1‑芘甲酸作为pH荧光探针的应用的制作方法

本发明涉及1-芘甲酸作为荧光探针在检测溶液pH值中的应用，属于光分析检测技术领域。

背景技术：

化学反应的进行或完成、细胞和细胞器的许多重要生理过程都与pH值密切相关。因此，pH值的精确测量对化学、生物学研究都十分重要。现有的pH测量方法主要有电极法、指示剂法和荧光光谱法等。

现有的pH测量方法还存在如下不足：(1)电极法由于存在电化学干扰、可能的机械损伤等缺陷而不适于活体pH检测；(2)指示剂法由于显色范围宽，导致检测灵敏度和准确度降低；(3)荧光光谱法是一种基于光学信号建立的检测方法，其与前两种方法相比具有灵敏度高、选择性好、能够进行实时、原位检测等优点，因而受到较高的重视，但pH荧光探针普遍存在的问题是对氢离子的响应范围宽，从而导致探针的灵敏度低、选择性差、容易受到金属离子的干扰。

因此，发展一种不易受金属离子干扰、窄响应范围、可用于测定较窄pH范围的荧光探针仍是一个重要的研究方向。

1-芘甲酸，其化学式如(I)所示，目前已经实现了商品化，但该物质作为pH荧光探针是新的用途。

技术实现要素：

本发明为了解决现有pH荧光探针技术的不足，提供了1-芘甲酸作为pH荧光探针的应用及其测定pH值的方法。

本发明所采用的技术方案是：

1-芘甲酸作为pH荧光探针的应用。

一种测定pH值的方法，包括如下步骤：

1)制作标准曲线：将1-芘甲酸加入不同pH值的缓冲溶液中，配置成相同浓度的1-芘甲酸溶液，记录各溶液的荧光强度，测定pH值与荧光强度的定量关系；

2)将1-芘甲酸加入待测溶液中，配置成相同浓度的1-芘甲酸溶液，记录溶液的荧光强度；

3)根据定量关系计算待测溶液的pH值。

优选的，上述步骤1)中，在激发波长为350nm，发射波长为382nm处，测定1-芘甲酸溶液荧光强度与pH值的定量关系。

优选的，上述步骤1)中，在激发波长为350nm，发射波长为401nm处，测定1-芘甲酸溶液荧光强度与pH值的定量关系。

优选的，配置成的所述1-芘甲酸溶液中1-芘甲酸的浓度为2.0×10^-5mol/L。

优选的，所述缓冲溶液为磷酸、醋酸、硼酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液中的一种。

本发明具有以下有益效果：

(1)可在水溶液中检测pH值：1-芘甲酸水溶性好，能很容易地配制成水溶液，并能在水溶液中方便地检测氢离子浓度；

(2)抗干扰能力好：利用1-芘甲酸对pH缓冲溶液进行检测时，缓冲溶液的浓度在一个较宽的范围内不会影响到1-芘甲酸的荧光强度，而且，缓冲溶液的种类，如磷酸、醋酸、硼酸、HEPES等缓冲溶液也不影响荧光响应，应用范围较广；

(3)选择性强：常见的金属离子对1-芘甲酸荧光探针识别氢离子的特性影响很小。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明：

图1是在不同pH值的缓冲溶液(缓冲溶液浓度为2.0×10^-3mol/L，其中的1-芘甲酸浓度为2.0×10^-5mol/L)中1-芘甲酸的荧光发射图谱(所采用缓冲溶液的pH分别为11.07、9.92、8.97、8.05、7.00、6.40、5.81、5.22、5.00、4.61、4.43、4.04、3.69、3.43、2.90、2.73、2.32、2.20；激发波长为350nm)；

图2是根据图1绘制的I₄₀₁/I₃₈₂随pH变化的趋势图(pH＝11.07、9.92、8.97、8.05、7.00、6.40、5.81、5.22、5.00、4.61、4.43、4.04、3.69、3.43、2.90、2.73、2.32、2.20；I₄₀₁、I₃₈₂为发射波长为382nm和401nm处的荧光强度；激发波长为350nm)；

