一种流式细胞仪荧光寿命时域测量方法与流程

本发明涉及荧光检测及光谱分析领域，具体涉及流式细胞仪的荧光强度检测及荧光寿命时域估算领域。

背景技术：

流式细胞仪是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术和单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。对悬液中处于高速、直线流动的单细胞或其他颗粒，通过检测散射光信号和(或)标记的荧光信号，实现高速逐一的多参数定量分析。在细胞生物学、细胞周期动力学、免疫学、血液学及肿瘤学等领域具有广泛的应用。

流式细胞仪对悬液中处于高速、直线流动的单细胞或其他颗粒，通过检测散射光信号和(或)标记的荧光信号，实现高速逐一的多参数定量分析。在细胞生物学、细胞周期动力学、免疫学、血液学及肿瘤学等领域具有广泛的应用。流式细胞仪实现前向散射光(fs)、侧向散射光(ss)及各色荧光信号(fln)的收集及光电转换，并对转换后的脉冲信号进行多参数提取，最终根据提取得到的多参数实现对细胞/微球的统计学分析。荧光寿命测量能够提供有机荧光素、荧光蛋白和其他可发荧光的无机分子相关的荧光弛豫、强度衰减等信息。并且荧光寿命不存在荧光强度测量过程中存在的非线性问题，所以荧光寿命被引入到流式细胞仪单细胞测量中作为一个多参数信息。

应用到流式分析的荧光寿命测量方法主要有频域方法和时域方法两种。频域方法系统中，通过高频正弦信号对激发光源进行调制，从而使激发出的荧光信号与激发光具有相同的调制频率，并且两者之间存在一定的相移。时域方法系统中，利用飞秒激光器作为激发光源对样品或细胞进行激发，通过单光子计数器及指数衰减模型对荧光衰减时间进行观测。频域方法和时域方法都会大大增加传统流式细胞仪的成本及复杂程度。

2014年c.ruofan等人提出利用数字信号处理方法对传统流式细胞仪荧光信号时延进行分析，在不改变流式细胞仪结构的情况下采用250mbps高速adc芯片对荧光信号进行采样并利用(directmethod、gaussianfitting、halfarea)3种方法对荧光寿命进行计算，计算结果的时域分辨能力受限于adc的采样频率。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种流式细胞仪荧光寿命时域测量方法，所述方法包括以下步骤：

1)利用mczt法对荧光脉冲信号与前向散射光脉冲信号的互相关谱进行细化，

其中，fs(n)表示前向散射光脉冲信号，flm(n)表示各路荧光脉冲信号，m＝1,2,3；k＝0,1,…,n-1；

2)利用ficp算法实现时域互相关函数的计算，并通过适当插值提高时域分辨率：

由fs(k)和flm(k)构造完整的互相关谱rm(k)如公式(2)所示：

按照公式(3)和(4)分别对前半部分和后半部分时域相关函数进行求解：

其中k＝0,1,…,n-1，

由r1(n)和r2(n)可以构造出完整的时域相关函数如式(5)，任意设置n2可以使时域互相关函数峰的分辨率提高n2/n1倍，

应当理解，前述大体的描述和后续详尽的描述均为示例性说明和解释，并不应当用作对本发明所要求保护内容的限制。

附图说明

参考随附的附图，本发明更多的目的、功能和优点将通过本发明实施方式的如下描述得以阐明，其中：

图1为荧光脉冲产生及时延原理示意图；

图2为各路荧光信号与前向散射光信号的互相关谱波形图；其中图2(a)为直接利用fft计算互相关谱，图2(b)利用mczt频谱细化计算互相关谱；

图3为各通道荧光信号与前向散射光的时域互相关函数图，其中图3(a)为ifft算法得到的时域互相关函数；图3(b)为ficp算法10倍插值得到的时域互相关函数；图3(c)为ifft算法得到的图3(a)中fl2的相关峰细节；图3(d)为ficp算法10倍插值计算结果(b)中fl2的相关峰细节。

图4为荧光脉冲信号直方图，其中，图4(a)为fl1峰值直方图，图4(b)为fl2峰值直方图，图4(c)为fl3峰值直方图，图4(d)为fl1时延直方图，图4(e)为fl2时延直方图，图4(f)为fl3时延直方图。

具体实施方式

通过参考示范性实施例，本发明的目的和功能以及用于实现这些目的和功能的方法将得以阐明。然而，本发明并不受限于以下所公开的示范性实施例；可以通过不同形式来对其加以实现。说明书的实质仅仅是帮助相关领域技术人员综合理解本发明的具体细节。

在下文中，将参考附图描述本发明的实施例。在附图中，相同的附图标记代表相同或类似的部件，或者相同或类似的步骤。

本发明提供了一种高分辨率荧光时延估计方法，实现对荧光寿命的测量。首先，利用改进的线性调频z变换(mczt)对荧光脉冲信号与前向散射光脉冲信号的互相关谱进行细化，避免标准fft栅栏效应引起的信息丢失。然后，利用ficp(fineinterpolationofcorrelationpeak)算法实现时域互相关函数的计算，并通过适当插值提高时域分辨率。高分辨率荧光时延估计方法具有：(1)硬件电路系统结构简单，易于实现；(2)避免了光强调制及高速处理模块之间的同步等问题；(3)完全由数字信号处理芯片完成，计算速度快，灵活性好；(4)计算所得荧光寿命的时域分辨率不受adc采样频率限制等优势。

