一种用于开发包虫疫苗的免疫增强佐剂融合表达载体的制作方法
【专利摘要】开发无毒高效的疫苗需要良好的佐剂。研究表明，禽分枝杆菌在感染人畜时依靠其粘连蛋白结合蛋白(FBP)和肠上皮M细胞的粘连蛋白相结合而完成入侵过程；纯化的FBP免疫动物能诱导产生很强的免疫反应。因此，这种蛋白可以用于开发无毒高效的疫苗。常规方法是将病原的抗原蛋白和FBP混合后免疫动物。但是，分别大量产生病原抗原蛋白和FBP需要利用分子生物学手段来实现，过程繁琐，成本昂贵。因此，我们将包虫TSP3基因和FBP基因通过GSGGSG接头连接，导入pBAD/Thio-TOPO载体进行了融合表达。融合蛋白进行小鼠免疫实验表明，该项技术大大提高了免疫效果，节约了成本，为开发有效的抗包虫病疫苗提供了新的思路。
【专利说明】一种用于开发包虫疫苗的免疫增强佐剂融合表达载体
【技术领域】
[0001]该研究属于分子生物学，疫苗开发领域。
【背景技术】
[0002]肝包虫病是一种由棘球属绦虫的幼虫(棘球蝴)寄生在人畜肝脏引起的人畜共患寄生虫病，到目前为止尚没有开发出预防肝包虫病的疫苗。一个非常重要的原因是没有找到无毒高效的疫苗佐剂。研究表明:1)禽分枝杆菌副结核亚种在感染人畜时是依靠其粘连蛋白结合蛋白和肠上皮细胞(M细胞)的粘连蛋白相结合而完成入侵过程；2)分离纯化其粘连蛋白结合蛋白后免疫动物能诱导产生很强的免疫反应。这提示粘连蛋白结合蛋白具有佐剂效果，可以和包虫的抗原共同免疫动物诱导保护性免疫反应。分子生物学的发展使得我们能够通过聚合酶链式反应(PCR)将包虫抗原基因和牵连蛋白结合蛋白连接，然后通过表达载体表达重组蛋白，简化了分别表达和纯化这两种蛋白的过程，提高了免疫效果。
【发明内容】
[0003]在国际上首次用GSGGSG接头连接分枝杆菌副结核菌Qfycobac terium a vium )粘连蛋白结合蛋白(fibronectin-binding protein, FBP)结合域和包虫四旋蛋白(tetraspanin 3，TSP3)膜外大环区域(LEL)并克隆到pBAD/Thio-TOPO载体构建了具有免疫佐剂效果的重组表达载。将这种重组表达载体pBAD/Thio-TOPO转化到大肠杆菌后成功表达了融合蛋白。在纯化该融合蛋白并且黏膜(经口)免疫小鼠后，诱导产生了强烈的全身(血液)和局部(黏膜)免疫反应。这是由于抗原蛋白在与其融合的粘连蛋白结合蛋白的协同作用下容易结合到肠黏膜上的粘连蛋白上，然后通过上皮细胞(M细胞)诱发树突状细胞的活性，激发了肠管淋巴组织的免疫应答反应。这项研究为开发有效的抗包虫病疫苗提供了新的思路。
【专利附图】
【附图说明】
[0004]图1是表示融合表达载体的构成的图。1.包虫四旋蛋白(TSP3)和粘连蛋白结合蛋白(FBP)通过GSGGSG接头连接；2.基因在载体的插入位点；3.表达载体。
【权利要求】
1.一种具有免疫佐剂效果的重组表达载体，将通过GSGGSG接头连接的分枝杆菌副结核菌(Mycobacterium avium)粘连蛋白结合蛋白(fibronectin-binding protein,FBP)结合域和包虫四旋蛋白(tetraspanin 3, TSP3)膜外大环区域(LEL)插入到pBAD/Thio-TOPO载体构建而成。
2.根据权利要求1所述的FBP和包虫TSP3的连接，其特征是TSP3两端连接有Λ?/7?/ΙΙΙ和ZAoJ酶切位点，而这个含酶切位点的TSP3通过GSGGSG接头和FBP连接。
3.用历和通ο?酶切上述重组载体后仍保留有两酶切位点的粘端以及GSGGSG接头和FBP，任何具有对应酶切位点粘端的抗原基因都可以连接到此载体上构建重组表达载体。
【文档编号】C12N15/70GK103468734SQ201210187987
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2012年6月8日 优先权日:2012年6月8日
【发明者】党志胜, 冯金朝, 李伟, 王华东 申请人:党志胜