大型溞流水式毒性试验装置的制作方法

本发明属于生态毒理学实验领域，具体涉及一种大型溞流水式毒性试验装置。

背景技术：

大型溞(Daphnia magna Straus)属于节肢动物门、甲壳纲、枝角类，是常见的浮游甲壳动物，是淡水食物链中不可缺少的组成成分。因其生活周期短、生长快、生殖量高、易培养、对水环境胁迫敏感等特点使其成为国内外实验室广泛使用的模式生物，在农药、化学品的急慢性毒性和环境激素效应的测试方面具有重要的作用。

目前欧洲经合组织（OECD）、欧盟、美国、日本、韩国和我国等多个国际组织和国家均已形成系统化的大型溞毒理测试标准方法。为了保证试验的科学性、有效性和试验结果的可比性，这些方法大多要求确认受试物质在整个测试周期的测试体系中能否保持相对稳定（即实测浓度不低于初始浓度或配制浓度的80%）。若受试物质相对稳定，毒性暴露试验采取一般的静态法（整个测试周期内不更新溶液）开展即可；否则须采用半静态法（定期更新溶液）或流水式试验方法。由于半静态法最大溶液更新频率一般只能达到24h，对于易水解、易挥发、易光解等的不稳定受试物质，若其降解半衰期小于24h，则必须借助流水式试验方法。这种不稳定的受试物质属于“测试困难物质”（difficult substances），占工业化学物质和农药中间体的相当一部分，是水生态毒性测试的主要难题和影响测试准确性的重要因素。

此外，繁殖、发育等慢性毒性以及环境内分泌干扰性的致毒周期一般较长，须涵盖生物大部分生命周期或全生命周期。为了降低因受试物质降解或逸散对测试带来的偏差，研究化学物质慢性毒性、环境内分泌干扰性的水生态毒性测试也必须确保受试溶液在较长毒性测试周期内以较稳定的浓度对受试生物进行暴露。因此流水式试验方法也是解决化学物质慢性毒性、环境内分泌干扰性研究试验关键问题的重要技术。

所谓流水式试验方法，是保持受试溶液自动更新，更新后溶液废弃不再进入测试体系。这一方法工作量极大，必须借助相关自动化仪器设备。而对于大型溞流水式毒性试验而言，相应的自动化设备除了须具备自动准确配制特定浓度受试溶液、自动更新受试溶液并考虑末端废液的处理之外，还需要满足大型溞这一小型枝角类生物的生存、繁殖条件和必要的观测、计数、取幼虫等试验操作要求。由于上述诸多复杂、精细、特殊的技术要求，目前市场上尚未出现符合要求的设备或装置，我国已开展大型溞毒性研究的实验室目前只能借助人工实现静态法、半静态法试验。这一方法不仅效率低，而且难以应对不稳定性“困难物质”的测试需求和化学物质慢性毒性、环境内分泌干扰性的水生态毒性长期研究需求。这对化学物质测试和科学研究带来较大困难和误差。

技术实现要素：

为了方便大型溞流水式毒性试验的顺利进行，本发明提供了大型溞流水式毒性试验装置。

所述试验装置包括溶液配制系统、溶液暂存系统、毒性暴露系统、溶液自动循环与补给系统、废液处理系统；所述溶液配制系统与溶液暂存系统、溶液暂存系统与毒性暴露系统之间分别通过溶液自动循环与补给系统相连，毒性暴露系统与废液处理系统相连；

所述溶液配制系统包括1套自动配液器、1个培养基贮存桶、1个Ⅰ级母液瓶、1个Ⅱ级母液瓶、1个助溶剂瓶、1个助溶剂对照配制瓶、1个空白对照配制瓶、5个受试溶液配制瓶，Ⅱ级母液瓶、助溶剂对照配制瓶、空白对照配制瓶、受试溶液配制瓶分别置于独立的磁力搅拌器上；

