微宇宙周期生物量测算污染物生态毒性效应阈值浓度方法与流程

本发明涉及一种基于微宇宙周期生物量测算环境污染物生态毒性效应阈值浓度的方法，涉及水环境污染物生态毒性效应阈值浓度测算的一种方法。

背景技术：

水质基准的核心是剂量效应关系，其基础环节是污染物生态毒性效应阈值浓度的确定方法。国际有影响的机构组织，如美国环保局(USEPA)、欧盟联合研究中心(EUC)及世界经济与合作组织(OECD)等都在研究更为完善的污染物阈值浓度测算方法。USEPA、EUC及OECD等机构组织发布的“技术指南”在计算水质基准时，主要采用了个体水平反应终点的毒性数据。尽管反应终点水平越微观，实验结果的因果关系越强，但生态学意义越不显著，个体水平及以下的反应终点难以满足推导水质基准的需要。既使同一生态受体的多个反应终点，对污染物不利效应的表征能力往往不同。目前通常的做法都是选择最敏感的反应终点做为确定阈值浓度的反应终点。然而一个个体水平上最敏感的反应终点所确定的毒性效应并不必然反映种群毒性效应，这是因为种群效应并不必然由最敏感的生命周期特征决定。同样，一个种群水平上最敏感的反应终点所确定的毒性效应并不必然反映群落或生态系统毒性效应，这是因为生态系统中竞争、摄食等生态关系影响污染物的毒性效应。尽管生态受体所处的生命组建层次越高，相应的反应终点综合反映生态系统毒性效应的能力越强，然而由于技术条件限制，目前只有种群水平上的反应终点可以定量测量。因此目前污染物生态毒性效应阈值浓度研究多限于单物种毒性实验，缺乏考虑生态系种群间的生态相关性，致使研究结果的真实性、可靠性降低。

随着生态毒理学的发展，生态学领域的“微宇宙”技术被引人到污染物生态毒性效应阈值浓度测算中，利用人工组建的生态系统开展环境污染物的测算,一定程度提高了生态毒性效应阈值浓度的可靠性。然而由于存在多重竞争和摄食关系，微宇宙是复杂的非线性系统，是一种振荡系统。振荡系统在不同污染物浓度下其种群生物量的振荡周期不同。如果根据同一取样时间各污染物浓度下的种群生物量作为毒性反应终点分析毒性效应，可比性较低；根据取样日各污染物的种群生物量与对照组种群生物量比较判断得出NOEC，会带来较大的不确定性。即由于振荡周期的不同，各处理组取样日种群生物量所处周期的相位不同，其可比性、代表性将会降低，由此测算的生态毒性效应的可靠性也将降低。

目前还没有利用微宇宙周期生物量提高微宇宙技术测算污染物毒性效应阈值浓度可靠性的相关报道。

技术实现要素：

发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种利用微宇宙周期生物量测算污染物生态毒性效应阈值浓度方法，有助于完善污染物水质基准的推导方法，有助于夯实水质标准制定的科学基础，避免水质标准制定导致的环境“欠保护”或“过保护”，使经济和生态环境和谐发展。

技术方案：为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

微宇宙周期生物量测算污染物生态毒性效应阈值浓度方法，基于种群水平上的毒性效应实验结果，利用种群间的生态关系构建微宇宙模型，将若干种群水平上的反应终点与群落水平上的反应终点关联起来，由种群水平上的污染物浓度与毒性效应之间的定量关系构造出群落水平上的污染物浓度与毒性效应之间的定量关系，以一定污染物浓度下微宇宙群落周期生物量是否偏离对照微宇宙群落周期生物量作为阈值浓度的判据，计算污染物生态毒性效应阈值浓度。

进一步的，所述的测具体算方法，包括以下步骤：

1)浮游生物种群毒性效应的测定及分析；

根据单藻培养体系毒性效应实验及浮游动物种群毒性效应实验测定结果，计算不同污染物浓度下微藻种群的内禀增长率、环境容纳量参数，计算不同污染物浓度下浮游动物种群的存活率，繁殖速率、内禀增长率、世代时间、雌体抱卵率和种群增殖率参数，分别以上述参数为反应终点分析污染物对浮游生物种群的毒性效应；

