物种之间转化速率的获取方法及装置与流程

本发明实施例涉及荧光分析领域，尤其涉及一种物种之间转化速率的获取方法及装置。
背景技术：
：随着近年来光学检测技术的发展，荧光相关光谱能够对物质性质、分子间相互作用、生物样品以及药物筛选等方面进行检测。自然界中存在许多亚稳态之间的化学反应，例如一些生物大分子的构象转变，分子复合物的吸附解吸附等。这些反应通常具有重要的意义：蛋白质的构象转变通常伴随着功能的改变，从而导致一些疾病的产生；生物大分子在纳米材料界面的吸附解吸附是评估纳米材料生物效应及安全性的重要方面。因此，研究物种中分子间的化学反应至关重要。荧光相关光谱(FluorescenceCorrelationSpectroscopy，FCS)是一种常用的研究分子扩散及化学反应动力学的方法，可测定微区内(<10-15L)荧光团由于布朗运动或化学反应而导致的荧光强度涨落，是一种重要的单分子检测技术。然而，当体系中存在多个物种时，传统的FCS分析方法得到的是所有物种自相关和互相关的加和，无法对物种进行区分，也就无法获得物种之间相互作用的信息。技术实现要素：本发明实施例提供一种物种之间转化速率的获取方法及装置，以获取物种之间的转化速率。第一方面，本发明实施例提供了一种物种之间转化速率的获取方法，包括：基于获取的光子流数据获取荧光寿命衰减曲线；其中，所述光子流数据包括光子到达检测器的宏观时间和微观时间，所述宏观时间为从第一个激光脉冲的发射时间开始计时，所述光子到达检测器时所对应的时间，所述微观时间为从激发所述光子的激光脉冲的发射时间开始计时，所述光子到达检测器时所对应的时间；对所述荧光寿命衰减曲线进行拟合，获取各物种的荧光寿命分布；基于所述宏观时间和所述微观时间确定预设数量的二维荧光寿命相关谱；通过所述荧光寿命分布对所述二维荧光寿命相关谱进行处理，获得各物种之间相互转化的速率。第二方面，本发明实施例还提供了一种物种之间转化速率的获取装置，包括：荧光寿命衰减曲线获取模块，用于基于获取的光子流数据获取荧光寿命衰减曲线；其中，所述光子流数据包括光子到达检测器的宏观时间和微观时间，所述宏观时间为从第一个激光脉冲的发射时间开始计时，所述光子到达检测器时所对应的时间，所述微观时间为从激发所述光子的激光脉冲的发射时间开始计时，所述光子到达检测器时所对应的时间；荧光寿命分布获取模块，用于对所述荧光寿命衰减曲线进行拟合，获取各物种的荧光寿命分布；二维荧光寿命相关谱获取模块，用于基于所述宏观时间和微观时间确定预设数量的二维荧光寿命相关谱；速率获取模块，用于通过所述荧光寿命分布对所述二维荧光寿命相关谱进行处理，获得各物种之间相互转化的速率。本发明实施例提供了一种物种之间转化速率的获取方法及装置，通过获取荧光寿命分布与基于宏观时间和微观时间所确定的二维荧光寿命相关谱，解决了传统的FCS分析方法对同一体系含有多个物种时，无法获得物种之间相互作用的问题，不仅可以对物种进行区分，还实现了定量获得物种间转化速率的有益效果。附图说明图1A是本发明实施例一中的一种物种之间转化速率的获取方法的流程图；图1B是本发明实施例一中的一种物种之间转化速率的获取方法中样品的荧光寿命衰减的曲线示意图；图1C是本发明实施例一中的一种物种之间转化速率的获取方法中样品的荧光寿命分布示意图；图1D是本发明实施例一中的一种物种之间转化速率的获取方法中样品的二维荧光寿命相关谱示意图；图1E是本发明实施例一中的一种物种之间转化速率的获取方法中样品的物种间相关性的示意图；图1F是本发明实施例一中的一种物种之间转化速率的获取方法中样品的荧光寿命衰减曲的线示意图；图1G是本发明实施例一中的一种物种之间转化速率的获取方法中的荧光寿命分布示意图；图1H是本发明实施例一中的一种物种之间转化速率的获取方法中的二维荧光寿命相关谱示意图；图1I是本发明实施例一中的一种物种之间转化速率的获取方法中的物种间相关性的示意图；图2A是本发明实施例二中的一种物种之间转化速率的获取装置的结构示意图；图2B是本发明实施例二中的一种物种之间转化速率的获取装置的结构示意图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本发明相关的部分而非全部结构。