本发明涉及一种基于抗凝血生化指数评价三七活血作用的方法。
背景技术：
三七为五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根及根茎。具有活血化瘀、消肿止痛功效，与其药效活性相关的成分为皂苷类成分，包括人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd等。现代药理研究表明，三七具有明显抗凝、抑制血小板聚集、促进纤维蛋白溶解作用，且在抗炎镇痛方面也具有良好效果。其中三七抗凝血作用与其传统功效“活血化瘀”具有重要的相关性。
作为临床大宗中药，如何对三七质量进行有效评控将对保证其临床疗效和促进其产品开发具有重要意义。在2015版《中国药典》中，以人参皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1为三七指标性成分，通过限定三个成分总量不少于5.0％来控制其质量。但是，与三七活性相关的不仅只是这三个成分，且这种简单的含量相加并未反映出不同成分对其整体药效的贡献度差异，忽视了不同成分所关联的药效大小有所区别，实际应用时难以评价不同样品的品质优劣情况。例如，前期研究发现，两批三七药材中，一批样品的人参皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1含量分别为3.0％、3.3％及1.0％，另一批为4.0％、2.6％及0.7％，两批样品的成分总量皆为7.3％，此时又如何通过这一指标来评价二者品质孰优孰劣呢？除此，三七皂苷R1的主要活性为止血，根据前期研究发现，其抗凝血作用显著低于其他皂苷类成分，这提示我们评价中药质量，不应只寻求易获取或特异性成分作为指标，而应考虑不同的临床效用需求建立个体化的质量评价指标。
临床效果是评价中药质量的金标准，因此合理的质量评价方法及指标应关联中药功效或药效活性。但若仅在当前成分含测的基础上单纯添加这些药效活性指标，则会增加今后质控标准施行时的难度和复杂度。因为每个药效指标的增添，会导致每种药材有更多要满足的标准，更多繁琐的操作，耗费更多实验材料和实验动物，这势必会造成能源资源的浪费。况且，这种多指标质控模式所带来的贡献度差异问题依然没有解决，无法说明其中哪个指标对药材质量有更重要的关联。
因此，若能建立一种综合的既能直接关切可控有效，又不会增加施行难度，同时能指导三七临床用药的质量评控方法，将对三七及其他中药质量评控标准的完善具有重要意义。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种综合的既能直接关切可控有效，又不会增加施行难度，同时能指导三七临床用药的质量评控方法的基于抗凝血生化指数评价三七活血作用的方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种基于抗凝血生化指数评价三七活血作用的方法，包括步骤：
1)测定三七中活性成分的含量；
2)检测活性成分的抗凝血效应；
3)计算三七抗凝血生化指数；
4)根据抗凝血生化指数来评价三七的活血作用并指导其用药剂量调节。
作为优选的技术方案，所述步骤1)中的活性成分为人参皂苷Rg1，Re，Rb1和Rd。
作为优选的技术方案，所述步骤2)中抗凝血效应检测包括步骤：
①样品溶液配制：精取人参皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd，分别用生理盐水配制成浓度梯度为0.05、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75、0.90、1.05、1.20mg/mL的溶液；
②小鼠眼球静脉取血，全血与抗凝剂9:1体积比混匀，2500r/min离心15min制备待测血浆，以体积比血浆：生理盐水＝2:1比例共50μL加入测定杯中，37℃预温3min后加入共同预温3～5min的0.1mol/L pH 7.4Tris-HCl缓冲液稀释的10U/mL凝血活酶溶液100μL，记录下凝血酶原初始时间PT0，用不同浓度的凝血活酶，测得凝血酶原时间PT，计算PT延长率(％)，以lgPT延长率(％)对凝血酶原复合物浓度作图，得到凝血活酶浓度对lgPT延长率(％)的影响的标准曲线，每个样品至少重复测定3次；