图3是根据图1绘制的在发射波长为382nm处1-芘甲酸荧光强度随pH值的变化图(计算得1-芘甲酸的酸解离常数pKa＝4.97)；

图4为在pH为5.00的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲溶液(缓冲溶液浓度为2.0×10^-3mol/L，其中的1-芘甲酸浓度为2.0×10^-5mol/L)中分别加入1.0×10^-4mol/L的Al³⁺、Ba²⁺、Cd²⁺、Cr³⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺、Hg²⁺、Ni²⁺、Pb²⁺的I₄₀₁/I₃₈₂比值变化示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明：

以下所述缓冲溶液可为磷酸、醋酸、硼酸、HEPES等缓冲溶液。缓冲溶液中1-芘甲酸的浓度为2.0×10^-5mol/L，仅为本发明的一个优选方案，在实际操作中，可根据需要选择不同的浓度。

实施例1

1-芘甲酸对不同pH值的荧光识别：

分别配制含有1-芘甲酸的不同pH值(pH＝11.07、9.92、8.97、8.05、7.00、6.40、5.81、5.22、5.00、4.61、4.43、4.04、3.69、3.43、2.90、2.73、2.32、2.20)的缓冲溶液(缓冲溶液浓度为2.0×10^-3mol/L，其中1-芘甲酸的浓度为2.0×10^-5mol/L。采用350nm作为激发波长，测定并绘制不同pH值缓冲溶液中1-芘甲酸的荧光光谱(如图1所示)。

如图1所示，用350nm波长激发时，发射波长在382nm和401nm处附近荧光强度最大，且1-芘甲酸的荧光发射波长在382nm处时，随着pH值的减小，1-芘甲酸对氢离子的响应表现为荧光淬灭；在401nm处时，随着pH值的减小，1-芘甲酸对氢离子的响应表现为荧光增强，是一种很好的比率型pH荧光探针。

如图2所示I₄₀₁/I₃₈₂随pH变化的趋势图，I₄₀₁/I₃₈₂在pH为2.0～6.0的范围内积极响应，且随着pH值的减小，荧光强度比值I₄₀₁/I₃₈₂急剧升高。在pH2.0～6.0的范围内，I₄₀₁/I₃₈₂与pH可近似为线性关系。将1-芘甲酸加入待测溶液中，配置具有相同1-芘甲酸浓度的待测溶液，即待测溶液中1-芘甲酸浓度为2.0×10^-5mol/L，记录溶液的荧光强度，计算I₄₀₁/I₃₈₂，通过上述线性关系计算出待测溶液的pH值。

如图2所示，在发射波长为382nm处1-芘甲酸荧光强度随pH值的变化图。根据图3以及IF-pH曲线，以382nm处的峰强度为基准，用Henderson-Hasselbach-type方程：pKa＝pH+log[(F_max-F)/(F-F_min)]计算出此探针的pKa值为4.97，即计算得1-芘甲酸的酸解离常数pKa为4.97，属于弱酸。由此可见，1-芘甲酸荧光探针可用于酸性体系中pH值的测定。

实施例2

1-芘甲酸荧光探针对氢离子的选择性：

向pH值为5.0的缓冲溶液(其中1-芘甲酸的浓度为2.0×10^-5mol/L)中，滴加含Al³⁺的金属离子溶液，使得缓冲溶液中Al³⁺的浓度1.0×10^-4mol/L。采用相同方法配置分别含Ba²⁺、Cd²⁺、Cr³⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺、Hg²⁺、Ni²⁺、Pb²⁺的缓冲溶液(每份缓冲溶液中的相应金属离子浓度均为1.0×10^-4mol/L，1-芘甲酸的浓度为2.0×10^-5mol/L)。

采用350nm作为激发波长，测定上述每份待测溶液的荧光光谱，并计算I₄₀₁/I₃₈₂，以荧光强度比值I₄₀₁/I₃₈₂对应不同金属离子作图(如图4所示)。

如图4所示，每份待测溶液中1-芘甲酸的荧光强度比值I₄₀₁/I₃₈₂相差不大，说明1-芘甲酸对氢离子的荧光识别几乎不受金属离子的影响，即1-芘甲酸荧光探针对氢离子具有较高的选择性。

以上实施例并非仅限于本发明的保护范围，所有基于本发明的基本思想而进行的修改或变动都属于本发明的保护范围。