实施例一图1A为本发明实施例一提供的一种物种之间转化速率的获取方法的流程图，本实施例可适用于多个物种之间转化速率的获取的情况，该方法可以由本发明实施例提供的物种之间转化速率的获取装置来执行，该装置可采用软件和/或硬件的方式实现，该装置可集成在任何提供物种之间转化速率的获取功能的设备中，如图1A所示，具体包括：S110、基于获取的光子流数据获取荧光寿命衰减曲线；其中，所述光子流数据包括光子到达检测器的宏观时间和微观时间，所述宏观时间为从第一个激光脉冲的发射时间开始计时，所述光子到达检测器时所对应的时间，所述微观时间为从激发所述光子的激光脉冲的发射时间开始计时，所述光子到达检测器时所对应的时间。本发明实施例采用TTTR(Time-taggedtimeresolved，时间标记时间分辨)模式的荧光寿命相关光谱(FluorescenceLifetimeCorrelationSpectroscopy，FLCS)，通过二维荧光寿命去卷积的数据处理方法，计算物种之间的转化速率，采用的测量仪器包括光源、共聚焦光学系统、数据采集系统和检测器等部分。其中，共聚焦光学系统包括二色镜、透镜和滤光片；数据采集系统为时间相关单光子计数器；检测器通常为高灵敏度的单光子检测器。具体的，光源产生的激光光束经二色镜反射后由透镜聚焦在样品上，激发样品中的荧光分子，样品产生的荧光通过同一个物镜收集，并由单光子检测器检测。当一束激光照射与激光能量匹配的某荧光物质时，该物质的电子吸收能量后从基态跃迁到某一激发态上，由于在激发态上的电子具有不稳定性，因此，激发态上的电子再以辐射跃迁的形式回到基态并发出光子，从而产生荧光。当激发停止后，分子的荧光强度降到激发时最大强度的1/e所需的时间即光子在激发态上停留的平均时间称为荧光寿命，荧光强度即光子数目。记录脉冲激光激发样品产生的光子序列信息，即光子流数据，包括光子到达检测器的宏观时间、微观时间以及光子数目，如表一所示。光子数目宏观时间(ms)微观时间(ns)145525663685N2448具体的，单光子计数器只记录了在每一个脉冲下，第一个到达检测器的光子的宏观时间和微观时间。其中，宏观时间为从测量开始计时，光子到达检测器时所对应的时间；微观时间为从激发所述光子的激光脉冲的发射时间开始计时，光子到达检测器时所对应的时间。对所得到的光子的微观时间进行统计，即可得到样品荧光寿命衰减曲线，如图1B所示，图1B是样品6nMCy5(τ＝1ns)荧光染料与2.7nMAlexa633(τ＝3.4ns)混合物得到的荧光寿命衰减的曲线。由图1B可知，曲线1为荧光染料Cy5与Alexa633混合物的荧光寿命衰减曲线；曲线2为拟合后的荧光染料Cy5与Alexa633混合物的荧光寿命衰减曲线；曲线3为IRF检测仪器响应函数。S120、对所述荧光寿命衰减曲线进行拟合，获取各物种的荧光寿命分布。荧光物质的荧光寿命与自身的结构、所处环境的极性、粘度等条件有关，因此通过荧光寿命的测定可以直接了解所研究体系发生的变化，而基于本发明实施例后部分提到的二维荧光寿命相关谱能够获得激发态发生的分子与分子间作用以及作用发生的快慢。具体的，可以使用最大熵方法或者最小二乘法对荧光寿命衰减曲线进行拟合分析，得到荧光寿命分布。