单藻培养体系毒性效应实验：以实验室繁育的微藻为对象，过滤海水添加适量营养盐作为培养液，置于锥形瓶中，在光照培养箱中培养；

培养温度15-25℃，分别与后面实验中两种浮游动物的适宜培养温度相配合，pH 8.0，光照强度60μmol m^-2s^-1，初始密度均为1×10⁴cells mL^-1，光周期12L:12D；

污染物浓度间隔通过预实验设定6个浓度梯度，包括对照样；每组设置3个平行样；

每隔24h取5mL培养液，加入固定液，在显微镜下进行种类鉴定和计数；

实验对象种群出现衰亡时结束实验；

根据实验结果利用Logistic生长模型拟合可获得微藻内禀增长率、环境容纳量参数，分析污染物对微藻种群的毒性效应；

浮游动物种群毒性效应实验：

单体培养，选择健康活泼的浮游动物成熟雌体，分别放进产卵瓶里，每个瓶放中型浮游动物1只，瓶里盛有250mL培养液，或小型浮游动物采用15mL的6孔培养板；

污染物的浓度间隔通过预实验设定6个浓度梯度，包括对照样，每组设置10个平行样；

实验在15-25℃下恒温培养，每天检查计数产卵个数、孵化出的幼体数和母体存活情况，移去幼体，同时按约1/2的比例换培养液水，并添加饵料藻，实验到雌体死亡为止；

根据实验结果可计算浮游动物存活率，繁殖速率、内禀增长率、世代时间，分析污染物对浮游动物种群的毒性效应；

群体累计培养，定量移取活泼健壮、相同条件下预培养的浮游动物，中型浮游动物10只，或小型浮游动物10ind mL^-1置于盛有300mL培养液的烧杯中；

污染物的浓度间隔通过预实验设定6个浓度梯度，包括对照样，每组设3个平行样；

实验在15-25℃下培养；培养时间到种群增长达到高峰并开始下降为止；在实验期间每隔24h投喂饵料一次，每天计数浮游动物总个体数、抱卵个体数、脱落的夏卵数量，计数后再放回原培养物中，连续重复三次，求出平均数；

根据实验结果可计算浮游动物雌体抱卵率和种群增殖率，分析污染物对浮游动物种群的毒性效应；

2)种群水平上反应终点的差异性分析；

基于浮游生物种群毒性效应实验结果，确定不同反应终点下的NOEC，计算各反应终点下的EC05、EC10、EC50及其95％置信区间，分析不同反应终点下生态毒性效应的敏感性、可靠性和稳定性，确定测算生态毒性效应阈值浓度的反应终点，构建生态毒性效应模型；

3)微宇宙模型参数的获取及模型的构建；

根据双藻竞争实验和浮游动物摄食、选食行为实验结果，计算微藻的竞争抑制参数，计算浮游动物对于微藻的滤水率、摄食率和摄食选择性系数参数，计算大中型浮游动物对小型浮游动物滤水率、摄食率和摄食选择性系数等参数，构建具有微宇宙群落模型；

双藻竞争实验：将实验微藻两两混合，根据培养液中藻细胞密度和单个藻细胞生物体积的大小设定微藻的初始接种生物量，使共培养微藻生物量比为1:1，其他培养条件及检测指标与单藻毒性效应实验相同；根据实验结果利用Lotka-Volterra竞争模型拟合可获得竞争抑制参数；

浮游动物摄食、选食行为实验：

分别将微藻单独喂养选取的浮游动物；浮游动物由实验室繁育获得，实验前先将预培养的浮游动物分别在相应要摄食的微藻中驯化培养3-5d，再饥饿24h；实验在150mL烧杯中进行，实验藻液体积为50mL，微藻密度根据预实验设置为最适投喂密度，温度为15-25℃，每个烧杯加入一定数量浮游动物，每实验组设3个平行样，另设不加浮游动物的对照组；

