一种用于定量分析核酸的光导纤维传感器的制造方法
【专利摘要】本发明提供了平行对一种或多种核酸分子进行检测并实时定量分析的方法和装置，该方法和装置将固定有核酸探针的光导纤维嵌入到反应容器中，然后使光导入到光导纤维中，会在光导纤维表面形成倏逝场(evanescent?field)。倏逝场激发与光导纤维表面固定的探针相结合的目标产物上的荧光基团，而反应溶液中大量未结合的目标分子或是荧光基团几乎不被激发。通过检测荧光信号强度的变化来定量核酸分子的量。本发明的方法不需要多种荧光基团标记，不需要多个反应通道，因此成本低、检测的目标分子通量高。
【专利说明】—种用于定量分析核酸的光导纤维传感器
【技术领域】[0001]本发明属于生物【技术领域】；更具体地，本发明涉及在利用光导纤维(以下也简称光纤)传感器对核酸分子进行分析和检测的方法和装置。本发明的方法和装置可用于核酸的检测、基因诊断、基因序列分析、基因类型及多态性的分析、以及基因表达的分析等生物【技术领域】，特别是在基因检测的实时定量聚合酶链式反应(Real time quality PCR)、连接酶反应和阵列化的核酸检测领域。
【背景技术】
[0002]自从1985年，Kary Mullis发明聚合酶链式反应以来，聚合酶链式反应技术一下子成为了分子生物学发展以来最具影响力的技术革命之一。它使得核酸检测成为一种成熟的，高灵敏度，快速的检测技术，并且很快的广泛应用到分子生物学研究和微生物病原体体的临床检测中，包括真菌、细菌、病毒等的检测。Kary Mullis也因此于1993年获得了诺贝尔奖。
[0003]但是，聚合酶链式反应后需要烦琐的DNA电泳检测，并且由此容易产生样品相互之间的交叉污染。使得聚合酶链式反应对技术操作人员以及实验室要求很高，而且检测的错误率很高。聚合酶链式反应最终在临床检测的应用受到了挑战。
[0004]聚合酶链式反应可以结合上逆转录反应、连接酶反应等,使得聚合酶链式反应应用于核酸检测的多个方面。
[0005]到二十世纪九十年代的中后期，在聚合酶链式反应技术和荧光技术基础上发展起来的实时定量聚合酶链式反应(Real time quality PCR)技术，实现了 PCR从定性到定量的飞跃，减去了 DNA电泳检测，使得操作简便了一些，并且省去了 DNA电泳检测的时间。同时也使得交叉污染的机率降低了，提高了检测的准确性，并且能够更准确的量化被检测的核酸分子。这一技术的检测线形范围能达到7-9个数量级，灵敏度能检测到低到几个拷贝的核酸分子，精确性可以达到小于3%的偏差。它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具，并且开始被临床检测所接受。
[0006]临床微生物的检测是实时定量聚合酶链式反应技术现在在临床检测的最重要的领域，它比传统的临床微生物检测技术大大的缩短了检测时间，提高了检测的灵敏度，而且操作更加简便。目前，主要用于一些常见病毒，如HIV，HBV, HCV等的临床检测，或是难培养的细菌，如结核杆菌的检测上。在生命科学研究，特别是基因表达的定量分析上，实时定量聚合酶链式反应技术也有着非常广泛的应用。实时定量聚合酶链式反应技术同时也被应用在环境监测，公共卫生检测，生物武器检测等分析上。
[0007]但是，很多核酸检测需要检测和定量的核酸分子不止一种。而实时定量聚合酶链式反应技术又恰恰难进行多种核酸的平行检测和定量分析。很多生物技术公司，包括ABI，Invitrogen等，或是生物技术研究室都在试图开发多通量的核酸平行检测和定量分析技术。这些多种核酸的实时定量聚合酶链式反应技术，或是通过用多种不同光谱的荧光分子来标记不同的探针分子来检测不同的核酸分子，或者是在多个反应管道中分别进行多个实时定量聚合酶链式反应。而这些技术或是要求多种不同光波段的荧光分子，或是需要高密度的反应管道，使得原先就已经比较昂贵的实时定量聚合酶链式反应技术，其试剂和仪器成本成倍的增长。而且，它们的检测通量受到了荧光分子种类和反应管道体积的限制。
[0008]随着DNA芯片技术的兴起，平行地对多种核酸进行监测成为可能。但是生物芯片操作程序繁琐，人员要求高；检测重复性、准确性差；检测的时间长等因素，限制了芯片技术对多种核酸进行监测的应用。
[0009]因此，本领域中迫切需要提供改进的、操作简便的能同时对多种核酸分子进行实时定量检测的方法。
【发明内容】
[0010]为了克服上述缺陷，发明人经过深入研究，建立了能同时对一种或多种核酸分子进行实时定量检测的方法。
[0011]具体而言，本发明第一方面提供一种平行测定样品中多种核酸分子的存在或量的方法，该方法包括以下步骤:
[0012]a)提供一反应容器，所述反应容器中包含待检测的核酸分子和核酸反应液，在所述反应容器中进行核 酸反应，反应中对核酸反应产物标记上突光基团；
[0013]在所述反应容器内的的温度为可控，以控制所述核酸反应能在适宜的温度下进行。
[0014]b)提供一根或多根光导纤维，在所述的光导纤维上固定了多种识别核酸探针分子;