③血浆-活性成分(2：1)混合血浆样品50μL加入测定杯中，37℃预温3min后加入共同预温3～5min的10U/mL凝血活酶溶液100μL，记录下PT'，计算lgPT'延长率(％)；
④根据标准曲线相对应的凝血活酶浓度(Ui)，计算活性成分对应的凝血活酶抑制率(％)：
凝血活酶抑制率(％)＝(Ui-10)/10*100％；
⑤根据活性成分对凝血活酶的抑制率计算各成分抗凝血效应EC50。
作为优选的技术方案，所述抗凝剂为0.109mol/L的枸橼酸钠。
作为优选的技术方案，所述步骤3)中计算三七抗凝血生化指数：
BCI抗凝血＝0.1160*XRg1+0.0777*XRe+0.0553*XRb1+0.1460*XRd；其中，XRg1、XRe、XRb1、XRd分别代表每0.3g三七中人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的含量，％。
作为优选的技术方案，所述步骤(4)根据抗凝血生化指数来评价三七的活血作用并指导其用药剂量调节，包括以下步骤：
①根据抗凝血生化指数值大小评价三七活血作用；
②调节三七实际用药剂量：
D实际＝D目标/BCI抗凝血；其中，D实际为待测三七的实际用量，D目标为待测三七的目标用量。
作为优选的技术方案，所述三七为五加科人参属植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥主根、剪口、侧根、饮片。
由于采用了上述技术方案，一种基于抗凝血生化指数评价三七活血作用的方法，包括步骤：1)测定三七中活性成分的含量；2)检测活性成分的抗凝血效应；3)计算三七抗凝血生化指数；4)根据抗凝血生化指数来评价三七的活血作用并指导其用药剂量调节；本发明能整合化学分析及生物评价优势，具有关联功效、重现性强、操作易行等特点，可仅通过检测三七中活性成分含量而体现其活血作用，对评价三七药材及饮片质量、指导临床用药标准的完善具有重要意义。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
一种基于抗凝血生化指数评价三七活血作用的方法，包括步骤：
1)测定三七中活性成分的含量；
2)检测活性成分的抗凝血效应；
3)计算三七抗凝血生化指数；
4)根据抗凝血生化指数来评价三七的活血作用并指导其用药剂量调节。
所述步骤1)中的活性成分为人参皂苷Rg1，Re，Rb1和Rd。
所述步骤2)中抗凝血效应检测包括步骤：
①样品溶液配制：精取人参皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd，分别用生理盐水配制成浓度梯度为0.05、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75、0.90、1.05、1.20mg/mL的溶液；
②小鼠眼球静脉取血，全血与抗凝剂9:1体积比混匀，2500r/min离心15min制备待测血浆，以体积比血浆：生理盐水＝2:1比例共50μL加入测定杯中，37℃预温3min后加入共同预温3～5min的0.1mol/L pH 7.4Tris-HCl缓冲液稀释的10U/mL凝血活酶溶液100μL，记录下凝血酶原初始时间PT0，用不同浓度的凝血活酶，测得凝血酶原时间PT，计算PT延长率(％)，以lgPT延长率(％)对凝血酶原复合物浓度作图，得到凝血活酶浓度对lgPT延长率(％)的影响的标准曲线，每个样品至少重复测定3次；
③血浆-活性成分(2：1)混合血浆样品50μL加入测定杯中，37℃预温3min后加入共同预温3～5min的10U/mL凝血活酶溶液100μL，记录下PT'，计算lgPT'延长率(％)；
④根据标准曲线相对应的凝血活酶浓度(Ui)，计算活性成分对应的凝血活酶抑制率(％)：
凝血活酶抑制率(％)＝(Ui-10)/10*100％；
⑤根据活性成分对凝血活酶的抑制率计算各成分抗凝血效应EC50。
所述抗凝剂为0.109mol/L的枸橼酸钠。
所述步骤3)中计算三七抗凝血生化指数：
BCI抗凝血＝0.1160*XRg1+0.0777*XRe+0.0553*XRb1+0.1460*XRd；其中，XRg1、XRe、XRb1、XRd分别代表每0.3g三七中人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的含量，％。