所述自动配液器包括3个双通路蠕动泵、2个单通路蠕动泵、1个液面传感器、1个螺杆传动机构，1个八通阀、一个PLC控制器；I级母液瓶的底部与Ⅱ级母液瓶口、Ⅱ级母液瓶的底部与第一个受试溶液配制瓶的瓶口通过同一个双通路蠕动泵的两个输液管相连；第一个受试溶液配制瓶的底部与第二个受试溶液配制瓶的瓶口、第二个受试溶液配制瓶的底部与第三个受试溶液配制瓶的瓶口通过同一个双通路蠕动泵的两个输液管相连；第三个受试溶液配制瓶的底部与第四个受试溶液配制瓶的瓶口、第四个受试溶液配制瓶的底部与第五个受试溶液配制瓶的瓶口通过同一个双通路蠕动泵的两个输液管相连；培养基贮存桶底部通过单通路蠕动泵的输液管、螺杆传动机构和八通阀分别与Ⅱ级母液瓶、助溶剂对照配制瓶、空白对照配制瓶、5个受试溶液配制瓶；所述液面传感器置于Ⅱ级母液瓶上方；

所述溶液暂存系统包括1个助溶剂对照暂存瓶、1个空白对照暂存瓶、5个受试溶液暂存瓶，上述7个暂存瓶的入口分别与助溶剂对照配制瓶、空白对照配制瓶和5个溶液配制瓶的出口通过管道相连，管道上设有电磁阀；所有暂存瓶均为棕色玻璃材质，并设有顶盖，顶盖设孔供蠕动泵的输液管插入；所有试剂瓶分别置于独立的磁力搅拌器上，所述溶液暂存系统置于溶液配置系统下方；

所述溶液自动循环与补给系统包括2个液面传感器、1个自动电磁阀、1个七通路蠕动泵、1个PLC控制器，一个液面传感器安装在第5个受试溶液配制瓶中，另一个液面传感器安装在第5个溶液暂存瓶中；助溶剂对照配制瓶、空白对照配制瓶和5个溶液配制瓶分别通过所述七通路蠕动泵七根输液管与助溶剂对照暂存瓶、空白对照暂存瓶、5个受试溶液暂存瓶对应地独立联接，电磁阀安装在七根输液管中部，通过PLC控制器自动阻断水流或联通水流；

所述毒性暴露系统包括1个恒温水浴槽、1组光周期自动控制的光照、1个助溶剂对照测试缸、1个空白对照测试缸、5个受试溶液测试缸，上述7个测试缸置于恒温水浴槽中，所述7个测试缸的入口与上述相对应的7个暂存瓶通过七通路蠕动泵的七根独立输液管相连；

所述废液处理系统包括1层过滤棉和1层活性炭过滤柱，两者集成于封闭系统中，仅通过进水管与毒性暴露系统的各个测试缸出水孔相连。

具体的，所述溶液配制系统中的培养基贮存桶底部有万向轮，所有的试剂瓶均为棕色玻璃材质；培养基贮存桶和试剂瓶均有顶盖，顶盖设孔供蠕动泵的输液管插入。

具体的，所述测试缸均为透明玻璃材质，配顶盖，缸壁设有进水孔、出水孔，每个测试缸内放置10个小围筒和一个可拆卸的围筒架，围筒由不锈钢网制成，孔径60目~80目，上端开口；围筒架为开孔的玻璃板，孔数10个，孔径同围筒外径；围筒架架设高度略低于测试缸口，10个围筒从围筒架开口处插入测试缸，并保持围筒底部略高于缸底，围筒口略高于围筒架；进水孔和出水孔位于围筒架下方，其中进水孔靠近测试缸底，出水孔靠近围筒架，且进水孔、出水孔分别位于测试缸相对的、直线距离最远的缸壁两端。

具体的，所述的PLC控制器的控制方法如下：

启动PLC控制器上的“开始”键或Ⅱ级母液瓶上方的液面传感器发出低于警戒值的信号时，泵从I级母液瓶中吸取溶液加入Ⅱ级母液瓶中；调用螺杆传动机构将八通阀出口对准Ⅱ级母液瓶，从培养基贮存桶中吸取M7培养基并加入Ⅱ级母液缸中；20min后从Ⅱ级母液瓶中吸取溶液并加入第一个受试溶液配制瓶中，八通阀出口对准第一个受试溶液配制瓶，从培养基贮存桶中吸取M7培养基并加入第一个受试溶液配制瓶；20min后从第一个受试溶液配制瓶中吸取溶液并加入第二个受试溶液配制瓶中，再从培养基贮存桶中吸取M7培养基并加入第二个受试溶液配制瓶；20min后，从第二个受试溶液配制瓶中吸取溶液加入第三个受试溶液配制瓶中，再从培养基贮存桶中吸取M7培养基并加入第三个受试溶液配制瓶中；20min后从第三个受试溶液配制瓶中吸取溶液加入第四个受试溶液配制瓶中，再从培养基贮存桶中吸取M7培养基并加入第四个受试溶液配制瓶中；20min后从第四个受试溶液配制瓶中吸取溶液加入第五个受试溶液配制瓶中，再从培养基贮存桶中吸取M7培养基并加入第五个受试溶液配制瓶中；然后从溶剂瓶中吸取溶剂加入溶剂对照配制瓶中，再从培养基贮存桶中吸取M7培养基并加入溶剂对照配制瓶中；从培养基贮存桶中吸取M7培养基并加入空白对照配制瓶中；

