一种微液滴荧光检测系统的制作方法

本发明涉及微液滴领域，特别涉及微液滴荧光检测系统。

背景技术：

微流控芯片技术是近年来发展迅速的一种生物化学分析技术，具有通量高、检测灵敏度高、成本低和易于自动化等潜在优势，使其在生化检测，尤其是生物医学领域具有很广阔的应用前景。

液滴微流控技术是微流控技术的一个重要的组成部分。液滴微流控技术是将两种互不相容的流体，以最常见的水和油为例，送入微米尺度的管道中，通过流体力学的作用，使得水相被油相分成一个个大小稳定，尺度在微米级的小液滴，每个小液滴作用一个独立的反应器，相当于生化反应中常用的试管。微液滴这种“小试管”体积小、数量多，具有许多常规试管没有的优势，比如通量高、试剂消耗小和背景噪声低，因而具有很好的工业化前景。

微液滴技术的高通量得益于液滴数量大和体积小的特点，但是这也给检测液滴荧光信号带来了挑战。液滴数量多，就要求液滴荧光的检测速度高，否则高通量无法实现。液滴体积小，则对检测系统的检测精读提出了挑战。目前论文和商用仪器采用的液滴荧光检测方法主要包括以下三种：

第一种是利用鞘流将液滴分隔并依次通过包含激发光和检测光路的检测区域，然后系统记录下各个液滴的荧光强度。这种检测方式类似于流式细胞术，特点是光路系统固定不动，样品依次通过检测区域。这种检测方式不仅在学术界被广泛应用，在现有的微液滴商业仪器中也被采用，包括美国的Bio-Rad公司的QX200和Raindance Technologies公司的RainDrop Digital PCR System。这种检测方式具有液滴荧光检测精读高、灵敏度高和稳定性好的优点。不足是液滴检测速度存在瓶颈，由于液滴流动速度受其稳定性限制造成的。Raindance公司的RainDrop Digital PCR System读取约500万个液滴的荧光大约需要半个小时的时间，每秒检测大约3千个液滴，这样的检测速度还不能满足临床高通量的检测需求。

第二种方法是通过荧光成像的方法，一次拍摄一定数量的液滴荧光图像，然后利用图像处理技术，将图像中的液滴荧光进行自动识别，从而得到液滴的荧光信息。这种检测方法由于成像范围大，因此在检测的时候可以不需要样品流动，对流体驱动系统要求较低；而且不仅可以在微管道中检测液滴，还可以在芯片腔体甚至是载玻片上检测，对液滴所处的检测环境的要求较低。不足的地方是需要对成像照片进行图像处理，而图像处理不仅比较复杂，而且计算量大，需要较高的硬件和软件支持；此外，由于需要采用相机来获取图像，其对于荧光信号强度的分辨能力相比光电倍增管这类的传感器要低，因此对液滴荧光的检测精读也受到影响。

第三种液滴检测方法是将液滴放置于一个圆柱形透明容器中，容器以圆柱体的中心轴为转轴高速旋转，由于离心力的作用，液滴将分布在容器壁的内侧，而荧光激发光路的焦点与荧光接收光路的焦点重合且位于容器壁内侧，于是容器转过一周，荧光检测光路就会得到焦点所在位置所对应的“圆环”上液滴的荧光信息，此时改变容器的高度，就能得到另一个“圆环”上液滴的荧光信息，通过这种方法获得所有液滴的荧光信号。这种检测方式由于液滴在检测过程中相对于容器处于相对静止，属于不流动的状态，使得其不存在液滴稳定性而影响高速运动，达到了很高的检测速度，大约每秒能检测十万个液滴。但不足之处是由于没有采用微流控技术，整个检测环境处于开放状态，容易污染生化检测环境，影响后续检测；同时每个液滴荧光的激发位置并不统一，荧光信号无法量化和比较，影响了获得的数据质量。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服前面所说的几种微液滴荧光检测方法的不足，提出一种新型的微液滴荧光检测系统。

在一种实施方式中，微液滴荧光检测系统包括：微流控芯片，包括用于存储微液滴的管道，使得微液滴在管道中呈单层平铺；光路装置，其包括荧光激发部分、荧光采集部分、明场成像部分和液滴位置检测部分；荧光激发部分使得位于激发区域内、含有荧光物质的微液滴产生荧光；荧光采集部分将微液滴荧光光谱信号从背景光中分离出来，并通过检测装置进行检测；明场成像部分利用照明光源和成像光路，实时采集芯片管道的图像信息，实现检测区与芯片管道的对准；液滴位置检测部分利用微液滴的油相和水相对光折射率不同，实现对检测区液滴位置的判读；运动控制装置，其控制芯片和光路装置机械运动，使得在芯片中的微液滴荧光扫描检测过程中，芯片与光路装置产生相对运动，而芯片内微液滴与芯片保持相对静止。

