动脉粥样硬化易感基因无创检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种检测动脉粥样硬化易感基因无创检测试剂盒。该试剂盒包括检测ACE基因上I/D(rs4646994)、MTHFR基因上C677T(rs1801133)、LPL基因上HindIII(rs320)的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、PCR反应组件、PCR产物纯化组件、DNA测序反应组件等。本发明的试剂盒通过检测与动脉粥样硬化发生密切相关的3个单核苷酸多态性位点的基因型从基因层面来评估动脉粥样硬化发病的风险级别，指导人群提早预防疾病的发生。本发明采样方法是口腔黏膜细胞采样，无痛、无创、避免了交叉感染。测序检测结果准确，可靠，不必购置价格昂贵的进口专用仪器，方法易普及推广。
【专利说明】动脉粥样硬化易感基因无创检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本专利属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种动脉粥样硬化易感基因无创检测试剂盒，根据检测结果从基因层面评估动脉粥样硬化遗传易感性的风险级别，并作为预防动脉粥样硬化的建议指导。
【背景技术】
[0002]动脉硬化是以动脉壁增厚、变硬和弹性减退为特征的一类血管病。动脉粥样硬化属于其中最为常见且危害性最大的一类。其主要特征为受累动脉内膜出现脂类和复合糖类的沉着和积聚，并出现纤维组织增生和钙质沉着。由于动脉内积聚的脂类物质成黄色小米粥样，故而被称为动脉粥样硬化。常常会导致血栓形成和供血障碍等，严重时可导致由受累动脉负责供血的组织或器官缺血甚至坏死，是目前老年人病死的主要原因之一。
[0003]动脉粥样硬化通常是由于脂肪代谢紊乱以及神经血管功能失调所引起的。其发生除了肥胖、吸烟、缺乏运动以及患有高血压、高血脂等原因外，遗传因素也是不容忽视的重要因素。有统计结果表明，许多动脉粥样硬化的患者都有动脉粥样硬化、糖尿病以及肿瘤病和精神分裂症等家族病史。有研究结果也显示血管紧张素转化酶(ACE )、脂蛋白脂酶(LPL)、亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)等基因的多态性均与动脉粥样硬化的发生、发展有直接关联。
[0004]肾素-血管紧张素系统在动脉粥样硬化的发生与发展中扮演着重要的角色。其中的血管紧张素转化酶(ACE )负责将血管紧张素I转化为有生物活性的血管紧张素II。ACE第16内含子中由287个碱基对组成的Alu重复序列的存在(I)或缺失(D)被称为插入/缺失(Ι/D)多态性。该多态性是决定循环ACE活性的主要因素。ACE的DD基因型可导致较高水平的血管紧张素II，从而导致纤溶酶原激活物抑制物I的水平增高，继而促使血栓形成，被视为动脉早期粥样硬化的一种潜在危险因素。
[0005]脂蛋白脂酶(LPL)是脂类代谢的关键酶，主要负责水解极低密度脂蛋白和乳糜微粒中的甘油三酯。转化产生的小分子脂肪酸可供各组织贮存、利用。在动脉粥样硬化过程中，LPL发挥着双重的作用。一方面，LPL可以降低血浆中的甘油三酯并增加高密度脂蛋白水平，从而可以抑制动脉粥样硬化。但同时，血管壁上的LPL所产生的富含胆固醇的裂解产物及脂肪酸被巨噬细胞摄取后可转变为泡沫细胞，且还会刺激血管壁平滑肌细胞增生使动脉壁变厚，加速动脉粥样硬化的形成。位于LPL内含子8区的/Ziz7i/ III酶切位点多态性已发现与动脉粥样硬化有密切关联。Hind III (+/+)的基因型频率在患者中要显著高于对照组。但其对动脉粥样硬化的具体影响机制目前仍存在争议。多数研究认为IIK+/+)基因型会导致血浆中甘油三酯水平上升，使动脉壁增厚。[0006]亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是同型半胱氨酸(Hcy)代谢途径中的关键酶。MTHFR基因的第677位C — T突变(C677T)会使编码的氨基酸从缬氨酸变为丙氨酸，从而影响酶的活性及热稳定性并使血浆中同型半胱氨酸浓度升高。而高Hcy血症是动脉粥样硬化的一个独立危险因素。因此MTHFR也属于动脉粥样硬化的易感基因之一。[0007]建立简单、快速的动脉粥样硬化易感基因无创检测方法，能够用于检测与动脉粥样硬化发生相关的基因单核苷酸位点基因型，及时筛查出易患动脉粥样硬化的高危人群，从而根据检测结果尽早采取预防措施，这对于降低动脉粥样硬化发病率有非常重要的意义。
【发明内容】
[0008]基于ACE 基因上 I/D (rs4646994)、MTHFR 基因上 C677T(rsl801133)、LPL 基因上HindIII (rs320)的3个单核苷酸多态性位点基因型可用来评估动脉粥样硬化发病风险级另O，本发明提供一种动脉粥样硬化基因无创检测试剂盒。
[0009]该试剂盒包括:
检测 ACE 基因上 I/D (rs4646994)、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、LPL 基因上HindIII (rs320)的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物；
PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)；
PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；
DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20 等)。
[0010]本发明试剂盒的组分和含量包括:
PCR 反应体系:10 XPCR 反应缓冲液 2.5ul ；25mM dNTP 混合液 0.2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul ;20uM特异性引物对(每条引物各0.25ul) ；ddH20 19.175ul ；
PCR 产物纯化体系:lU/ul SAP 酶 0.75ul ；10U/ul ExoI 酶 0.375ul ；ddH20 3.875ul ；测序反应体系:25%BigDye mix lul ；3.2uM DNA 测序引物 lul ；125mM EDTA 溶液 lul ；100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH20 2ul ；
本试剂盒供一人份检测使用，试剂盒的保存温度为_20°C。
【具体实施方式】
[0011]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0012]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0013]实施例1.检测试剂盒的使用。
[0014]1、抽提DNA模板
刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。
[0015]2、PCR扩增反应
使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对:
(I)ACE ( I/D)正向引物:5’ CTGGGCAACAGAGTGAGACC3’
ACE ( Ι/D)反向引物:5’ ACCCAAGTGCCAGTGATGTT3’
(2 ) MTHFR (C677T )正向引物:5’ AGGGAGGCTTCAACTACGC3’MTHFR (C677T)反向引物:5’GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3’
(3)LPL (HindIII)正向引物:5’TCATTTGGCACTGTTTCTTGT3’
LPL (HindIII)反向引物:5’CTTATGTTACTGGGCTTTCACC3’
PCR扩增的反应体系为:10XPCR反应缓冲液2.5ul ;25mM的dNTP混合液0.2ul、5U/ul Taq 酶 0.125ul、DNA 模板 lul (12_15ng 左右)、20uM 正向引物反向引物各 0.25ul、ddH2019.175ul ；
反应条件为:94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 30秒变性，55°C 30秒退火，72°C I分钟延长，循环28次，最后72°C延长5分钟以上。
[0016]3、PCR扩增产物纯化
使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物20ul，lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 0.375ul，去离子水 3.875ul。
[0017]在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min，72°C、20min。
[0018]4、DNA测序反应
使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物:
(1)ACE ( Ι/D)测序引物:5’ CTGGGCAACAGAGTGAGACC3’
(2)MTHFR (C677T)测序引物:5’AGGGAGGCTTCAACTACGC3’
(3)LPL (HindIII)测序引物:5’ TCATTTGGCACTGTTTCTTGT3’
反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物lul，25%Bigdye mixlul, 3.2uM DNA测序引物lul，去离子水2ul。
[0019]在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98°C 2min，进行25个循环的960C 30s,55°C 30s, 60°C 4min。
[0020]反应结束后加入125mM EDTA溶液Iul和100%乙醇溶液15ul，于室温下沉淀15min ;在4°C , 3600rpm/min的转速离心30min,轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul,3600rpm/min离心15min,轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入测
序仪中。
[0021]5、基因型分析
熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的SNP位点的基因型。