[0015]c)将所述光导纤维嵌入到反应容器中，使所述光导纤维上识别核酸探针分子与所述待检测的核酸分子和核酸反应液相接触；
[0016]d)用一激发光源射入到所述光导纤维中，在所述光导纤维的表面产生倏逝场，使得与所述探针分子结合的所述核酸反应产物上的荧光基团被激发产生荧光信号；
[0017]e)检测所述荧光信号的位置和强度，从而确定样品中核酸分子的存在或量。
[0018]在一个优选例中，所述核酸探针分子通过化学键连接、物理吸附、聚合物包埋、蚀刻或粘联的方式固定在光纤纤芯的表面。
[0019]在另一优选例中，所述倏逝场是通过在光纤内传导在光纤表面与核酸反应液的界面发生的光的全反射而产生。
[0020]在另一优选例中，所述光导纤维为以全发射形式传导光的纤维状材料，其直径小于 Smnin
[0021]在另一优选例中，所述的光导纤维的直径为0.01-5mm ;更佳地为0.05-lmm ;更佳地为 0.1-0.5mm。
[0022]在另一优选例中，所述光导纤维的制作材料选自(但不限于):玻璃、石英、塑料或有机聚合物。
[0023]在另一优选例中，所述的有机聚合物选自:聚乙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯。
[0024]在另一优选例中，所述反应容器内壁上镀有厚度小于IOOOnm厚的金属膜，或者直径小于IOOOnm的金属颗粒(较佳地，金属颗粒在反应容器内壁的镀层厚度小于IOOOnm)，其中所述金属选自金、银、铜。
[0025]在另一优选例中，所述光导纤维的材料为折射率大于核酸反应液的折射率的材料；较佳地，为折射率大于1.34的材料。
[0026]在另一优选例中，所述的高折射率液体的折射率为1.34-2.0。
[0027]在另一优选例中，所述核酸反应包括(但不限于):核酸连接酶反应、逆转录反应、核酸杂交反应、聚合酶链反应(PCR)等,或者这些反应的组合反应。
[0028]本发明另一方面提供一种平行测定样品中多种核酸分子的存在或量的装置，该装置包括以下部分:
[0029]a)提供一反应容器，所述反应容器中包含待检测的核酸分子和核酸反应液，在所述反应容器中进行核酸反应，反应中对核酸反应产物标记上突光基团；
[0030]b)提供一根或多根光导纤维，在所述的光导纤维上固定了多种识别核酸探针分子;
[0031]c)将所述光导纤维嵌入到反应容器中，使所述光导纤维上识别核酸探针分子与所述待检测的核酸分子和核酸反应液相接触；
[0032]d) 一激发光源射入到所述光导纤维中，在所述光导纤维的表面产生倏逝场，使得与所述探针分子结合的所述核酸反应产物上的荧光基团被激发产生荧光信号；
[0033]e) 一光信号检测器， 检测所述荧光信号的位置和强度，从而确定样品中核酸分子的存在或量；
[0034]f) 一温度控制装置，以提供所述核酸反应所需的反应温度。
[0035]在本发明的另一方面，提供所述的装置的用途，用于平行测定样品中一种或多种核酸分子的存在或量。
[0036]本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1为全反射产生倏逝场的原理图。
[0038]图2为光在光导纤维中通过全反射传导产生倏逝场示意图。
[0039]图3为光导纤维上固定探针图。
[0040]图4为用光导纤维实时定量检测多种核酸的反应体系横向纵向剖面不意图。
[0041]图5显示了倏逝场激发与光导纤维表面的探针分子杂交的目标核酸上的荧光基团。
[0042]图6为通过倏逝场激发的实时定量聚合酶链式反应的荧光变化曲线。
【具体实施方式】
[0043]发明人经过深入的研究，首次揭示一种改进的平行测定样品中一种或多种核酸分子的存在或量的方法。该方法基于在光纤的表面产生倏逝场的原理，借助倏逝场激发与在光纤表面固定的探针相结合的目标产物上的突光基团，而反应溶液中大量未结合的目标分子或是荧光基团几乎不被激发；通过检测荧光信号强度的变化来定量核酸分子的量。本发明的方法不需要多种荧光基团标记，不需要多个反应通道，因此成本低、检测的目标分子通量高。
[0044]本发明第一方面提供一种平行测定样品中一种或多种核酸分子的存在或量的方法，该方法包括以下步骤:
[0045]a)提供一反应容器，所述反应容器中包含待检测的核酸分子和核酸反应液，在所述反应容器中进行核酸反应，反应中对核酸反应产物标记上突光基团；
[0046]在所述反应容器内的的温度为可控，以控制所述核酸反应能在适宜的温度下进行。
[0047]b)提供一根或多根光导纤维，在所述的光导纤维上固定了多种识别核酸探针分子;
[0048]c)将所述光导纤维嵌入到反应容器中，使所述光导纤维上识别核酸探针分子与所述待检测的核酸分子和核酸反应液相接触；
[0049]d)用一激发光源射入到所述光导纤维中，在所述光导纤维的表面产生倏逝场，使得与所述探针分子结合的所述核酸反应产物上的荧光基团被激发产生荧光信号；
[0050]e)检测所述荧光信号的位置和强度，从而确定样品中核酸分子的存在或量。
