一种用于微藻毒性试验的微流控芯片系统的制作方法
【专利摘要】本发明目的在于提供一种用于微藻毒性试验的微流控芯片系统，通过规模集成芯片的制作和芯片上多种单元技术的灵活组合，将常规的微藻的培养、重金属的多浓度条件的施加、细胞受胁迫和生物效应指标的测定等过程集成在一块芯片上完成；该系统基本由两部分基本单元构成：第一个基本单元为以微藻为受试对象的水体重金属毒性评价微流控芯片，第二个基本单元为微流控芯片外围设备。
【专利说明】一种用于微藻毒性试验的微流控芯片系统
【技术领域】
[0001]本发明涉及到微流控芯片技术与环境生态领域，特别提供了一种适于简单、快速进行微藻毒性试验的微流控芯片系统。
【背景技术】
[0002]现阶段，水体环境污染评价中面临着受试污染物种类众多、多浓度梯度的毒性考察所导致的工作量巨大，待测样品毒性评价过程中采集、预处理过程繁琐，分析、测定困难，所需仪器昂贵等问题。微流控芯片实验室作为本世纪一项重要的科学技术，已可控流体贯穿系统，通过将常规实验室操作单元规模集成和灵活组合，可以很好的解决目前水环境污染评价过程中诸多实验分析问题，从而提供一种通量高、集成化和低成本的实验平台。
[0003]实验室微藻类试验(包括急性毒性试验和慢性毒性试验)被广泛用来评价海洋污染的生物毒性效应。除了某些生理标志物(光合作用、某些酶和蛋白含量等)可以作为反应终点外，运动性也是一个有效的生理指标。微流控芯片与微藻尺寸匹配，适于构建微小的流体环境，因此将以微藻作为研究对象的实时观测研究变为可能，并已在相关领域取得了较好的研究进展。随着研究的不断深入，微流控芯片系统或可成为微藻研究的重要平台技术之一，为微藻研究相 关的生物工程、生态毒理及环境监测等方面提供技术与理论的支持。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是通过微流控芯片的制作和芯片上多种单元技术的灵活组合，将常规的微藻类培养、污染物多浓度条件的施加、细胞受胁迫、细胞活性、状态等效应指标的测定等过程集成在一块芯片上完成，从而构建一种适于简单、快速进行微藻毒性试验的微流控芯片系统；以解决目前水体污染毒性和生态风险评价过程中工作量大，实验过程繁琐，分析测定困难以及仪器设备昂贵等诸多问题。
[0005]本发明提供了一种用于微藻毒性试验的微流控芯片系统，该芯片系统由两个基本单元构成，第一个基本单元为微流控芯片，由污染物添加单元和微藻培养单元构成；第二个基本单元为微流控芯片外围设备。
[0006]本发明提供的用于微藻毒性试验的微流控芯片系统，所述微流控芯片设计为上、下两层正方形芯片结构；上层为盖片，具有微通道、细胞接种入口、污染物蓄液池和废液出口 ；下层通过软刻蚀技术产生污染物流路通道和微藻培养室。
[0007]本发明提供的用于微藻毒性试验的微流控芯片系统，所述微流控芯片使用的材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
[0008]本发明提供的用于微藻毒性试验的微流控芯片系统，所述微藻培养室与污染物流路通道之间通过微通道连通；所述微通道的深度为2微米~5微米，要求小于受试微藻直径与厚度，可在拦截悬浮细胞的同时，通过扩散作用实现化学物质的自由交换。
[0009]本发明提供的用于微藻毒性试验的微流控芯片系统，所述微流控芯片外围设备为微量注射泵，微量注射泵与微流控芯片上层的废液出口处相连，并以连续倒退吸取的方式维持污染物和营养物质的持续供给。
[0010]本发明提供的用于微藻毒性试验的微流控芯片系统，所述微藻培养单元同时也做为微藻的实时观测单元，可同时实现各种类型微藻的培养和微藻运动性响应的检测功能。
[0011]本发明提供的用于微藻毒性试验的微流控芯片系统，通过规模集成芯片的制作和芯片上多种单元技术的灵活组合，将常规的微藻的培养、污染物的多浓度条件的施加、细胞受胁迫和生物效应指标的测定等过程集成在一块芯片上完成；该系统基本由两部分基本单元构成:第一个基本单元为以微藻为受试对象的水体重金属毒性评价微流控芯片，第二个基本单元为微流控芯片外围设备。