在一种实施方式中，管道深度范围为5μm至1mm，管道宽度范围为5μm至10cm。

在一种实施方式中，芯片外形为圆形，管道由多段圆弧连接而成，各段圆弧的圆心与芯片的圆心重合；或者芯片外形为长方形，管道是由一段或多个腔体所组成。

在一种实施方式中，荧光激发部分使用的激发光波长范围200nm至3000nm。

在一种实施方式中，所述激发区域包含多个微液滴，激发光同时激发激发区域内多个微液滴，例如，可将LED作为激发光源，通过滤光装置将所需波段的光分离出来作为激发光，并利用光学镜片组，将激发光变成平行或是汇聚的光束，照射到芯片上含有多个液滴的区域，形成激发区；或者所述激发区域至多包含一个微液滴，激发光同时激发激发区域内至多一个微液滴，例如，可利用显微物镜或光纤，将特定波长的激光汇聚到检测区内，形成与检测区大小相当的激发区，由于检测区内至多含有一个液滴，因而激发区域也至多含有一个液滴。

在一种实施方式中，荧光激发部分与荧光采集部分是一体的或者是分体的。

在一种实施方式中，在微液滴荧光检测过程中，所述运动控制装置使芯片沿旋转中心旋转，光路装置沿芯片旋转中心径向运动，完成荧光检测过程；或者在微液滴荧光检测过程中，所述运动控制装置使光路装置静止不动，而芯片以逐行扫描的运动方式完成荧光检测过程；或者在微液滴荧光检测过程中，所述运动控制装置使芯片静止不动，而光路装置以芯片中心为起点按螺线型运动轨迹完成荧光检测过程。

在一种实施方式中，所述运动控制装置包括电动旋转台、电动升降台和控制系统，电动旋转台固定电动升降台上；控制系统控制电动旋转台和电动升降台运动；所述微流控芯片通过转轴固定在电动旋转台上，微流控芯片的中心与转轴的旋转中心重合。

在一种实施方式中，所述运动控制装置还包括电动滑台，所述光路装置固定在电动滑台上，所述电动滑台由所述控制系统控制，能够向着旋转中心靠近或远离的方向水平移动。

在一种实施方式中，所述光路装置射出或接收的光束对应于所述微流控芯片检测区；所述光路装置包括位于检测区上方的微液滴检测传感器。

本发明的微液滴荧光检测系统具有以下有益效果：

1.液滴荧光检测速度快，通量高。由于本发明采用的是液滴不流动的方法，不受液滴稳定性的影响，因此液滴能以很快的速度与荧光检测系统相对运动，从而实现了快速的液滴检测，能达到每秒检测5万个液滴，是目前最常用的液滴荧光检测方法速度的10倍。

2.荧光检测的灵敏度高，数据质量高。由于本发明的荧光检测有效区域小，因而背景的噪声得到很好的降低，提高了信号高的信噪比，从而实现高的灵敏度。同时，检测区对准每个液滴的中心，使得每个液滴的荧光激发状态一致，从而保证了高的数据质量。

3封闭式检测，避免交叉污染。由于本发明是对全封闭的微流控芯片进行荧光检测，因而很好的避免了不同样品之间的交叉污染，也提高了检测结果的可靠性，尤其适合生物医学领域。

附图说明

为了清晰说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1是本发明的一种实施方式的微液滴荧光检测系统组成结构示意图；

图2是本发明的一种实施方式的微液滴荧光检测系统的光路装置原理图；

图3是本发明的一种实施方式的微液滴荧光检测系统的微流控芯片的管道结构和检测区关系示意图；

图4是本发明的一种实施方式的微液滴荧光检测系统通过激光的折射来判断液滴位置的原理示意图；

图5是本发明的一种实施方式的微液滴荧光检测系统工作流程图；和

图6是使用本发明的微液滴荧光检测系统进行液滴PCR荧光信号检测结果图。

具体实施例

为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。

实施例1微液滴荧光检测系统组成

在一种实施方式中，本发明的系统组成部分如图1所示，系统按照功能可以划分为三个部分：微流控芯片、光路装置和运动控制装置。

微流控芯片，其包括用于存储微液滴的管道，微液滴在管道中呈单层平铺。微流控芯片在图1所示系统中为微流控芯片1。

光路装置，其包括荧光激发部分、荧光采集部分、明场成像部分和液滴位置检测部分。荧光激发部分使用激发光光源形成特定的激发光，并照射到激发区域内，使得位于激发区域内、含有荧光物质的微液滴产生荧光；荧光采集部分通过收光装置采集检测区域内微液滴的荧光，并将微液滴荧光从背景光中筛选出来，并通过检测装置进行检测；明场成像部分利用照明光源和成像光路，将芯片管道的图像通过相机采集出来，然后在运动控制装置的配合下，完成检测区与芯片管道的对准，这部分工作在液滴荧光检测之前完成；液滴位置检测部分利用油相和水相对光折射率不同，光束在液滴经过时会发生不同角度的折射的原理，根据不同位置的光束传感器采集的信息，计算处光束折射的情况，实现对检测区液滴位置的判读。光路装置在图1所示系统中包括光路模块3、照明光源8、检测区9、光束10和液滴检测传感器11。