用黑布将实验烧杯罩住在黑暗条件下培养24h，采用饵料浓度差法，24h后计数，鲁哥试剂固定培养液，在显微镜下血球计数板计数并计算藻细胞密度，根据实验结果可计算浮游动物对于微藻的滤水率和摄食率；大中型浮游动物对小型浮游动物的物摄食、选食行为实验方法步骤同上；

将微藻两两混合，投喂选取的浮游动物，根据单个藻细胞生物体积的大小确定混合比例，使两种微藻生物量比为1:1，其他实验条件步骤同上；采用饵料浓度差法，计算浮游动物对于微藻的摄食率，根据浮游动物对不同微藻的摄食程度可确定其摄食选择性系数；

4)微宇宙周期生物量的计算及污染物阈值浓度的测算；

基于微宇宙模型模拟计算微宇宙群落中各个生物种群生物量的变化最小正周期，进而计算它们的最小公倍数，获得微宇宙群落生物量变化的最小正周期，计算一定污染物浓度下微宇宙群落周期生物量均值；以一定污染物浓度下微宇宙群落周期生物量均值是否偏离对照微宇宙群落周期生物量均值作为阈值浓度的判据，综合运用模型计算及数理统计方法，测算污染物生态毒性效应阈值浓度，并进行不确定性分析。

有益效果：本发明基于微宇宙群落各种群生物量的周期性变化，通过生物种群间的生态关系，构建微宇宙群落模型，计算微宇宙群落周期生物量均值，解决了同一取样时间不同污染物浓度下的各种群生物量周期的相位差异带来的可比性差的问题，提高微宇宙技术测算污染物毒性效应阈值浓度可靠性、准确性。此外，本发明方法可以利用种群水平上的毒性效应数据测算群落水平上的污染物生态毒性效应阈值浓度，不仅提高了阈值浓度的生态相关性，还可以充分利用现有的大量单物种种群毒性效应实验数据，节约社会资源。本发明方法涉及的生物毒性实验都是常规实验，针对监测生物设计的微宇宙模型可应用于不同污染物，便于在广大水质环境监测部门推广使用。

附图说明

附图1为微宇宙群落中各种群生物量周期性变化示意图；

附图2为微宇宙群落种群生态关系示意图。

具体实施方式

下面结合附图1、2对本发明作更进一步的说明，其中附图2中表示摄食关系，表示竞争关系，表示存在密度制约，表示种群有系统之外的食物来源。

采用本发明，以浮游生物种群毒性效应实验为基础，获取模型参数，构建微宇宙群落模型，计算一定污染物浓度下微宇宙群落周期生物量均值，进而计算污染物阈值浓度。方法的科学性可以通过微宇宙对照实验的结果分析模型的拟合优度并验证阈值浓度计算结果来评估。

1、生态毒性效应实验及参数获取：

(1)单种微藻毒性效应实验

采用实验室繁育获得青岛大扁藻(Platymonas helgolandica)和球等鞭金藻(Isochrysis galbana)，过滤海水调节盐度至9，添加适量营养盐作为培养液，置于1000mL锥形瓶中，在光照培养箱中培养。培养温度15℃(或23℃，分别与后面实验中两种浮游动物的适宜培养温度相配合)，pH 8.0，光照强度60μmol m^-2s^-1，初始密度均为1×10⁴cells mL^-1，光周期12L:12D。环丙沙星(CIP)污染物设6个浓度梯度，包括对照样。每组设置3个平行样。每隔24h取5mL培养液，加入固定液，在显微镜下进行种类鉴定和计数。实验对象种群出现衰亡时结束实验。根据实验结果利用Logistic生长模型拟合获得微藻内禀增长率、环境容纳量等参数。

(2)双藻竞争实验

将青岛大扁藻、球等鞭金藻混合，根据培养液中藻细胞密度和单个藻细胞生物体积的大小设定微藻的初始接种生物量，使共培养微藻生物量比为1:1，其他培养条件及检测指标也与单藻毒性效应实验相同。根据实验结果利用Lotka-Volterra竞争模型拟合获得竞争抑制参数。

