会影响药效的发挥，也会对机体的健康产生一定的危害。因此药液灌装宜在更低的温度下进行。本研究对中药代煎剂中的塑化剂成分进行了定性检测，为中药代煎过程中医用塑料包装的安全使用提供参考，也为下一步摸索适宜的条件来定量分析样品中的塑化剂含量提供了必要的证据。当前第1页1 2 3