其中，每个荧光物种均对应一个荧光寿命分布，由该物种荧光寿命分布的峰值可以得到荧光物种的种类及个数，如图1C所示。图1C是样品6nMCy5(τ＝1ns)荧光染料与2.7nMAlexa633(τ＝3.4ns)混合物得到的荧光寿命分布。其中，图1C为荧光物种Cy5的荧光寿命分布与荧光物种Alexa633荧光寿命分布的合成，因为具有两个峰值，因此说明该混合物由两个荧光物种组成，并且将带有两个峰值的荧光寿命分布与标准荧光物种相对比，即可得到荧光物种的种类。本实施例中，示例性的，基于如下的公式可以获取各物种的荧光寿命分布：其中，IRF为检测仪器响应函数，在检测仪器开始使用时，需要使用该检测仪器对标准荧光物种进行检测，获取属于该检测仪器的检测仪器响应函数，用于提高检测的精度，减少误差；I0为荧光寿命衰减最大值，具体为设定微观时间t＝0时的荧光强度；a为荧光寿命分布矩阵；τ为预设的荧光寿命序列，且τ＝{τ1,…,τp,…,τP}，其中，τP为预设的第p个荧光寿命的数值，I(t)为微观时间为t时物种的荧光强度，具体表现为检测到的微观时间为t时的光子数目，且光子数目越多，荧光强度越强，图1B中的荧光强度是用最大的光子数目归一化得到的荧光寿命衰减。具体的，从光子流数据中可以得到各微观时间对应的光子数目，为了简化运算，采用最大的光子数目归一化不同微观时间对应的光子数目，即得到荧光寿命衰减曲线。由于IRF、I0、与I(t)可知，通过上述理论模型采取一定拟合方法拟合荧光寿命衰减分布即可得到物种的荧光寿命分布矩阵a。或者，示例性的，采用最大熵方法拟合荧光寿命衰减曲线得到的荧光寿命分布，拟合目标函数如下公式所示：其中，α表示荧光寿命分布的熵的权重因子，为非负小于1的小数；表示加权残差。并且，基于下述公式计算出与其中，为荧光寿命分布的目标函数；a0为初始迭代的荧光寿命分布，初始分布取任意值；为随着迭代过程变化的迭代荧光寿命分布，D为实验测得的荧光寿命衰减曲线，I表示拟合得到的荧光寿命衰减曲线。在第一步迭代时，令并按下式计算精度截止值Ttest：其中，为梯度运算符，为随着迭代过程变化的权重因子α。若求得Ttest≤10-4，则输出迭代荧光寿命分布，并且待求的荧光寿命分布否则按下式对上一步迭代的加上迭代步长δa。其中，迭代步长由下式确定：其中，为拉普拉斯运算符，β为与收敛陡度相关的可调节常数，E表示与矩阵A维度一致的单位矩阵，然后将加上迭代步长的代入求计算精度截止值Ttest，并判断Ttest是否满足精度要求，如果满足则输出迭代荧光寿命分布，并且待求的荧光寿命分布否则，再按照上述步骤对添加迭代步长继续迭代，直至满足精度要求，并输出满足精度要求的荧光寿命分布。需要说明的是，在本实施例中，中的s与为同一个函数；中的L与为同一个函数；中O与为同一个函数。S130、基于所述宏观时间和所述微观时间确定预设数量的二维荧光寿命相关谱。由于荧光寿命分布为以荧光寿命为分析对象的一维分布，只能得到物种个数及种类，因此将一维的荧光寿命分布扩展到以时间维度为基础的二维荧光寿命相关谱，可以得到物种之间的互相关关系。具体的，在获取的光子流数据中，选取宏观时间之间的时间间隔为ΔT的光子对。以光子对中的两个光子的微观时间分别作为建立的坐标系的横坐标和纵坐标；在坐标系中的各位置记录与之对应的光子对的数目；基于所述光子对的数目、所述宏观时间的时间间隔、所述光子对中两个光子分别对应的微观时间确定二维荧光寿命相关谱。其中，ΔT是以选取次数为变量的函数，并且在本发明实施例中选取的ΔT为呈指数函数变化的一个数值，如21，22，23，24和25等。因此，返回选取宏观时间之间的时间间隔为ΔT的光子对的操作，直至所有光子被选取，以获取预设数量的二维荧光寿命相关谱。