(3)浮游动物种群毒性效应实验

单体培养，选择健康活泼的大型溞(D.magna)(或褶皱臂尾轮虫(B.plicatilis))成熟雌体，分别放进15mL的6孔培养板。污染物的浓度设6个浓度梯度，包括对照样，每组设置10个平行样。实验在23℃下恒温培养，每天检查计数产卵个数、孵化出的幼体数和母体存活情况，移去幼体，同时按约1/2的比例换海水，并添加饵料藻，实验到雌体死亡为止。根据实验结果可计算浮游动物存活率，繁殖速率、内禀增长率、世代时间等。

群体累计培养，定量移取活泼健壮、相同条件下预培养的大型溞(或褶皱臂尾轮虫)(初始密度为10ind mL^-1)置于盛有300mL培养液的烧杯中。污染物的浓度设6个浓度梯度，包括对照样，每组设3个平行样。实验在23℃下培养。培养时间到种群增长达到高峰并开始下降为止。在实验期间每隔24h投喂饵料一次。每天计数浮游动物总个体数、抱卵个体数、脱落的夏卵数量(计数后再放回原培养物中)，连续重复三次，求出平均数。根据实验结果可计算浮游动物雌体抱卵率和种群增殖率等。

(4)浮游动物摄食、选食行为实验

分别将青岛大扁藻、球等鞭金藻单独喂养大型溞(或褶皱臂尾轮虫)。浮游动物由实验室繁育获得，实验前先将预培养的浮游动物分别在相应要摄食的微藻中驯化培养3-5d，再饥饿24h。实验在150mL烧杯中进行，实验藻液体积为50mL，微藻密度根据预实验设置为最适投喂密度，温度为23℃，每个烧杯加入10indmL^-1大型溞(或褶皱臂尾轮虫)，每实验组设3个平行样，另设不加浮游动物的对照组。用黑布将实验烧杯罩住在黑暗条件下培养24h。采用饵料浓度差法，24h后计数，鲁哥氏液固定藻液，在显微镜下血球计数板计数并计算藻细胞密度，根据实验结果可计算大型溞(或褶皱臂尾轮虫)对于微藻的滤水率和摄食率。大型溞对褶皱臂尾轮虫的物摄食、选食行为实验方法步骤同上。

将青岛大扁藻、球等鞭金藻混合，投喂大型溞(或褶皱臂尾轮虫)，根据单个藻细胞生物体积的大小确定混合比例，使两种微藻生物量比为1:1，其他实验条件步骤同上。采用饵料浓度差法，计算大型溞(或褶皱臂尾轮虫)对于微藻的摄食率，根据其对不同微藻的摄食程度计算其摄食选择性系数。

(5)微宇宙群落毒性效应实验

将青岛大扁藻、球等鞭金藻混合，使共培养微藻生物量比为1:1，取大型溞、褶皱臂尾轮虫接种到微藻混合液中，并添加污染物。初始接种的微藻生物量、浮游动物生物量及添加的污染物浓度间隔同上。浮游动物选取活泼健壮、相同条件下预培养的个体，实验前先分别在相应的微藻混合液中驯化培养3-5d，再饥饿24h，使之排空肠道。实验在10L玻璃容器中进行，23℃下培养。每实验组设3个平行样，另设不加污染物的对照组。其他培养条件与单藻毒性效应实验相同。每天观察计数浮游生物种类和数量变化，计数方法同上述相应实验。根据实验系统中浮游生物种群数量稳定持续时间情况决定实验结束时间。

2、生态毒性效应参数的获取：

根据实验测定结果，应用Dunnett—t检验确定不同毒性反应终点(微藻种群的内禀增长率、环境容纳量等参数，浮游动物种群的存活率、繁殖速率、内禀增长率、世代时间、雌体抱卵率、种群增殖率、滤水率和摄食率等参数)下的NOEC，应用Log-logistic模型计算不同反应终点下EC05、EC10、EC50及其95％置信区间，分析不同反应终点下生态毒性效应的敏感性、可靠性和稳定性。

结论：通过反应终点分析，发现微藻种群的内禀增长率、环境容纳量等参数，浮游动物种群的存活率、内禀增长率、滤水率和摄食率等参数具有较高的敏感性、可靠性和稳定性，可以作为种群水平上的反应终点，建立生态毒性效应模型，表征种群水平上的污染物生态毒性效应。