[0051]适用于本发明方法的样品可以是各种形式，只要其中具有待检测的目标核酸分子即可。例如可以用本领域熟知或公开的方法(如限制性内切酶消化或机械方法)得到核酸样品，如总DNA、基因组DNA、cDNA、总RNA、mRNA等混合物。
[0052]本文所用的术语“核酸”、“核酸分子”可以互换使用，其指脱氧核糖核酸或核糖核酸及其单链或双链形式的聚合物。除非另有特别限定，该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸。该术语“核酸”可与基因、cDNA和基因编码的mRNA互换使用。另外，本发明的核酸分子还涵盖了核酸片段、核酸亚序列、核酸衍生物和核酸修饰物。所述的核酸长度可以各异，其可以是较大核酸分子的片段或较小的部分。较佳的是，待检测的核酸长度至少为30个碱基对，更佳的是长度为至少50个碱基对，例如30-4000个、50-2000个或50-1000个碱基对。待检测的核酸可以是已知的或未知的序列，可以是单链或双链形式。其可从任何来源衍生待扩增的核酸。
[0053]光导纤维简称光纤，是一种利用光在玻璃或塑料制成的纤维中的全反射原理而达成的光传导工具。光纤一般分为三层:中心高折射率玻璃芯，中间为低折射率硅玻璃包层，最外是加强用的树脂涂层。如本文所用，折射率(refractive index)是光在真空中的相速度与光在介质中的相速度之比值。本发明所述的 光纤或光导纤维是指中心高折射率的芯层部分，核酸探针是固定在光纤的芯层上。虽然光纤的芯层直径一般为50或62.5 μ m，但是只要是光能在其中以全发射形式传导的纤维状材料都属于光纤。所述光纤的制作材质包括选自玻璃、石英、塑料或有机聚合物等材质。光纤的直径并无特别的要求，较佳的直径是小于5mm,更佳地为0.05-lmm,或更佳地为0.1-0.5_。
[0054]本文所用的术语“固定”是指将核酸探针固定在固相支持物上，即本发明所述的光纤芯层的表面上，通过化学共价结合方式附着，或通过不可逆的被动吸附，或通过分子间的亲和力(例如利用生物素酰化的分子接头来固定于涂有亲和素的表面)。这种固定的强度必须足以在DNA变性条件下，不会因用水或缓冲水溶液洗涤而被除去。一种较佳的固定方法是采用双官能交联剂处理玻璃或石英材料的光纤表面，以得到带有反应性交联基团(如氨基、硫代或丙烯酸基团)的表面。所述交联剂可以是，例如，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)_碳二亚胺盐酸盐(EDC)、琥珀酰酐、苯基二异硫氰酸盐或马来酸酐、或异双官能团交联剂，如间-马来酰亚胺苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-琥珀酰亚胺[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸(SIAB)、琥珀酰亚胺4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物(SMCC)、N-y-马来酰亚胺丁酰氧-琥珀酰亚胺酯(GMBS)、琥珀酰亚胺_4-[对-马来酰亚胺苯基]丁酸盐(SMPB)等。另外可参见文献:Nucleic Acids Research, 29:e69, 2001.AnalyticalBiochemistry, 247:96-101,1997.Analytical Biochemistry, 266:23-30,1999.NucleicAcids Research, 30:4793-4802,2002。
[0055]另一些较佳的固定方案是在聚丙烯和聚碳酸酯等塑料光纤，通过紫外照射和l-fluoro-2-nitro-4-azibenzene处理后活化材料表面,或者是聚碳酸酯的表面通过紫外线和ozone处理活化。这些活化的聚合物的表面都能共价连接核酸探针分子。可参见文献:Analytical Biochemistry, 306:74-78, 2002.Analytical Biochemistry, 317:76-84,2003。
[0056]固定于光纤表面上的核酸探针分子可根据目标基因的信息进行设计，从而使其能够以特异性的方式分别与样品中的多种目标核酸分子或其扩增产物特异性结合。该探针的长度可以由本领域技术人员根据需求进行合适的选择，通常在6-2000个核苷酸(较佳10-50个核苷酸、更佳15-30个核苷酸)之间。另外，根据具体的用途，可能还需要采用修饰过的核酸探针。该核酸探针可用本领域技术人员熟知的方法来制备。
[0057]核酸探针在光纤上宜为空间上分开的阵列，其通常是这样构成的，将光纤表面分成不同的区域，使每个区域中只含有一种核酸探针分子。通过DNA阵列技术，可使多种DNA探针分子排列在光纤表面上。