所述步骤(4)根据抗凝血生化指数来评价三七的活血作用并指导其用药剂量调节，包括以下步骤：
①根据抗凝血生化指数值大小评价三七活血作用；
②调节三七实际用药剂量：
D实际＝D目标/BCI抗凝血；其中，D实际为待测三七的实际用量，D目标为待测三七的目标用量。
所述三七为五加科人参属植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥主根、剪口、侧根、饮片。
实施例：
基于抗凝血生化指数评价三七活血作用的方法可对三七药材及饮片进行活血作用评价和临床用量调节实验：
试验中所用到的仪器：粉碎机(FW-135型，上海隆拓仪器设备有限公司)；电子分析天平(CP114型，上海奥豪斯仪器有限公司)；超声波清洗仪(BL10-250A型，上海比朗仪器有限公司)；旋转蒸发仪(RE-5205型，上海亚荣生化仪器厂)；电热恒温水浴锅(DZKW型，北京市永光明医疗仪器有限公司)；压力蒸汽灭菌锅(YXQ-LS-100SII-01-00，上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；LC-20AB高效液相色谱仪(SPD-20A检测器，日本岛津公司)；超纯水器(UPT-1-20T优普系列，成都超纯科技有限公司)；台式高速冷冻离心机(H1650R型，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；血凝仪(XN06系列，武汉景川诊断技术股份有限公司)。
(1)测量所收集的三七样品中人参皂苷Rg1、Re、Rb1及Rd的含量：
(i)三七粉制备：将采自不同产地的三七主根、剪口、侧根和饮片洗净、晒干、粉碎，过40目筛。
(ii)三七水提物制备：分别称取不同三七粉末各5g，每次加入50mL水，80℃下回流提取2次，每次2小时，合并滤液，减压提取液，浓缩至50mL生药浓度为0.1g.mL-1的水提液备用。
(iii)混合对照品溶液制备：分别精密称取人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd对照品置于2mL量瓶中，用甲醇溶解定容，配制成质量浓度分别为0.55、0.50、0.60、0.50mg/mL的混合对照品溶液。
(iv)供试品溶液制备：分别取三七各样品粉末0.30g，精密称定，置于具塞三角瓶中，精密加入70％甲醇25mL，称定质量，放置过夜。超声处理40min，冷却至室温，称定质量，用70％甲醇补足减失的质量，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得。
(v)液相色谱法测量：
色谱条件：色谱柱：Vision HT C18柱(250mm×4.6mm)；流动相：水(A)-乙腈(B)，线性梯度洗脱：(0～20min，20％B；20～45min，20％～46％B；45～55min：46％～5％B；55～60min：55％B)；检测波长：203nm；流速：1.0mL/min；柱温：24℃；进样量：10μL。
测量结果如表1所示。
表1所收集的三七样品活性成分含量(％)
(2)三七抗凝血生化指数的构建：
(i)样品溶液配制：精取人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd分别用生理盐水配制成浓度梯度为0.05、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75、0.90、1.05、1.20mg/mL的溶液。
(ii)抗凝血效应检测：
小鼠眼球静脉取血，全血与抗凝剂(0.109mol/L枸橼酸钠)9:1混匀，2500r/min离心15min制备待测血浆。以血浆：生理盐水＝2:1比例共50μL加入测定杯中，37℃预温3min后加入共同预温一定时间的0.1mol/L PH 7.4Tris-HCl缓冲液稀释的10U/mL凝血活酶溶液100μL，记录下PT0。每个样品至少重复测3次。
用不同浓度的凝血活酶，测得凝血酶原时间PT，计算PT延长率(％)。
PT延长率(％)＝(PT-PT0)/PT0*100％。
以lgPT延长率(％)对凝血酶原复合物浓度作图，得到凝血活酶浓度对lgPT延长率(％)的影响的标准曲线。
血浆-单体皂苷(2：1)混合血浆样品50μL加入测定杯中，37℃预温3min后加入共同预温一定时间的10U/mL凝血活酶溶液100μL，记录下PT'，计算lgPT'延长率(％)。