[0012]其中用于微藻毒性试验的微流控芯片采用PDMS软刻蚀及不可逆封接技术构建的双层微流控芯片:芯片下层为液体流路层，包括污染物流路通道和微藻培养室结构，其中污染物的添加是通过芯片上层中心处废液出口外接微量注射泵，并以连续倒退吸取的方式维持污染物多浓度的平行、持续供给；微藻培养室单元为8X3细胞培养池阵列，可完成多组平行试验，微藻培养单元同时也做为微藻实时观测单元可同时实现各种类型微藻的培养和微藻运动性响应的检测等功能；芯片上层为盖片，具有具有微通道、细胞接种入口、污染物蓄液池和废液出口结构。
[0013]本发明提供的用于微藻毒性试验的微流控芯片系统，所述微流控芯片外围设备是用于微藻毒性试验的微流控芯片实现各功能的外部支持及微藻运动行为分析的检测装置，主要包括微量注射泵、显微镜和Nikon5100相机系统及相关分析软件等。由外接微量注射泵以连续倒退抽取的方式维持污染物多浓度的平行、持续供给。
[0014]本发明提供的用于微藻毒性试验的微流控芯片系统，以微藻运动性为生物效应指标，通过对芯片上污染物不同作用浓度以及相应条件下微藻运动性参数的分析，判定水体污染物的生物毒性效应。
[0015]本发明提供的用于微藻毒性试验的微流控芯片系统，其优点在于:快速、集成化和成本低，是一种进行微藻毒性试验的新平台。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为微流控芯片结构示意图，其中，I为芯片上层，2为芯片下层，，3为污染物蓄液池(X8)，4为细胞接种入口(X8)，5为微藻培养室(8X3)，6为废液出口，7为微通道；
[0017]图2为微通道结构侧视图，其中，I为芯片上层，2为污染物流路通道，3为芯片下层，4为微藻培养室,5为微通道；
[0018]图3重金属Cu作用下微藻运动行为轨迹变化图，其中，I为10μΜ，2为5.7μΜ，3为 11.4 μ Μ，4 为 17.1 μ Μ，5 为 22.9 μ Μ，6 为 28.6 μ Μ，7 为 34.3 μ Μ，8 为 40.0 μ M ;
[0019]图4重金属Cu作用下微藻能动百分比(Μ0Τ%)变化；
[0020]图5重金属Cu作用下微藻运动曲线速度(VCL)变化；
[0021]图6重金属Cu作用下微藻运动平均路径速度(VAP)变化；
[0022]图7重金属Cu作用下微藻运动直线速度(VSL)变化。
【具体实施方式】
[0023]下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。[0024]实施例1
[0025]利用实验室自行设计并制作的微流控芯片系统，构型如图1和图2所示，接种微藻(本实施例选用青岛大扁藻)，接种密度lX105cell/mL。在芯片上层通过芯片蓄液池内添加重金属Cu由低到高八个浓度，分别为O μ M、5.7 μ M、11.4 μ M、17.1 μ Μ、22.9 μ Μ、28.6 μ Μ、34.3 μ Μ、40.0 μ M ;同时以微量注射泵与微流控芯片上层的废液出口处相连，并以连续倒退吸取的方式维持多浓度污染物平行、持续供给。污染物流路内Cu浓度通过微通道(见图2)扩散作用迅速与培养室内达到平衡。经过2小时刺激后，Nikon5100相机摄像30s(25frame/s)，CASA软件分析。微藻的运动性为和轨迹对重金属Cu的相应结果如图3所示，分析范围为ΟμΜ~40.0μΜ。藻体状态良好时，能够自由翻转，无目的随机运动。水体受到污染后，藻类受到重金属毒害或损伤，自由翻转不再顺畅，运动轨迹变成直线；进一步毒性加重够，
22.9μΜ以上的Cu使藻的运动行为变成原地打转，震颤，最后失去运动能力。
[0026]实施例2
[0027]利用实验室自行设计并制作的微流控芯片系统，构型如图1所示，接种微藻(本实施例选用青岛大扁藻)，接种密度lX105cell/mL。在芯片上层通过芯片蓄液池内添加重金属(本示例选用Cu)由低到高八个浓度，分别为O μ M、5.7 μ M、11.4 μ M、17.1μΜ、22.9μΜ、28.6 μ Μ、34.3 μ Μ、40.0 μ M ;同时以微量注射泵与微流控芯片上层的废液出口处相连，并以连续倒退吸取的方式维持多浓度污染物平行、持续供给。流路内重金属浓度通过扩散作用迅速与培养室内达到平衡。经过2小时刺激后，Nikon相机摄像30s (25frame/s), CASA软件分析。Cu作用下微藻能动百分比(Μ0Τ%)变化如图4所示，分析范围为O μ M~28.6 μ M。以能动百分比(Μ0Τ%) 做为Cu毒性评估，其EC5tl值为13.02 μ Μ。