运动控制装置，其控制芯片和光路装置运动，使得在芯片中的微液滴荧光扫描检测过程中，芯片与光路装置产生相对运动，而芯片内微液滴与芯片保持相对静止。运动控制装置在图1所示系统中包括转轴2、电动滑台4、电动旋转台5、电动升降台6和控制系统7。

微流控芯片1通过转轴2固定在电动旋转台5上，微流控芯片1的中心与转轴2的旋转中心重合。电动旋转台5能控制转轴2以0到6000rpm的转速旋转，由控制系统7控制。电动旋转台5固定电动升降台6上，电动升降台6能将固定在其上面的模块垂直升高或降低，精读为1微米，由控制系统7控制。光路装置3固定在电动滑台4上，电动滑台4能够向着旋转中心靠近或远离的方向水平移动，精度5微米，由控制系统7控制。光束10为光路装置3射出或接收的光束，其对应微流控芯片1中的区域是检测区9。照明光源8是一盏白色LED灯，为系统明场成像提供光源。液滴检测传感器11位于检测区9上方。

在一种实施方式中，光路装置3的荧光激发部分、荧光采集部分和明场成像部分，这三个部分原理图如图2所示。

荧光激发部分：激光器3d用于激发液滴内的荧光，输出激光的波长为488nm，功率为50mW，射出的激光束3e通过阔束器3c阔束后，到达二向色镜3b。二向色镜3b具有长波通，短波反射的特点，波长低于500nm的光将被反射，高于500nm的光将会透过，二向色镜3b与激光束3e有45°的夹角，因此激光束3e将被反射到物镜3a中并聚焦到检测区9中，其中物镜3a是一个放大倍数为20倍的显微物镜。

荧光采集部分：如果检测区9中有荧光，荧光会被物镜3a收集并变成平行光到达二向色镜3b，由于荧光的波长为520nm，高于500nm，因而光束3f会透过二向色镜3b到达二向色镜3g。二向色镜3g也具有长波通，短波反射的特点，波长低于540nm的光将被反射，高于540nm的光将会透过，因此光束3f中的荧光光束3i被反射到成像透镜3j中，最后聚焦到光电倍增管3k中，光电倍增管3k将其转换成电信号反馈到控制系统7。

明场成像部分：如果检测区9中有明场照明光，照明光会被物镜3a收集并变成平行光到达二向色镜3b。由于照明光往往是宽频谱的光，照明光中波长大于500nm的光会透过二向色镜3b形成光束3f，而后到达二向色镜3g。由于二向色镜3g也具有长波通，短波反射的特点，光束3f中波长大于540nm的光将透过二向色镜3g形成成像光束3h，最终通过成像透镜3l聚焦到相机3m上。于是，相机3m就能实时获取检测区9中的图像信息，从而完成检测区9与芯片管道的对准。

在一种实施方式中，微流控芯片1管道结构和检测区9示意图如图3所示。微流控芯片1的外形是圆形，芯片的圆心与转轴2的旋转中心重合。微流控芯片1上具有一条管道1a，管道由多段圆弧形管道组成，这些圆弧形管道的特征是圆弧的圆心重合，且与微流控芯片1的圆心重合，管道深100微米，宽100微米，管道入口1b和管道出口1c分别处于管道的两端，当液滴被输入管道中后，会一个挨着一个排列成队列，正如检测区9的俯视图展示的那样。检测区9只是光路装置3的光学焦点在微流控芯片1上所处位置，并不是具体的芯片结构，此时其中心此时位于管道中心，当芯片旋转时，这段圆弧管道内的液滴将依次经过检测区9，每个液滴的荧光信息将被检测。

在一种实施方式中，图4展示的是光路装置3的液滴位置检测部分通过激光的折射来判断液滴位置的原理示意图。光路装置3中向检测区9射出激光束3e，如果此时检测区9内无液滴，激光束3e将透过芯片照射到光检测器11b上，检测器11b将输出高电压信号到控制系统7中，而检测器11a由于没有被激光束3e照射，将输出低电压信号，控制系统7通过对比两个电压信号，判断出此时检测区9无液滴。当检测区9内存在液滴时，激光束3e将被液滴折射而照射到检测器11a上，通过对比与检测器11b的信号，能判断出检测区9内存在液滴。