[0058]用于核酸检测的核酸探针分子通常包括寡聚核苷酸、寡聚硫代核苷酸、肽核酸(peptide nucleic acid)、长链DNA分子、RNA分子、或者它们的修饰物。这些核酸探针分子可以通过化学键连接、物理吸附、或是聚合物包埋、蚀刻或粘联等方式固定在固体载体上。核酸探针还可通过接头或间隔臂连接在固相载体上。排列在固体载体上的DNA探针分子通过碱基间的相互配对，与目标分子(如扩增产物)相结合。通常目标分子是被荧光基团标记上的，它可通过扩增反应使得荧光基团等标记的脱氧核苷三磷酸(dNTP)掺入到目标核酸分子的扩增产物中，或是通过荧光基团等标记的引物使扩增产物带上荧光基团的方法。通过杂交后洗脱，杂交结合上去的目标分子所带的荧光信号被检测到。
[0059]本发明提供一反应容器，在反应容器中，核酸分子能通过DNA聚合酶或是RNA聚合酶在体外进行复制，转录，反转录的过程，从而线性或是指数性的扩增其拷贝数。如本领域技术人员所知道的，扩增过程通常包括变性，退火，合成三个步骤，即双链核酸分子的解链(变性)，被解链的核酸分子与引物分子结合(退火)，DNA聚合酶或是RNA聚合酶以解链的核酸分子为模板合成与之互补的DNA或RNA分子。
[0060]可用于本发明的核酸扩增方法包括，但不局限于，聚合酶链式反应(PCR)，反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，随机引物扩增反应，复合聚合酶链式反应扩增，连接酶反应，杂交反应等。在一个较佳的实施方案中，宜采用聚合酶链式反应。“聚合酶链式反应”或“PCR”指一种适用于核酸、RNA和/或DNA的小量特定片段的技术，其在例如美国专利如.4，683，195(1987年7月28日授权)中有详细的描述。通常，需要获得感兴趣区域两端或其外延的序列信息，从而可以设计寡核苷酸引物；这些引物应与待扩增模板相反链的序列基本上相同或相似。两个引物的5'端核苷酸可以与扩增材料的两端恰好重合。聚合酶链式反应可用来扩增全部基因组DNA中的、从全细胞RNA、噬菌体或质粒序列等转录获得的cDNA中的特定RNA序列、特定DNA序列。本文所用的PCR被认为是扩增样品中核酸分子的一个但并非唯一的例子，该方法中采用已知的核酸作为引物和核酸聚合酶来扩增或产生特定片段的核酸。
[0061]在聚合酶链式反应中，双链的DNA分子在9(TC以上变性成单链分子，然后在50-60°C与引物分子相结合，同时结合上DNA聚合酶，DNA聚合酶以此单链DNA分子为模版，脱氧核苷三磷酸(dNTP)为底物，复制出另一条与之互补的DNA，通常聚合酶链式反应中的DNA聚合酶最适的合成温度为70-78°C。通过复制，目标DNA分子扩增了一倍。这样多次的重复反应η个循环后，目标DNA分子扩增了近2η倍。具体可用于本发明的核酸聚合酶的例子是DNA聚合酶(T4DNA聚合酶)、各种耐热细菌的热稳定DNA聚合酶(如Taq、VENT、Pfu,Tl1、Tfl DNA聚合酶)以及它们遗传修饰的衍生物(TaqGold，VENTexo，Pfu exo)。优选的DNA聚合酶是Taq或TflDNA聚合酶。较佳地，用于本发明的核苷三磷酸分子是脱氧核糖核苷三磷酸，如dATP、dTTP、dCTP、dGTP，或核糖核苷三磷酸，如ATP、UTP、CTP、GTP。核苷三磷酸可以是天然或非天然形成的。
[0062]在核酸分子进行扩增反应的过程中，DNA聚合酶或是RNA聚合酶以脱氧核苷三磷酸(dNTP)或是核苷三磷酸(NTP)为底物进行合成，合成成新的扩增产物。因此，通过在扩增引物上标记荧光基团或是在底物脱氧核苷三磷酸(dNTP)或是核苷三磷酸(NTP)上标记荧光基团，就可使扩增的目标DNA分子就会标记上所需的荧光基团。
[0063]核酸连接酶反应包括连接酶检测反应(Ligase Detection Reaction, LDR)和连接酶链反应(Ligase Chain Reaction, LCR)。它可以单独使用或结合聚合酶链式反应(PCR)快速准确地检测少到一个碱基的变化。
[0064]核酸连接酶反应是Landegren等人于1988年为检出序列中点突变而设计、发明的。合成一对引物A、B，它们完成覆盖了靶序列。经退火与靶序列结合后，A、B间留下一个切口(nick)，加入连接酶封闭切口，两探针成靶序列完整的互补链。如果靶序列中有点突变，探针不能与靶序列精确结合，切口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，变性后探针仍是两个。显然，当靶序列中存在点突变时，检测连接产物结果是阴性的。
[0065]Barany于1991年报道了耐热连接酶-Taq连接酶的发现及其在LCR中的应用，为连接酶反应的实用化奠定了基础。用Taq连接酶做连接酶反应只在两个保温点的循环(94°C、lmin和65°C、3min)。产物检测也非常方便、敏感。因此可以说连接酶反应是目前检测已知序列中有无点突变和单碱基多态性检测的最佳方法。连接酶反应的产物也能被特异性设计的探针相结合并被识别。