3、微宇宙群落模型构建：

根据双藻竞争实验和浮游动物摄食、选食行为实验测定的参数，基于Logistic生长模型和Lotka-Voterra捕食模型建立微宇宙群落模型，其中微藻生长考虑密度制约，浮游动物生长不考虑密度制约，污染物浓度与模型系数之间的变化关系通过若干基于种群水平上反应终点的生态毒性效应函数来构造，这样便将生态毒性效应模型嵌入到了微宇宙群落模型当中，构建成能够反映污染物生态毒性效应的微宇宙群落模型。

结果分析：利用竞争-摄食等生态关系建立起来的微宇宙群落模型，将若干种群水平上的反应终点与群落水平上的反应终点关联起来，由种群水平上的污染物浓度与毒性效应之间的定量关系构造出群落水平上的污染物浓度与毒性效应之间的定量关系。

4、微宇宙周期生物量的计算

在上述实验条件下，微宇宙群落中各个生物种群生物量呈周期性变化，且变化周期也不尽相同(T_D,T_B,T_P1,T_P2)。应用微宇宙模型模拟计算微宇宙群落中各种群生物量的变化周期(最小正周期)，计算它们的最小公倍数，获得整个微宇宙群落生物量变化的最小正周期(T)，进而计算一定污染物浓度下整个微宇宙群落周期生物量均值M_T(D_T,B_T,P1_T,P2_T)。

结果分析：微宇宙群落周期生物量均值能够表征微宇宙群落生物量的周期变化特征。以一定污染物浓度下整个微宇宙群落周期生物量均值作为毒性效应的反应终点，不仅比种群水平上的反应终点具有更高的生态相关性，而且比特定取样日生物量作为反应终点具有更高的代表性、可比性和可靠性。

5、阈值浓度的测算及验证：

微宇宙群落周期生物量均值是群落水平上的毒性效应反应终点。在一定的污染物浓度条件下，微宇宙群落周期生物量均值M_T(D_T,B_T,P1_T,P2_T)发生变化，偏离原来微宇宙群落周期生物量均值M_T*(D_T*,B_T*,P1_T*,P2_T*)，这里我们将未使微宇宙群落周期生物量均值M_T(D_T,B_T,P1_T,P2_T)偏离原周期生物量均值M_T*(D_T*,B_T*,P1_T*,P2_T*)(即不具有显著性差异)的最大污染物浓度作为生态毒性效应阈值浓度，并应用蒙特-卡罗方法进行阈值浓度的不确定性分析。

将微宇宙群落毒性效应实验中各污染物浓度下浮游生物种群生物量测定结果(Dt,Bt,P1t,P2t)与模型计算的相应结果(Dt,Bt,P1t,P2t)进行比对，计算得到模型拟合优度R²>0.9，检验模型计算的微宇宙群落周期生物量均值M_T(D_T,B_T,P1_T,P2_T)与实验测定的微宇宙群落周期生物量均值M_T(D_T,B_T,P1_T,P2_T)没有显著性差异，从而验证了模型计算结果的可靠性。

结论：以一定污染物浓度下微宇宙群落周期生物量均值是否偏离对照微宇宙群落周期生物量均值为阈值浓度的判据，是否偏移通过检验其与对照实验是否有显著性差异来判断，置信区间通过蒙特-卡罗方法获得。基于微宇宙群落周期生物量测算的环丙沙星(CIP)生态毒性效应阈值浓度结果为1.3±0.2mg/L。

应用本发明的方法，基于青岛大扁藻、球等鞭金、褶皱臂尾轮虫、大型溞等种群毒性效应实验数据，以微宇宙群落周期生物量均值的偏离为判据测算的污染物生态毒性效应阈值浓度，与由青岛大扁藻、球等鞭金藻、褶皱臂尾轮虫、大型溞构成的微宇宙群落的测定结果基本一致。这一结果进一步验证了由微宇宙群落周期生物量均值作为反应终点测算污染物生态毒性效应阈值浓度的可操作性及可靠性，同时也表明了本发明方法在水环境污染物毒性效应阈值浓度测算中具有一定的应用价值。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。