如图5所示，本发明的一种实施方式中的荧光检测平台完成一次液滴荧光检测所需的8个步骤。

第一步，液滴上样。将待测液滴样品从管道入口1b注入到管道1a，待液滴充满管道1a后，封住管道入口1b和管道出口1c，这样液滴在管道1a内就不能随意流动了。然后将微流控芯片1装载到转轴2上。

第二步，管道对焦。由于检测区9是位于光路装置3上方的一个很小的特定区域，是荧光激发光汇聚和荧光接收的焦点，它的位置相对于光路装置3是固定的。管道对焦操作就是要让检测区9的中心与管道1a的中心重合。实现的方法是通过控制电动升降台6改变微流控芯片1的垂直高度，使管道1a与检测区9位于同一高度。然后通过控制电动旋转台5和电动滑台4让检测区9和管道1a的水平位置重合，最终实现中心重合，完成对焦。整个过程是在明场光源8与相机3m的配合观测下完成的。

第三步，启动荧光检测系统。启动前需要将明场光源8关闭，然后开启激光器3d和光电倍增管3k，同时开启液滴检测传感器11，此时荧光检测系统处于工作状态。

第四步，芯片旋转。启动电动旋转台5，微流控芯片1围绕中心开始旋转。管道1a中的液滴由于无法流动，将跟随管道一起运动，依次通过检测区9。

第五步，荧光检测。液滴依次经过检测区9时，将被激光照射，如果液滴内有荧光产生，荧光信号将被检测和记录，并在控制系统7中实时计算分析。

第六步，切换轨道。轨道是指管道1a上具有相同半径的圆弧管道。当芯片旋转一周后，检测区9位于的轨道内的液滴都被检测，于是电动滑台4开始工作，将检测区9移动到另一个轨道上，由于轨道之间的距离是已知的，此时只需要让电动滑台4移动已知的距离就能完成切换轨道，不需要额外的观测手段。

第七步，查看是否检测完毕。如果此时已经将所有轨道上的液滴检测完毕，则完成检测。否则，回到步骤五，继续检测液滴荧光，如此重复直至所以轨道上的液滴检测完毕。

第八步，检测结束。当所有轨道上的液滴均被检测完毕后，系统就完成了一次液滴荧光检测。

实施例2对数字式液滴PCR结果进行快速检测

第一步是需要将20微升的PCR体系生成液滴并进行液滴PCR扩增。20微升的PCR体系包含10微升的Bio-Rad公司的ddPCR Supermix for Probes，GJB2基因上下游引物试剂5微升和含有1ng基因组DNA的模板5微升。将20微升的PCR体系和40微升的Bio-Rad Generation Oil，放入Bio-Rad QX200的微滴发生器中，生成液滴并用移液枪转移到200微升的试管中。然后将试管放入PCR仪器中，PCR循环程序为：95℃10min预变性，95℃15s，55℃20s，72℃30s循环，共40个循环，最后4℃保温。等待反应结束。

第二步是将经过PCR反应后的液滴注入微流控芯片1中并进行光路装置3的对焦。将液滴从管道入口1b中输入管道1a中，待液滴充满管道1a后将管道入口1b和管道出口1c封住。将含有液滴的微流控芯片1放上转轴2上，启动控制系统7，打开明场光源8和相机3m，控制系统7将实时显示检测区9的图像，此时需要将检测区的位置对准管道1a上。通过控制电动升降台6，调整管道1a与检测区9的垂直距离，使得检测区9与管道1a重合，此时控制系统7上显示的是管道1a清晰的图像。然后控制电动滑台4，将检测区9的水平移动，使得其中心与管道1a中心重合，完成对焦操作。

第三步是启动液滴荧光检测。完成对焦后，关闭明场光源8和相机3m，打开激光器3d和光电倍增管3k，同时启动电动旋转台5使芯片以1000r/min的速度旋转，开始液滴荧光检测。管道1a中的液滴经过数字式液滴PCR后，形成两种液滴，一种是包含了模板因而发生扩增反应的阳性液滴和不包含模板因而未发生扩增的阴性液滴，阳性液滴具有较强的荧光而阴性液滴则没有荧光。控制系统7将通过液滴检测传感器11来判断检测区内是否存在液滴，然后通过读取光电倍增管3k的信号，判断一个液滴是阴性还是阳性，并对液滴进行计数，荧光信号图如图6所示，此时液滴检测速度达到了大约每秒5万个的速度。这样，在芯片旋转一圈后，相同半径的管道上的液滴荧光就被检测完了，此时控制系统7自动控制电动滑台4，将检测区9移动至另一个半径的圆弧管道上并完成液滴荧光检测。同样就能完成整个芯片的液滴荧光检测。

应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。

本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。