[0066]标记荧光基团的技术是现有技术中所熟知的。常见的荧光基团包括，但不局限于，有机荧光分子类，如荧光素，TAMRA, Cy3, Cy5, Cy5.5，罗丹明，Alexa Fluor系列等；荧光蛋白类，如GFP，CFP，BFP，YFP等；含稀土金属离子的时间分辨荧光以及量子点(Quantum dot)四种。
[0067]在扩增反应的退火过程中，因反应液与固定有探针的光纤相接触，前一轮扩增得到的待检测核酸分子扩增产物在与扩增引物结合的同时，也会与固定在光纤上固定的核酸探针分子相结合，从而使结合上的目标核酸分子扩增产物上的荧光基团得以被本发明的特异性的方式激发。具体而言，目标核酸分子扩增产物上的荧光基团可以被光纤内由光的全反射所产生的倏逝场激发。
[0068]⑴光的全反射产生的倏逝场(图1)
[0069]众所周知，当光从高折射率Oi1，如玻璃)的介质101 (光密介质)照射到低折射率(n2，液相如水)的介质102 (光疏介质)，并且入射光103角度大于临界角(Θ c，Θ c =SirT1(Ii2Ai1)当n2 < Ii1)时,光将在光密介质中发生全反射104,从而不能折射到光疏介质中。然而，当光发生全反射时，光波会以电磁场的形式在入射点的地方穿过界面105渗透至光疏介质中，产生倏逝场106，渗透的电磁场的强度随着渗透深度的加深而成指数衰减107，其渗透的深度为:
[0070]dp =(入/^^印^/^化”-^/^产^’光在真空中的波长^’入射角度)[0071 ] 其深度通常在100到300纳米之间。根据公式，它与入射角，入射光波长，折射率有关。这种通过全反射渗透到光疏介质的电磁场就被称为倏逝场。倏逝场和其他光源一样，也能激发荧光基团。如果光密介质表面镀有纳米量级(约100-200纳米)的金、银、铜等贵重金属膜或颗粒，将可以一定程度的增强倏逝场激发荧光的强度，增强程度为几倍到几十倍不等，增强程度与金属种类和厚度等因素有关(参见文献:Analytical Biochemstry,334:303-311,2004.Journal of Fluorescence, 14:425-441,2004.Current Opinion inBiotechnology, 16:55-61, 2005)。因此,在本发明的一个较佳的实施方案中,光密介质(即固相载体)表面可以镀有小于1000纳米厚(通常约50-500纳米，更佳约100-200纳米)的金属膜，或者直径小于1000纳米(通常约50-500纳米，更佳约100-200纳米)的金属颗粒，其中所述金属选自金、银、铜或其它贵金属。
[0072]由于倏逝场渗透的深度 非常小，只有几百纳米，因此倏逝场只能激发贴近于介电层100-200纳米内的荧光基团，而绝大部分在光疏介质中的荧光基团不会受到激发。倏逝场激发的荧光信号强度相当于结合到载体表面的目标DNA分子的量。溶液中目标DNA分子的浓度越高，与DNA探针结合上的分子也越多，激发的荧光信号也越强。
[0073]要实现全反射产生的倏逝场，就需要将光射入到光密介质中。如图2所示(图未按大小比例绘制)，光纤是一种利用光在玻璃或塑料制成的纤维中的多次全反射原理而达成的光传导工具。因光纤芯材201的高折射率(折射率大于反应液的折射率1.34)，光纤中传导的光202 (多条角度上有差异的光线)在纤芯中发生多次的全反射，光将不会折射进入反应液,而仅仅在芯材的和反应液界面上形成一层较均匀分布的倏逝场203。
[0074]如图3和图4所示，光纤的全部或者大部分位置将包层301剥去，将一种或者多种核酸探针302阵列式地固定在每根光纤的芯层303上。本发明要求将一根或者多根光纤401封装在反应容器402中，在光纤的封装位置403上，可以但不是必须包裹一层底折射率的包层，以防止光纤中传播的光从封装的位置散射出。当把目标基因和核酸反应液404加入到反应容器中后，光纤将浸没在反应液中，光纤上固定的探针也和反应液相接触。荧光的激发光源405通过透镜组406整合射入到光纤中后，就以全发射的形式在光纤中传播，从而在光纤与反应液的界面产生倏逝场。
[0075]反应容器内是可以控制其温度，使其达到核酸反应所需的最适温度。在较佳实施例中，温度控制在聚合酶链式反应的退火阶段所需的温度，在聚合酶链式反应的退火温度下，被荧光基团标记的扩增产物可以和其相应探针相结合在光纤的表面，它可以通过倏逝场激发探针上结合的荧光分子并通过CCD407检测其荧光强度。
[0076]本发明另一方面提供一种平行测定样品中多种核酸分子的存在或量的装置，该装置包括以下部分:
[0077]a)提供一反应容器，所述反应容器中包含待检测的核酸分子和核酸反应液，在所述反应容器中进行核酸反应，反应中对核酸反应产物标记上突光基团；
[0078]b)提供一根或多根光导纤维，在所述的光导纤维上固定了多种识别核酸探针分子;
[0079]c)将所述光导纤维嵌入到反应容器中，使所述光导纤维上识别核酸探针分子与所述待检测的核酸分子和核酸反应液相接触；
[0080]d) 一激发光源射入到所述光导纤维中，在所述光导纤维的表面产生倏逝场，使得与所述探针分子结合的所述核酸反应产物上的荧光基团被激发产生荧光信号；