并且，二维荧光寿命相关谱的预设数量根据ΔT选取组数有关，即选取了多少个ΔT，就会得到多少组二维荧光寿命相关谱，如图1D所示，图1D为宏观时间为ΔT时，样品6nMCy5(τ＝1ns)荧光染料与2.7nMAlexa633(τ＝3.4ns)混合物得到的二维荧光寿命相关谱的数据结果。其中，二维荧光寿命相关谱的横纵坐标均以微观时间为坐标轴，并且取值范围相同；坐标系中的每一点代表光子对的数目，光子对的数目越多，该点的亮度越强。基于光子对的数目、宏观时间的时间间隔、光子对中两个光子分别对应的微观时间确定二维荧光寿命相关谱M(ΔT,tm,tn)。例如，假设宏观时间T1与宏观时间T2之间的时间间隔为ΔT，且宏观时间T1包含光子微观时间按照从小到大排列的集合t'{t1,…,tm,…tN}，tm为任意一个光子微观时间数值，同样，宏观时间T2包含光子微观时间按照从小到大排列的集合t″{t1,…,tn,…tN}，tn也为任意一个光子微观时间数值，N为自然数。然后，选取在宏观时间T1的条件下微观时间为tm中的一个光子与选取在宏观时间T2的条件下微观时间为tn中的一个光子作为光子对，其中，tm与tn只为区分光子对中两个光子来源于不同的宏观时间取值而设定，实质上tm与tn均表示光子的微观时间，且取值可以相同，也可不同。那么，以宏观时间T1中的光子信息tm为横坐标，以宏观时间T2中的光子信息tn为纵坐标，筛选出符合坐标(tm,tn)的所有光子对的数目，并在符合坐标(tm,tn)处记录出光子对的数目。基于光子对的数目、宏观时间的时间间隔、光子对中两个光子分别对应的微观时间确定二维荧光寿命相关谱M(ΔT,tm,tn)。S140、通过所述荧光寿命分布对所述二维荧光寿命相关谱进行处理，获得各物种之间相互转化的速率。示例性的，通过所述荧光寿命分布对所述二维荧光寿命相关谱进行处理，获得各物种之间相互转化的速率，包括：对二维荧光寿命相关谱进行归一化处理，获取归一化的二维荧光寿命相关谱；通过所述荧光寿命分布对所述归一化的二维荧光寿命相关谱进行处理，获得各物种之间的相关性数据；基于所述相关性数据获得各物种之间的相互转化的速率。示例性的，所述通过荧光寿命分布函数对所述归一化的二维荧光寿命相关谱进行处理，获得各物种之间的相关性数据，包括：基于如下的公式获取各物种之间的相关性数据：其中，Gij(ΔT)为i物种与j物种在宏观时间之间的时间间隔为ΔT时的相关性数据；I0,i与I0,j分别为所述i物种与j物种的荧光强度最大值，且I0,i与I0,j基于如下的公式进行确定：ai为i物种的荧光寿命分布矩阵，aj为j物种的荧光寿命分布矩阵，aS为S物种的荧光寿命分布矩阵，S表示样品中荧光物种的个数；Cij,fitted(ΔT)基于如下的公式进行获得：其中，C(ΔT,tm,tn)为所述归一化的二维荧光寿命相关谱；m，n均为自然数；dm,i与dn,j基于如下的公式进行获得：ap,i与ap,j分别为i物种与j物种在荧光寿命为τp时的光子数占总光子数的比例；P为大于1的自然数，p为1到P之间的自然数。在本实施例中，获取各物种之间的相关性数据的具体过程如下：对上述得到的二维荧光寿命相关谱M(ΔT,tm,tn)采用时间间隔为ΔT，微观时间tm及tn进行归一化，得到归一化的二维荧光寿命相关谱C(ΔT,tm,tn)。归一化的二维荧光寿命相关谱C(ΔT,tm,tn)应该满足如下模型：其中，Cij(ΔT)为i物种与j物种在宏观时间之间的时间间隔为ΔT时的相关性数据Gij(ΔT)归一化之前的相关性数据。通过荧光寿命分布对得到的不同△T下的归一化的二维荧光寿命相关谱C(ΔT,tm,tn)进行去卷积处理，写成矩阵的形式，如下公式：C(ΔT,tm,tn)＝TACij(ΔT)ATTT其中，AT、TT分别表示矩阵T、A的转置矩阵。