PT'延长率(％)＝PT'(加单体皂苷)-PT0'(生理盐水)/PT0'(生理盐水)*100％；
根据标准曲线相对应的凝血活酶浓度(Ui)，并计算对应的凝血活酶抑制率(％)：
凝血活酶抑制率(％)＝(Ui-10)/10*100％；
相应数据通过Origin 8.5软件(Origin Lab公司，美国)作图。利用Graphpad Prism 5(Graphpad Software公司，美国)进行抗凝血效应EC50计算。结果见表2。
表2三七样品中活性成分抗凝血效应
将此四种活性成分的量效关系方程加和得到三七抗凝血效应加和值，与对照药材成分抗凝血效应加和值1.5267之比，即为不同生、熟三七样品的抗凝血效应当量因子方程，即公式：
BCI抗凝血＝0.1160*XRg1+0.0777*XRe+0.0553*XRb1+0.1460*XRd；
(3)验证三七抗凝血生化指数对其药效活性的代表性：
(i)样品溶液配制：将上述三七水提物分别用生理盐水稀释为原溶液的1/2，1/3，1/4，1/5，1/8，1/10浓度。
(ii)抗凝血效应检测：
采集健康小鼠静脉血，立即与0.109mol/L枸橼酸钠溶液按9:1的比例充分混合均匀。以每分钟3000转离心10～15min分离出上层贫血小板血浆。将上述配制成的不同浓度生、熟三七水提物溶液分别按1:2比例与贫血小板血浆混合均匀，即得待测混合血浆。血浆-单体皂苷(2:1)混合血浆样品50μL加入测定杯中，37℃预温3min后加入共同预温一定时间的10U/mL凝血活酶溶液100μL，记录下PT'，计算lgPT'延长率(％)。
PT'延长率(％)＝PT'(加提取物)-PT0'(生理盐水)/PT0'(生理盐水)*100％；
根据标准曲线相对应的凝血活酶浓度(Ui)，并计算对应的凝血活酶抑制率(％)：
凝血活酶抑制率(％)＝(Ui-10)/10*100％。
(iii)相应数据通过Origin 8.5软件(Origin Lab公司，美国)作图。利用Graphpad Prism 5(Graphpad Software公司，美国)进行抗凝血效应EC50计算。
(iv)将不同三七水提物的活性成分含量值带入公式BCI抗凝血＝0.1160*XRg1+0.0777*XRe+0.0553*XRb1+0.1460*XRd，计算它们的BCI抗凝血，将各样品的实测EC50与BCI抗凝血进行相关性分析，结果如表3所示，说明二者具有显著相关性，BCI抗凝血能较好地代表三七抗凝血效应，即BCI抗凝血高者，其抗凝血效应较好，活血作用较优；反之，BCI抗凝血较低者，其抗凝血效应较差，活血作用稍次。
表3三七BCI抗凝血与实测抗凝血效应的相关性分析
三七抗凝血生化指数BCI抗凝血的具体应用：
根据以上实施例结果可以看出，不同部位、不同炮制条件处理的三七药材，其抗凝血生化指数存在较大差异。例如生三七主根的抗凝血效应远远优于120℃蒸制2h的主根样品，因此在临床应用中应注意区别用量，对用于活血功效的同一目标剂量而言，抗凝血生化指数低的药材应通过换算适当增加剂量；反之，以此保证三七临床功效的有效性。例如针对表3中具有不同抗凝血生化指数的12批三七样品，假设目标剂量D目标为1克，通过公式D实际＝D目标/BCI抗凝血，换算后的实际用量如表4所示：
表4三七药材的实际用量
同理可以计算其他三七药材或饮片用于活血功效时的实际剂量，以保证用药效果的稳定性。
本发明所建立的基于抗凝血生化指数评价三七活血作用的方法经验证能较好地代表三七抗凝血活性。由于直接给每个活性成分分配了药效权重系数，系数越大，则该成分对三七抗凝血效应的代表性越强。在临床使用评控三七质量时，可直接通过检测成分含量去体现该三七之“效”，不增加质量标准的施行难度，实现中药质量评控模式的简单易行、科学有效。同时，抗凝血生化指数可在一定程度指导三七用于活血功效时的临床用药，指数高的药材在临床使用时可适当降低用量，指数低的药材可增加临床用量，以保证用药效果的稳定性。综上，基于抗凝血生化指数评价三七活血作用的方法，使科学量化地关联三七功效和指导临床用药成为可能。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
一切从本发明的构思出发，不经过创造性劳动所作出的结构变换均落在本发明的保护范围之内。