[0022]实施例2.为人群进行预防动脉粥样硬化基因无创检测的服务。
[0023]1.采样及抽提DNA
由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用酚氯仿法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。
[0024]2.基因型检测
使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的ACE基因上I/D (rs4646994) ,MTHFR基因上C677T(rsl801133)、LPL基因上HindIII (rs320)的3个单核苷酸多态性位点分别进行DNA测序，确定这3个SNPs位点的基因型。
[0025]3.动脉粥样硬化高危人群风险评估分析
通过对受检者SNPs基因型的分析，出具动脉粥样硬化风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者 ACE 基因上 I/D (rs4646994)、MTHFR 基因上 C677T(rsl801133)、LPL 基因上HindIII (rs320)的3个SNP位点基因检测信息以及遗传风险评估结果。除此之外，根据受检者的风险级别，并由医师向受检者详细说明和解读动脉粥样硬化基因无创检测报告 单。
【权利要求】
1.一种筛查动脉粥样硬化高危人群的基因无创检测试剂盒，其特征在于:检测ACE基因上 I/D (rs4646994)、MTHFR 基因上 C677T(rsl801133)、LPL 基因上 HindIII (rs320)的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20 等。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述的特异性引物对是指针对ACE基因上 I/D (rs4646994)、MTHFR 基因上 C677T(rsl801133)、LPL 基因上 HindIII (rs320)的3个单核苷酸多态性位点，能特异性扩增出包含这3个SNPs位点的DNA片段的引物对。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述的DNA测序引物是针对ACE基因上 I/D (rs4646994)、MTHFR 基因上 C677T(rsl801133)、LPL 基因上 HindIII (rs320)的 3个单核苷酸多态性位点而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出上述3个SNPs位点基因型的DNA测序引物。
4.根据权利要求1所示的试剂盒，其特征在于，所含的3对特异性引物序列如下: (I) ACE ( I/D)正向引物:5’ CTGGGCAACAGAGTGAGACC3’ ACE ( Ι/D)反向引物:5’ ACCCAAGTGCCAGTGATGTT3’
(2 ) MTHFR (C677T )正向引物:5’ AGGGAGGCTTCAACTACGC3’ MTHFR (C677T)反向引物:5’GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3’ (3)LPL (HindIII)正向引物:5’TCATTTGGCACTGTTTCTTGT3’
LPL (HindIII)反向引物:5’CTTATGTTACTGGGCTTTCACC3’。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所含的3条DNA测序引物序列如下: (1)ACE ( Ι/D)测序引物:5’ CTGGGCAACAGAGTGAGACC3’ (2)MTHFR (C677T)测序引物:5’AGGGAGGCTTCAACTACGC3’ (3)LPL (HindIII)测序引物:5’ TCATTTGGCACTGTTTCTTGT3’。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括: (1)?0?反应体系:10父？0?反应缓冲液2.5111，251111dNTP 混合液 0.2ul，5U / ul TaqDNA聚合酶0.125ul，20uM特异性引物对，每条引物各0.25ul，ddH20 19.175ul ； (2)PCR 产物纯化体系:1 U / ul SAP 酶 0.75ul，10 U / ul ExoI 酶 0.375ul，ddH203.875ul ； (3)测序反应体系:25%BigDye mixlul，3.2uM DNA测序引物 lul，125mM EDTA溶液 lul，100% 乙醇溶液 15ul,70% 乙醇溶液 30ul, HIDI 溶液 8ul, ddH20 2ul。
7.本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为_20°C。
【文档编号】C12Q1/68GK103468788SQ201210188259
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2012年6月9日 优先权日:2012年6月9日
【发明者】郑俊斌 申请人:解码（上海）生物医药科技有限公司