当第5个受试溶液暂存瓶上方的液面传感器发出液面低于警戒值的信号时，程序将电磁阀打开，5个溶液配制瓶、空白对照配制瓶、溶剂对照配制瓶依靠重力作用分别进入5个溶液暂存瓶、空白对照暂存瓶、溶剂对照暂存瓶；当第5个溶液配制瓶上方的液面传感器发出液面低于警戒值的信号时，程序将电磁阀关闭，配制缸与暂存缸中液体阻断；然后从Ⅱ级母液瓶中吸取溶液并加入第一个受试溶液配制瓶中，调用螺杆传动机构将八通阀出口对准第一个受试溶液配制瓶，从培养基贮存桶中吸取M7培养基并加入第一个受试溶液配制瓶；20min后从第一个受试溶液配制瓶中吸取溶液并加入第二个受试溶液配制瓶中，再从培养基贮存桶中吸取M7培养基并加入第二个受试溶液配制瓶；20min后，从第二个受试溶液配制瓶中吸取溶液加入第三个受试溶液配制瓶中，再从培养基贮存桶中吸取M7培养基并加入第三个受试溶液配制瓶中；20min后从第三个受试溶液配制瓶中吸取溶液加入第四个受试溶液配制瓶中，再从培养基贮存桶中吸取M7培养基并加入第四个受试溶液配制瓶中；20min后从第四个受试溶液配制瓶中吸取溶液加入第五个受试溶液配制瓶中，再从培养基贮存桶中吸取M7培养基并加入第五个受试溶液配制瓶中；然后从助溶剂瓶中吸取溶剂加入助溶剂对照配制瓶中，再从培养基贮存桶中吸取M7培养基并加入助溶剂对照配制瓶中；从培养基贮存桶中吸取M7培养基并加入空白对照配制瓶中；

溶液通过七通路蠕动泵不间断地从溶液暂存瓶泵入测试缸，超出测试缸容量的测试溶液不断从出水口排出到废液处理系统。

本装置的有益效果是：

1、实现特定浓度受试溶液的自动配制；

2、实现受试溶液的流水式自动更新和补给；

3、测试缸的密闭式设计可以降低试验溶液的挥发损失，对于维持测试缸内水温稳定也有重要作用；不锈钢小围筒采用惰性材料制成，避免试验材料对多数测试药物产生化学作用而干扰其毒性；小围筒和围筒架的设计在方便用户取放的同时，实现大型溞在流水式条件下与受试溶液的充分接触并完成发育、繁殖等生命过程，同时避免母溞和幼溞的逃逸与机械性损伤。且围筒底部和四周均不与测试缸壁接触，最大限度维持围筒内部生物活动区域之间水温低差异，且不受测试缸外部水温波动的影响；整个测试缸的设计便于用户对每个小围筒中的溞类繁殖、死亡情况进行观测计数，有标识的围筒架可避免用户对不同小围筒重复计数或观测结果互相混淆；测试完成后整个测试缸可拆卸的设计也便于清洁。

4、实现大型溞在流水式条件下与受试溶液的充分接触并完成发育、繁殖等生命过程，同时避免母溞和幼溞的逃逸与机械性损伤。

5、实现试验废水的过滤、吸附等处理，减少环境危害。

6、实验装置便于试验操作、成本低，易于实验室推广。

附图说明

图1 整体装配图的外部视图。

图2 整体装配图的内部视图。其中：

图3 测试缸细节图。其中：

图4 废液处理系统细节图。

其中：1. 培养基贮存桶，2.溶液配制室，3.溶液暂存室，4.毒性暴露室，5. PLC控制器，6.传动机械室，7.废液处理室，8.万向轮，9.把手，10.溶液配制瓶，11.溶液暂存瓶，12.磁力搅拌器，13.恒温水浴槽，14.测试缸，15.光周期自动控制的光照 16.蠕动泵，17.废液处理系统，18.不锈钢网小围筒，19.进水口，20.出水口，21.穹顶盖，22.围筒架，23.围筒插孔，24.进水口，25.上层储水层，26.过滤棉，27.活性炭过滤柱，28.出水口。