[0081]e) 一光信号检测器，检测所述荧光信号的位置和强度，从而确定样品中多种核酸分子的存在或量；
[0082]f) 一温度控制装置，以提供所述核酸反应所需的反应温度。
[0083]通常，本发明的以上方法可以基于想类同的光学平台配置，它们包含如下配置:
[0084]激发光源:包 括稳定的汞灯、氙灯、汞氙复合电弧灯光源；从紫外到红外波段不同波长的激光光源，包括气体激光，半导体激光。
[0085]中性密度滤光片:用以控制激发光的强度。
[0086]透镜组:用来整合光的条带，控制光的入射。
[0087]滤镜组:为选定的荧光基团组合配置合适的滤镜组，包括激发，发射，二色分光等。它可以削减光谱串色，提高要检测荧光的信号噪声比。
[0088]检测设备:其特征是能感应某一位置光强度，核心成分可从高灵敏度PMT或冷CCD，光电探测器，或者光功率计中选择。所述方法和装置中的荧光信号和强度可用常规的仪器来进行检测，例如可以采用电荷稱合器(Charge-Coupled Device, CCD),光电倍增管(PMT)，光电探测器，或者光功率计等检测设备。荧光标记优选的检测系统是电荷耦合仪(CCD)照相机，它可任选地与放大装置(如显微镜)连接。
[0089]本发明实际上涉及一种实时定量聚合酶链式反应技术，该技术在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的累积，实时监测整个聚合酶链式反应进程，最后通过制作标准曲线对目标核酸分子的扩增产物进行定量分析的方法。在聚合酶链式反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终聚合酶链式反应不再以指数方式生成目标核酸扩增产物(或称为摸板)，从而进入平台期。在传统的PCR中，常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测聚合酶链式反应的最终扩增产物，用此终点法对聚合酶链式反应产物定量存在不可靠之处。在实时定量聚合酶链式反应中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线(图6)。在聚合酶链式反应早期，产生荧光信号的水平不能与背景明显地区别，而后荧光信号的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在聚合酶链式反应处于指数期的某一点上来检测聚合酶链式反应产物的量，并且由此来推断模板最初的含量。为了便于对所检测样本进行比较，在实时定量聚合酶链式反应反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的域值，如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值循环数(Ct)。Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。尽管本发明实施例中设定Ct值为扩增反应开始时信号值的3倍，然而，应当理解，本领域技术人员能够根据具体需求选择和确定合适的Ct值。
[0090]本发明研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。因此，在利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线后，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
[0091]在本发明中，随着溶液中目标DNA分子的扩增，荧光标记的目标DNA分子的浓度呈指数方式增加，与固定在载体表面的DNA探针分子结合上的也增多，相应探针位置上激发的荧光信号也增强。因此，能够在整个核酸扩增反应过程进行了多种探针的实时监测和连续地分析扩增相关的荧光信号。随之可以绘制成多条S型曲线，得出多个探针分子的Ct值，从而判断和检测目标核酸的种类和拷贝数。这种核酸扩增反应可以包括聚合酶链式反应(PCR)，反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，随机引物扩增反应，连接酶反应或是其他聚合酶链式反应相关的扩增技术，以及包含有这些扩增反应过程的反应。其特征为包括核酸的变性和退火的过程,并能增加特定多核苷酸链的反应。
[0092]为了更详细的叙述本发明，根据附图进行如下具体说明。然而，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用本领域技术人员所知的常规技术，这些技术在下列文献中有完整的描述:例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989) ； ((DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑，1984);《核酸杂交》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑.1984)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。