矩阵T设定为如下公式：或者，矩阵A设定为如下公式：或者，如果，归一化的二维荧光寿命相关谱C(ΔT,tm,tn)表示为如下公式：C(ΔT,tm,tn)＝DCij(ΔT)DT其中，矩阵D表示如下：那么，矩阵D中的元素dm,i具体表达为：或者，矩阵D表示如下：那么，矩阵D中的元素dn,j具体表达为：其中，ap,i与ap,j分别为i物种与j物种在荧光寿命为τp时的光子数占总光子数的比例；P为大于1的自然数，p为1到P之间的自然数。则相关性数据Cij(ΔT)的求解可以转化为N2个线性方程的求解，如下公式：因此，拟合相关性数据Cij,fitted(ΔT)也可以转化为N2个线性方程的求解，如下公式：采用最大熵方法或者最小二乘法解上述N2个线性方程，即可得到拟合相关性数据Cij,fitted(ΔT)。示例性的，解关于Cij,fitted(ΔT)的N2个线性方程，可以采用最小二乘法求解，如下公式：其中，表示服从泊松分布的C(ΔT,tm,tn)的标准偏差，χ2为误差小于预设数值的一个值，如0.2、0.4或者0.01等。通过最小二乘法可以求解出误差小于χ2的Cij,fitted(ΔT)。在本实施例中，示例性的，所述基于所述相关性数据获得各物种之间的相互转化的速率包括：基于如下公式获得各物种之间的相互转化的速率：其中，Qi，Qj分别为i物种与j物种的量子产率，Ci，Cj分别为获取的i物种与j物种的摩尔浓度，K＝kij/kji，kij为i物种向j物种转化的转化速率，kji为j物种向i物种转化的转化速率；τD为扩散系数，w为共聚焦显微镜观察区域体积中z轴方向的半径wz与x-y面半径wxy的比值，图1E是样品6nMCy5(τ＝1ns)荧光染料与2.7nMAlexa633(τ＝3.4ns)混合物得到的物种间相关性数据的数据结果，由于6nMCy5(τ＝1ns)荧光染料与2.7nMAlexa633(τ＝3.4ns)为两个物种，因此i的取值为1，j的取值为2。由图1E可知，物种Cy5与物种Alexa633不相关。例如，荧光物种2.5nMCdSe/ZnSe量子点(τ＝22.5ns)与5nM转铁蛋白(Alexa594标记，τ＝3ns)混合物进行物种间转化速率的测定，若假设两个荧光物种记为物种1和物种2，那么，实验结果如图所示。图1F为荧光寿命衰减曲线，其中，曲线4为荧光物种2.5nMCdSe/ZnSe与5nM转铁蛋白混合物的荧光寿命衰减曲线；曲线5为拟合后的荧光物种2.5nMCdSe/ZnSe与5nM转铁蛋白混合物的荧光寿命衰减曲线；曲线6为IRF检测仪器响应函数。图1G为荧光寿命分布、图1H为二维荧光寿命相关谱，通过公式得到G11，G22，G12，G21之后，需对图1I中四条曲线进行联合拟合，最终获得转化速率常数k12和k21。本发明实施例通过获取荧光寿命分布与基于宏观时间和微观时间所确定的二维荧光寿命相关谱，解决了传统的FCS分析方法对同一体系含有多个物种时，无法获得物种之间相互作用的问题，不仅可以对物种进行区分，还实现了获得物种间转换速率的有益效果。实施例二图2A所示为本发明实施例二提供的一种物种之间转化速率的获取装置的结构示意图。如图2A所示，具体包括：荧光寿命衰减曲线获取模块21、荧光寿命分布获取模块22、二维荧光寿命相关谱获取模块23和速率获取模块24。荧光寿命衰减曲线获取模块21，用于基于获取的光子流数据获取荧光寿命衰减曲线；其中，所述光子流数据包括光子到达检测器的宏观时间和微观时间，所述宏观时间为从第一个激光脉冲的发射时间开始计时，所述光子到达检测器时所对应的时间，所述微观时间为从激发所述光子的激光脉冲的发射时间开始计时，所述光子到达检测器时所对应的时间；荧光寿命分布获取模块22，用于对所述荧光寿命衰减曲线进行拟合，获取各物种的荧光寿命分布；二维荧光寿命相关谱获取模块23，用于基于所述宏观时间和微观时间确定预设数量的二维荧光寿命相关谱；速率获取模块24，用于通过所述荧光寿命分布对所述二维荧光寿命相关谱进行处理，获得各物种之间相互转化的速率。