具体实施方式：

以下结合附图对本发明做进一步详细说明。

实施例1

如图1所示的大型溞流水式毒性试验装置，其中各符号或字母表示如下：1为培养基贮存桶，用于储存大型溞培养基；2为放置溶液配制系统的溶液配制室，不同浓度试验溶液在此处完成配制，溶液配制系统包括试剂瓶（I级母液瓶、II级母液瓶、溶剂瓶、助溶剂对照配制瓶、空白对照配制瓶、受试溶液配制瓶）、磁力搅拌器、蠕动泵、PLC控制器；3为放置溶液暂存系统的溶液暂存室，配制好的试验溶液在此处暂存并充分均质化，溶液暂存系统包括试剂瓶（助溶剂对照暂存瓶、空白对照暂存瓶、受试溶液暂存瓶）和磁力搅拌器；4为放置毒性暴露系统的毒性暴露室；5为PLC控制器；6为用于放置蠕动泵、螺杆传动机构、电磁阀等设备的传动机械室；7为用于放置废液处理系统的废液处理室；8为万向轮，方便整套装置的移动；9为各个分室外部小门的把手；10为溶液配置系统的溶液配制瓶，用于配制溶液；11为溶液暂存系统的溶液暂存瓶，用于溶液暂存和均质化；12为磁力搅拌器，用于溶液配制和均质化过程中的溶液搅拌；13为毒性测试系统的恒温水浴槽，用于维持测试系统的温度；14为毒性测试系统的测试缸，用于大型溞的毒性暴露；15为毒性测试系统中可自动控制光周期的光照；16为溶液配制系统、溶液自动循环与补给系统中所需的蠕动泵等设备；17为废液处理系统；

图2为毒性暴露系统中测试缸的细节图，其中各符号或字母表示如下：18为不锈钢小围筒，是大型溞接受药物暴露并防止其逃逸的装置；19为进水口，用于不间断输入新鲜测试溶液；20为出水口，用于排出溢出的测试溶液；21为穹顶盖，用于减少测试溶液挥发损失及减少测试人员的药物接触；22为围筒架，用于支撑不锈钢围筒；23为围筒架上的插孔，用于插入小围筒；R1~R10为10个围筒插孔的编号，可依次插入10个小围筒，作为同一浓度处理组的10个平行；

图3为废液处理系统细节图，其中各符号或字母表示如下：24为进水口，用于收集从毒性暴露系统的测试缸中产生的实验废液；25为上层储水层，用于储存由测试缸排放的实验废液；26为过滤棉，用于对废液中大颗粒的初级过滤；27为活性炭过滤柱，用于对废液中药物的吸附净化；28为出水口，用于排放处理后的出水。

该装置各个主要构件的名称及尺寸如下：

培养基贮存桶1：不锈钢材质，直径60 cm，高度85 cm，容积120 L；

溶液配制室2：不锈钢材质，长度80cm，宽度70cm，高度50cm；

溶液暂存室3：不锈钢材质，长度60cm，宽度70cm，高度50cm；

毒性暴露室4：长度100cm，宽度70cm，高度60cm；

PLC控制器5：长度20cm，宽度70cm，高度60 cm；

传动机械室6：不锈钢材质，长度40cm，宽度70cm，高度60 cm；

溶液配制瓶10和溶液暂存瓶11（I级母液瓶、II级母液瓶、溶剂瓶、助溶剂对照配制瓶、空白对照配制瓶、受试溶液配制瓶和助溶剂对照暂存瓶、空白对照暂存瓶、受试溶液暂存瓶）：棕色比例材质，顶盖开孔可插入输液管，容积1L，直径10cm，高度23cm；

磁力搅拌器12：长度12cm，宽度15cm，高度7cm；

水浴槽13：不锈钢材质，长度100cm，宽度70cm，高度12cm；

测试缸14：玻璃材质，直径23cm，高度15cm，容积4L；

光照15：冷光源，可自动控制光周期，光强2000±300lux；

蠕动泵16：泵速范围0.02~200 mL/min，均设RS485通讯接口并支持MOUDBUS协议;