在流式细胞仪检测过程中，散射光及荧光脉冲信号的产生原理如图1所示，微球到达整形后的激发光斑上边缘位置a时，开始产生前向散射光信号及各路荧光信号，并随着光斑内光强逐渐增强，输出信号随之增大；当微球到达光斑光强最大位置b时，相应的散射光及各路荧光信号达到最大值；当微球达到光斑下边缘位置c时，前向散射光信号及各路荧光信号输出值将为0。

本发明对前向散射光脉冲信号及各路荧光脉冲信号的频谱进行分析，并按照公式(1)利用mczt算法对一定频率范围内的频谱信息进行细化，得到细化后的高频谱分辨率频域信息。采用mczt计算信号的频谱，可以针对超短取样信号计算细化的频谱，其频谱分辨率不受取样长度和采样率的制约，还可以对某一段频谱进行细化计算。

前向散射光脉冲信号fs(n)及各路荧光脉冲信号flm(n)均为包含n点数据的脉冲序列，相应的细化频谱分别为fs(k)和flm(k)。

其中m＝1,2,3；k＝0,1,…,n-1。

fft算法无法分辨有效频谱范围的细节信息。相对于利用fft计算得到的互相关谱，mczt进行n1/n倍细化频谱能够避免fft算法产生的栅栏效应，具有更高的频谱分辨率避免频谱信息的丢失，从而使得互相关谱曲线更加光滑。

由抽样定理知fs(k)和flm(k)为周期为n1的周期函数，并且左半部分和右半部分具有共轭对称特性。由ficp算法可知，在频谱内进行插值使频谱周期扩展为n2，可在不增加计算量的前提下将相应的时域采样频率提高为原有采样频率的n2/n1倍，从而提高荧光脉冲信号时延估计的准确性。由fs(k)和flm(k)构造完整的互相关谱rm(k)如公式(2)所示。

各通道荧光脉冲信号的时延总是处在有限范围内，互相关函数的主峰处在零值附近，在这种情况下，只需要计算互相关波形的左边有限点(后半部分)和右边有限点(前半部分)。按照公式(3)和(4)分别对前半部分和后半部分时域相关函数进行求解。

其中k＝0,1,…,n-1。

由r1(n)和r2(n)可以构造出完整的时域相关函数如式(5)，任意设置n2可以使时域互相关函数峰的分辨率提高n2/n1倍。

本发明的一个具体实施例对脉宽为4μs左右的荧光脉冲信号进行处理，fs、flm的采样频率为100mhz，即脉冲序列相邻数据点之间的时间间隔为10ns。

计算得到的互相关谱如图2所示，其中图2(a)为直接利用fft计算得到的互相关谱，图2(b)为利用mczt进行n1/n倍细化得到的频谱。由图2可知，fft算法能够得到-4≤k≤4范围内的有效频谱信息，但无法分辨该频谱范围的细节信息。相对于利用fft计算得到的互相关谱，mczt进行n1/n倍细化频谱能够避免fft算法产生的栅栏效应，可以得到得到-8×n1/n≤k≤8×n1/n(图2中取n1/n＝10)范围内的有效频谱信息，具有更高的频谱分辨率避免频谱信息的丢失，从而使得互相关谱曲线更加光滑。

本发明设定n2/n1＝10，分别利用ifft算法及ficp算法计算时域相关函数曲线如图3所示。提高互相关谱的频谱分辨率可以使互相关波形更光滑，相关峰顶更圆，并且频谱的细化不受采样长度n的影响；同时，提高插值的倍数，可以使相关峰顶分辨率提高，采用ficp算法，可以任意‘放大’互相关峰，使得对时延估计的精度更高，特别是对于低采样的信号，其优点更明显。图3(a)利用ifft计算得到的fl1、fl2和fl3相对于fs的脉冲时延分别为760ns(76×10ns)、750ns(75×10ns)和790ns(79×10ns),时间分辨率为10ns；图3(b)利用10倍插值ficp算法，时间分辨率为计算得到的相应的荧光脉冲时延分别为765ns(765×1ns)、748ns(748×1ns)和772ns(772×1ns)。比较可以看出，ficp算法可以提高时域互相关函数的时间分辨率，脉冲时延估计精度更高。

本发明利用流式细胞仪执行校准操作对标准荧光微球进行测量，并对1000个events的荧光信号分别进行峰值及荧光寿命的计算。对1000组数据进行统计学分析，得到各荧光信号的峰值分布直方图及脉冲时延分布直方图如图4所示。其中，图4(a)为fl1峰值直方图，图4(b)为fl2峰值直方图，图4(c)为fl3峰值直方图，图4(d)为fl1时延直方图，图4(e)为fl2时延直方图，图4(f)为fl3时延直方图。荧光fl1强度分布范围为0.74～1.38v，平均值为1.23v，标准差为0.118；荧光fl2强度分布范围为1.44～3.07v，平均值为2.56v，标准差为0.292；荧光fl3强度分布范围为0.66～1.57v，平均值为1.22v，标准差为0.210。荧光fl1脉冲延时分布范围为0.740～0.796μs，平均值为0.759μs，标准差为0.009；荧光fl2脉冲延时分布范围为0.722～0.782μs，平均值为0.751μs，标准差为0.011；荧光fl3脉冲延时分布范围为0.752～0.804μs，平均值为0.773μs，标准差为0.008。由图4及以上分析可以看出，相对于荧光峰值表征方法，荧光脉冲时延估计表征方法具有更小的分布范围，更小的标准差。从而可以提高常用散点图中相应细胞类群的分布密度，同时提高细胞分群分析的准确性。

结合这里披露的本发明的说明和实践，本发明的其他实施例对于本领域技术人员都是易于想到和理解的。说明和实施例仅被认为是示例性的，本发明的真正范围和主旨均由权利要求所限定。