在上述实施例的基础上，所述荧光寿命分布获取模块具体用于；基于如下的公式获取各物种的荧光寿命分布：其中，IRF为检测仪器响应函数，a为物种的荧光寿命分布矩阵，τ为预设的荧光寿命序列，且τ＝{τ1,…,τp,…,τP}，其中，τP为预设的第p个荧光寿命的数值，I(t)为微观时间t时刻物种的荧光强度。在上述实施例的基础上，所述二维荧光寿命相关谱获取模块具体用于；在获取的所述光子流数据中，选取所述宏观时间之间的时间间隔为ΔT的光子对；其中，ΔT是以选取次数为变量的函数；以所述光子对中的两个光子的所述微观时间分别作为建立的坐标系的横坐标和纵坐标；在所述坐标系中的各位置记录与所述各位置对应的所述光子对的数目；基于所述光子对的数目、所述宏观时间之间的时间间隔为ΔT与所述光子对中两个光子分别对应的微观时间确定二维荧光寿命相关谱。在上述实施例的基础上，还包括：返回选取所述宏观时间之间的时间间隔为ΔT的光子对的操作，直至所有光子被选取，以获取预设数量的二维荧光寿命相关谱。在上述实施例的基础上，所述速率获取模块包括：二维荧光寿命相关谱获取单元25、相关性数据获得单元26和转化速率获取单元27，如图2B所示。二维荧光寿命相关谱获取单元25，用于对所述二维荧光寿命相关谱进行归一化处理，获取归一化的二维荧光寿命相关谱；相关性数据获得单元26，用于通过所述荧光寿命分布对所述归一化的二维荧光寿命相关谱进行处理，获得各物种之间的相关性数据；转化速率获取单元27，用于基于所述相关性数据获得各物种之间的相互转化的速率。在上述实施例的基础上，所述相关性数据获得单元26具体用于：基于如下的公式获取各物种之间的相关性数据：其中，Gij(ΔT)为i物种与j物种在宏观时间之间的时间间隔为ΔT时的相关性数据；I0,i与I0,j分别为所述i物种与j物种的荧光强度最大值，且I0,i与I0,j基于如下的公式进行确定：ai为i物种的荧光寿命分布矩阵，aj为j物种的荧光寿命分布矩阵，aS为S物种的荧光寿命分布矩阵，S表示样品中荧光物种的个数；Cij,fitted(ΔT)基于如下的公式进行获得：其中，C(ΔT,tm,tn)为所述归一化的二维荧光寿命相关谱；m，n均为自然数；dm,i与dn,j基于如下的公式进行获得：ap,i与ap,j分别为i物种与j物种在荧光寿命为τp时的光子数占总光子数的比例；P为大于1的自然数，p为1到P之间的自然数。在上述实施例的基础上，所述转化速率获取单元27具体用于：基于如下公式获得各物种之间的相互转化的速率：其中，Qi，Qj分别为i物种与j物种的量子产率，Ci，Cj分别为获取的i物种与j物种的摩尔浓度，K＝kij/kji，kij为i物种向j物种转化的转化速率，kji为j物种向i物种转化的转化速率；τD为扩散系数，w为共聚焦显微镜观察区域体积中z轴方向的半径wz与x-y面半径wxy的比值。本实施例所述物种之间转化速率的获取装置用于执行上述实施例所述的物种之间转化速率的获取方法，其技术原理和产生的技术效果类似，这里不再赘述。注意，上述仅为本发明的较佳实施例及所运用技术原理。本领域技术人员会理解，本发明不限于这里所述的特定实施例，对本领域技术人员来说能够进行各种明显的变化、重新调整和替代而不会脱离本发明的保护范围。因此，虽然通过以上实施例对本发明进行了较为详细的说明，但是本发明不仅仅限于以上实施例，在不脱离本发明构思的情况下，还可以包括更多其他等效实施例，而本发明的范围由所附的权利要求范围决定。当前第1页1 2 3