[0093]实施例1
[0094]利用本发明的装置来检测待测样品中以下七种病原体细菌的存在情况:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes),大肠杆菌(Escherichia.Coli),肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae),脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)，屎肠球菌(Ehterococcus faecium)，绿胺杆菌(Pseudomonasaeruginosa)。
[0095]上述七种细菌基因组都存在16S rDNA基因。因此以该基因序列中的保守性位点来设计通用的扩增引物如下:
[0096]5' -Cy3-GAAGAGTTTGATCMTGGCTC-3; (M = A+C)(SEQ ID NO:1)
[0097]5' -Cy3-ACTGCTGCCTCCCGTAGGAG-3' (SEQ ID NO:2)
[0098]并且，针对上述七种病原体细菌的16S rDNA基因的非保守位点设计探针，合成专一性的DNA探针:
[0099]金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus):
[0100]SH-C6-5’ -CGGACGAGAAGCTTGCTTCTCTGATGTTAGCG-3' (SEQID NO:3)
[0101]单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes):
[0102]SH-C6-5，-AACGGAGGAAGAGCTTGCTCTTCCAAAGTTAGTGG-3' (SEQ ID NO:4)
[0103]大肠杆菌(Escherichia.Coli):[0104]SH -C6-5，-CAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACG-3' (SEQ IDNO:5)
[0105]肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae):
[0106]SH -C6-5，-AGAACGCTGAAGGAGGAGCTTGCTTCTCTGGAT-3' (SEQ IDNO:6)
[0107]脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis):
[0108]SH-C6-5’ -GCAGCACAGAGAAGCTTGCTTCTCGGGTG-3' (SEQ IDNO:7)
[0109]屎肠球菌(Enterococcusfaecium):
[0110]SH -C6-5’ -CTTTTTCCACCGGAGCTTGCTCCACCGGAAA-3' (SEQID NO:8)
[0111]绿胺杆菌(Pseudomonas aeruginosa):
[0112]SH-C6-5’ -GAAGGGAGCTTGCTCCTGGATTCAGCGG-3' (SEQ IDNO:9)
[0113]本实施例中采用的光纤是石英(折射率1.55)基材的光纤。光纤芯径200um，用剥线钳去掉外面的涂覆层，再用丙酮溶液腐蚀掉丙烯酸酯包层。将处理好的光纤切成2cm的一根的小段，3小段光纤并成一排，但不相互接触。通过注塑的方式将光纤嵌入到注塑成的反应槽中，反应槽为聚丙烯材料制成，边长为0.8mm的方柱形。
[0114]石英光纤材料经过硅烷试剂和交联试剂处理后，将所述特异性探针201阵列式地固定在石英芯材表面(具体的固定方法可参照文献Analytical Biochemistry, 317:76-84,2003.中的方法)。
[0115]为更详细的说明此发明，下面结合图5对本发明实施例方法及过程进行详细说明。如图所示，各种核酸探针501通过DNA阵列的方法固定在石英芯材表面。从要检测的组织或样品中分离纯化总DNA后,将总DNA与聚合酶链式反应的反应液502混合,反应液包括Taq DNA聚合酶(2u)，包括5mM MgCl2的IX Taq DNA聚合酶对应的扩增缓冲液，Cy5标记的扩增引物403(50pM)，底物dNTP(200uM)，反应体积约为100ul。将反应液加入反应容器中，用一片PMMA薄片封装密封好反应容器。
[0116]整个反应容器受到一个半导体制冷装置的温度控制平台的控制，通过其升温和降温进行聚合酶链式反应，包括目的基因的反复变性(94°C，30s)、退火(55°C，30s)和反应延伸(74°C，30s)的过程，扩增产生的基因产物片段504因为Cy3标记的引物而带上了 Cy3荧光基团505。