[0028]实施例3
[0029]利用实验室自行设计并制作的微流控芯片系统，构型如图1所示，接种微藻(本实施例选用青岛大扁藻)，接种密度lX105cell/mL。在芯片上层通过芯片蓄液池内添加重金属(本实施例选用重金属Cu)由低到高八个浓度。经过2小时刺激后，Nikon相机摄像30s(25frame/s), CASA软件分析。Cu作用下微藻运动曲线速度(VCL)变化如图5所示,分析范围为O μ M~28.6 μ M。以曲线速度(VCL)做为Cu毒性评估的效应参数时，其EC5tl值为
17.96 μ Mo
[0030]实施例4
[0031]利用实验室自行设计并制作的微流控芯片系统，构型如图1所示，进行Cu毒性试验。接种微藻(本实施例选用青岛大扁藻)，接种密度IX 105cell/mL。经过2小时重金属刺激后，Nikon相机摄像30s (25frame/s), CASA软件分析。Cu作用下微藻运动平均路径速度(VAP)变化如图6所示，分析范围为O μ M~17.1 μ M。以平均路径速度(VAP)做为Cu毒性评估的效应参数时，其EC5tl值为16.69 μ M0
[0032]实施例5
[0033]利用实验室自行设计并制作的微流控芯片系统，构型如图1所示，进行Cu毒性试验。接种微藻(本实施例选用青岛大扁藻)，接种密度lX105cell/mL。经过2小时重金属刺激后，Nikon相机摄像30s (25frame/s), CASA软件分析。Cu作用下微藻运动直线速度(VSL)变化如图7所示，ΟμΜ~22.9μΜ，其EC5tl值为31.6 μ Μ，但相对误差较大。
【权利要求】
1.一种用于微藻毒性试验的微流控芯片系统，其特征在于:该微流控芯片系统由两个基本单元构成， 第一个基本单元为微流控芯片，由污染物添加单元和微藻培养单元构成； 第二个基本单元为微流控芯片外围设备。
2.按照权利要求1所述的用于微藻毒性试验的微流控芯片系统，其特征在于:所述微流控芯片设计为上、下两层正方形芯片结构；上层为盖片，具有微通道、细胞接种入口、污染物蓄液池和废液出口 ；下层通过软刻蚀技术产生污染物流路通道和微藻培养室。
3.按照权利要求1或2所述的用于微藻毒性试验的微流控芯片系统，其特征在于:所述微流控芯片使用的材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
4.按照权利要求2所述的用于微藻毒性试验的微流控芯片系统，其特征在于:所述微藻培养室与污染物流路通道之间通过微通道连通。
5.按照权利要求4所述的用于微藻毒性试验的微流控芯片系统，其特征在于:所述微通道的深度为2微米~5微米。
6.按照权利要求1所述的用于微藻毒性试验的微流控芯片系统，其特征在于:所述微流控芯片外围设备由外接微量注射泵以连续倒退抽取的方式维持污染物的平行、持续供 5口 O
7.按照权利要求6所述的用于微藻毒性试验的微流控芯片系统，其特征在于:所述微量注射泵与微流控芯片上层的废液出口处相连。
8.按照权利要求1所述的用于微藻毒性试验的微流控芯片系统，其特征在于:所述微藻培养单元同时也做为微藻实时观测单元，可同时实现各种类型微藻的培养和微藻运动性响应的检测功能。
9.权利要求1所述的用于微藻毒性试验的微流控芯片系统的应用，其特征在于:以微藻运动性为生物效应指标，通过对芯片上污染物不同作用浓度以及相应条件下微藻运动性参数的分析，判定水体污染物生物的毒性效应。
【文档编号】C12M1/34GK103468569SQ201210189408
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2012年6月8日 优先权日:2012年6月8日
【发明者】秦建华, 郑国侠 申请人:中国科学院大连化学物理研究所