废液处理系统17：不锈钢外壳，长度55cm，宽度65cm，高度45 cm；

小围筒18：不锈钢网材质，直径50mm；网孔60目；高度70mm；

穹顶盖21：玻璃材质，直径23cm，顶高6cm；

围筒架22：玻璃材质，直径23cm；

围筒插孔23：直径51mm的圆孔；

废液处理系统进水口24：内部直径3cm；

上层储水层25：长65cm，宽度70cm，高度20cm；

过滤棉26；合成纤维材质；

活性炭过滤柱27：活性炭过滤柱，直径3cm，高度20cm；

废液处理系统出水口25：内部直径3cm。

实施例2

假定需要开展一项大型溞流水式毒性试验，测试浓度设计为：空白对照、助溶剂对照、0.1mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.8mg/L、1.6mg/L，浓度间隔系数为2.要求溶液更新频率不低于12h（即12h内须将测试缸中所有溶液更新一次）。环境条件控制须满足化学品测试导则（HJ/153-2004）以及《化学品测试方法》（第二版，中国环境出版社）的要求，采用本发明的实施方式如下：

（1）打开恒温水浴槽，将温度设定在20±1℃，打开光照并将光周期设定为16h（光）：8h（暗）。

（2）设定蠕动泵的程序如下：

蠕动泵1

程序1（P1P1）：通道1流速0.50mL/min，正向运行40min

程序2（P1P2）：通道2流速1.00mL/min，逆向运行50min

蠕动泵2

程序1（P2P1）：通道1流速100 mL/min，正向运行5.0 min

程序2（P2P2）：通道2流速100 mL/min，逆向运行5.0 min

蠕动泵3

程序1（P3P1）：通道1流速100 mL/min，正向运行5.0 min

程序2（P3P2）：通道2流速100mL/min，逆向运行5.0 min

蠕动泵4

程序1（P4P1）：流速100 mL/min，运行9.8 min

程序2（P4P2）：流速100 mL/min，运行9.5 min

程序3（P4P3）：流速100 mL/min，运行5.0 min

程序4（P4P4）：流速100 mL/min，运行5.0 min

程序5（P4P5）：流速100 mL/min，运行5.0 min

程序6（P4P6）：流速100 mL/min，运行5.0 min

程序7（P4P7）：流速100 mL/min，运行10 min

程序8（P4P8）：流速100 mL/min，运行10 min

蠕动泵5

程序（P5P）：流速0.05 mL/min，正向运行2.0 min

蠕动泵6

程序（P6P）：流速50.0 mL/min，正向运行直至试验结束。

（3）配制100mL 16g/L的受试物I级母液，装入I级母液瓶。同时配制Elendt M7培养基120L，装入培养基贮存桶。该受试物I级母液的量足够整个试验周期21d使用，除非受试物稳定性差，否则试验过程无需再次配制；该培养基的量可供给3d试验的耗用，因此仅需每3d配制一次。

（4）启动PLC控制器中的PLC程序，系统即开始配制测试溶液（此过程大概需要160min），溶液配制完成后将自动进入溶液暂存系统（此过程大概需要10min），然后自动连续泵入各个不同测试浓度的测试缸中（此过程大概需要60min），超出测试缸容量的测试溶液不断从出水口排出到废液处理系统，废液处理系统进行过滤、吸附处理后将出水排出。由此一个完整的溶液配制和分配过程需要250min，每个浓度测试缸溶液可更新1.0L。因此全部完成测试缸3L溶液的更新最多需要11.5 h（实际时间更少，因II级母液不需要每次都重新配制，该过程单次耗时40min），满足12 h内完成所有测试缸溶液更新的要求。

（5）当测试缸内充满测试溶液后，将龄期6~8小时的健康活泼幼溞放入毒性暴露系统的小围筒，每个小围筒内放1只溞。盖上穹形盖，试验正式开始。

（6）试验过程中，每天打开穹形盖，观察母溞存活、繁殖以及幼溞存活情况，及时移除幼溞。同时每日向小围筒内加入绿藻浓缩液饲喂亲溞。观测和饲喂时，可转动测试缸中的托盘，将被观测的小围筒转至观测者易操作的位置，同时根据托盘上R1~R10的编号进行记录，避免错记漏记。

（7）当溶液暂存系统中的溶液用完时，系统自动启动新一轮的溶液配制和传输过程，保证溶液的不断更新，直到21d试验结束。