[0117]在55°C的退火过程中，打开激发光源。激发光源产生514纳米波长激光，通过透镜将激发光射入光纤506中。激发光以全反射507的方式`在光纤中传导,从而在光纤和反应液的界面上产生倏逝场508。
[0118]在聚合酶链式反应的退火阶段(55°C )，扩增产物能和固定在光纤上的探针结合509。这一区域的扩增产物上的荧光基团，因为靠近全反射的界面，能被倏逝场激发。而反应液中的荧光基团因为绝大部分不能靠近全反射的界面而不能被激发。
[0119]Cy3的荧光基团被倏逝场激发后产生552纳米的发射波长510，此发射波长通过一中心波长550纳米的滤镜310后，被CXD接收，通过CXD可检测到各探针点位置上的荧光信号强度。阵列上各点的信号大小不一，对应于目标基因扩增的产物量的不同。随着扩增反应多个循环进行，阵列上各点的信号值随之增大，当某一点的信号值达到一域值，即扩增反应开始时信号值的3倍，记录这时的循环数Cti (i为探针编号)(图5)。根据各个探针的Cti可以定量目标基因的各种选择性拼接形式的相对拷贝数。由于每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，而且起始拷贝数越多，Ct值越小，因此，根据Ct值可以推算出目标基因片段起始的 相对拷贝数。
【权利要求】
1.一种平行测定样品中一种或多种核酸分子的存在或量的方法，该方法包括以下步骤: a)提供一反应容器，所述反应容器中包含待检测的核酸分子和核酸反应液，在所述反应容器中进行核酸反应，反应中对核酸反应产物标记上荧光基团； 在所述反应容器内的的温度为可控，以控制所述核酸反应能在适宜的温度下进行； b)提供一根或多根光导纤维，在所述的光导纤维的纤芯表面上固定了多种识别核酸探针分子； c)将所述光导纤维嵌入到反应容器中，使所述光导纤维上识别核酸探针分子与所述待检测的核酸分子和核酸反应液相接触； d)用一激发光源射入到所述光导纤维中，在所述光导纤维的表面产生倏逝场，使得与所述探针分子结合的所述核酸反应产物上的荧光基团被激发产生荧光信号； e)检测所述荧光信号的位置和强度，从而确定样品中核酸分子的存在或量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸反应选自核酸连接酶反应、逆转录反应、核酸杂交反应、聚合酶链反应，或其组合反应。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光导纤维材料的折射率大于核酸反应液的折射率。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光导纤维材料为折射率大于1.34的固体。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光导纤维的制作材质选自玻璃、石英、塑料或有机聚合物材质。在另一优选例中，所述的有机聚合物选自:聚乙烯、聚苯乙烯、聚氯乙火布、聚丙纟布、聚碳酸酷。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光导纤维为以全反射形式传导光的纤维状材料，其直径小于5_。在另一优选例中，所述的光导纤维的直径为0.01-5mm ;更佳地为 0.05-lmm ;更佳地为 0.1-0.5mm。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光导纤维的表面上可以镀有小于1000纳米厚的金属膜，或者直径小于1000纳米的金属颗粒，其中所述金属选自金、银、铜。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述倏逝场是光在光导纤维中发生全反射传导而产生。
9.一种平行测定样品中一种或多种核酸分子的存在或量的装置，该装置包括以下部分: a)提供一反应容器，所述反应容器中包含待检测的核酸分子和核酸反应液，在所述反应容器中进行核酸反应，反应中对核酸反应产物标记上荧光基团； b)提供一根或多根光导纤维，在所述的光导纤维的纤芯表面上固定了多种识别核酸探针分子； c)将所述光导纤维嵌入到反应容器中，使所述光导纤维上识别核酸探针分子与所述待检测的核酸分子和核酸反应液相接触； d)一激发光源射入到所述光导纤维中，在所述光导纤维的表面产生倏逝场，使得与所述探针分子结合的所述核酸反应产物上的荧光基团被激发产生荧光信号； e)一光信号检测器，检测所述荧光信号的位置和强度，从而确定样品中核酸分子的存在或量； f)一温度控制装置，以提供所述核酸反应所需的反应温度。
10.权利要求9所述的装置的用途，用于平行测定样品中一种或多种核酸分子的存在或 量。
【文档编号】C12Q1/68GK103468787SQ201210186498
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2012年6月7日 优先权日:2012年6月7日
【发明者】许亮 申请人:许亮