用于最小化色谱应用中扫掠和死体积的装置和方法与流程

本发明涉及一种装置，其包括或由以下组成：(a)色谱柱和(b)流选择器，其中所述流选择器连接到所述柱的远端，使得柱后扫掠体积和柱后死体积的总和小于10μl。

背景技术：

在本说明书中，引用了包括专利申请和制造商手册的多种文献。这些文献的公开虽然不被认为与本发明的可专利性相关，但是通过引用将其全部内容并入本文。更具体地，所有参考文献通过引用并入相同的程度，就像每个单独的文献被具体和单独地指示通过引用并入一样。

分馏/分级分离技术用于许多科学研究和生产过程，诸如化学或生物学中的科学研究和生产过程。分馏的目的是降低感兴趣的样品的复杂性或纯化和消耗非特异性化合物。大多数分馏技术都是基于将所期望化合物与样品其他含量区区分开来的化学和/或物理性质。特别是诸如液相色谱(lc)的色谱系统用于样品分馏和样品收集，用于直接分析或用于进一步处理。色谱分离的分馏效率主要取决于色谱基质的化学性质(meyer,practicalhigh-performanceliquidchromatography(2004))。然而，特别是柱后扫掠和死体积可能导致分离的化合物的湍流和反混合，从而降低分馏性能。

由于优异的分馏效率，因此应用了特别高性能的lc系统，并且扫掠和死体积可能对应用不利。通常增加的流速、零死体积连接以及窄和短的管用于减少反混合的机会和持续时间。然而，根据应用情况，有时不能避免长管，并且较小的内直径可导致高背压。例如，与lc分馏系统一起使用的现有技术的馏分收集器系统需要具有较长的管以到达馏分收集在其中的小瓶。这些馏分收集器通常包括x-/y-机器人臂或收集板，其将管定位在收集样品的管上方或内部(图1)。空间和管长度的限制是常规馏分收集系统的固有问题。

分馏的特定领域是多维分馏，多维分馏通过使用各种正交化学分馏样品来实现优异的分馏。如果要分离具有高度相似化合物的非常复杂的样品，这些方法是特别有意义的。通常选择尺寸以通过不同的生理化学性质分离馏分。例如，随后进行作为第一维的离子交换和作为第二维的反相色谱，以首先根据它们的电荷和其后通过它们的疏水性分离化合物。这些方法可以完全自动化，并由许多lc制造商实施(参见例如dionextechnicalnote85；也可在http://www.dionex.com/en-us/webdocs/77308-tn85-hplc-esi-ms-2d-peptides-14jul2009-lpn2256-01.pdf获得)。即使许多色谱相可以组合，最终的效率受到效率较低的分馏技术的强烈影响。此外，没有相位可以是完全正交的，因此第一维度影响第二维度的分馏效率。将有限正交第一维度的多个馏分混合以实现对第二维度的较小影响的串接(concatenation)方案的发展是减少正交性效应的相对新颖的概念(dwivedietal.,anal.chem.,80(18):7036-42(2008))。如果使用相似的色谱相，并且根据化合物ph或亲和力，使用不同的色谱条件改变化合物的性质，该方法是特别有用的。在串接方案中，在第一维度中生成许多馏分。然后将这些馏分以限定的距离彼此混合。例如，混合60个馏分，使得合并馏分1、11、21、31、41、51，合并馏分2、12、22、32、42、52等等，最终获得10个馏分。该方法仅需要足够的正交性来跨越馏分1至10，但是在第一维中需要非常高的分馏效率以避免反混合。

wo2005/114168描述了用于样品分析的装置。由于该装置是微流体装置，在装置中包括的柱之后不需要配件。该文献无法收集馏分。

技术实现要素：

本发明的技术问题是提供用于色谱分离分析物的改进装置和方法。该问题由权利要求的主题解决。

因此，本发明涉及一种装置，其包括或由以下组成：(a)色谱柱以及(b)流选择器，其中所述流选择器连接到所述柱的远端，使得柱后扫掠体积和柱后死体积的总和小于10μl。

根据第一方面的装置包括两个构成元件或由两个构成元件组成，即可以是全部或空的色谱柱，以及流选择器。流选择器本身是现有技术确定的装置，其提供将流体的进入流引导到多个可能出口(在本文中也称为“通道”)中的一个出口。流选择器的优选实施方案是如下面进一步详细描述的转子阀。根据本发明的流体可以是(优选的)液体或气体。

术语“上端”和“下端”是指柱，柱被配置为使得柱内的流的方向与重力方向相符。更一般来说，特别是考虑到在压力下操作的柱，柱具有近端和远端，其中如本文所用的术语“近端”和“上端”表示样品被加载的端部，并且术语“远端”和“下端”表示分析物在彼此分离或部分分离后离开柱的端部。

重要的是，所述色谱柱和所述流选择器之间的连接基本上是直接的，使得可以满足第一方面的要求。这种大致直接连接的实施在下面进一步详细描述。具有本说明书中提供的指导，技术人员处于能够毫不费力地满足第一方面的要求的位置。作为一般规则，所述色谱柱和所述流选择器之间的连接越短，柱后扫掠体积和柱后死体积将越小。优选地，避免了连接所述柱和所述流选择器的任何管。

应当理解，流选择器在柱的外部。

从以下可以看出，柱后死体积和扫掠体积小于10μl的总和低于目前为止已经取得的成果。本发明人已经实现了低于该阈值的值(见下文)。

术语“柱后扫掠体积”在这里被定义为从柱的远端到分馏、即在所述流选择器中馏分的分开发生的位置的流路径内的液体比例。术语“柱后死体积”表示从柱的远端到分馏、即在所述流选择器中馏分的分开发生的位置的体积，其不被扫过并且不直接在流体的流路径中。柱后死体积和扫掠体积是在离开色谱柱后和进入容器或用于收集所述流体的容器之前由分析物可以到达的体积。在死体积的情况下，扩散是允许分析物进入的过程之一。假定死体积和扫掠体积在一个端部被色谱柱的远端限制，它们也被称为“柱后”死体积/扫掠体积。从上述可以看出，扫掠体积和死体积是可以独立优化的独立参数。本发明旨在将死体积和扫掠体积的总和最小化，该总和也被称为“柱后体积”或“总柱后体积”。总柱后体积被色谱柱的远端和流选择器的出口端口限制，否则占据可接近色谱柱的所述远端和流选择器的所述出口端口之间的分析物的任何体积。

扫掠体积可计算或测量。可基于色谱系统的管的长度和尺寸(例如图1中显示的那些)进行计算。测量可以通过以已知流速下在无泄漏并优选也无死体积的系统中进行色谱并确定给定预期信号的延迟来完成。术语“泄漏”是指系统不紧密，且液体可以通过流路径中的孔泄漏。泄漏可发生在高性能色谱中，其中高压导致泄漏。通过检查整个系统的适当紧密度可避免泄漏。基于柱的空隙体积和流速，可在第一分析物到达流选择器(假设它不会在柱上延迟)时计算时间点。任何与此相反的偏差都表示了柱后扫掠体积的量度。死体积通常发生在配件内。通过适当选择和正确使用配件，可以最小化死体积。

系统非常通用，并且改进了少量化合物以及多种馏分的分馏。术语“馏分”(复数)是指至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个馏分。

此外，本发明适用于如上所述的串接馏分。该概念依赖于在柱后的分离通道中立即主动分开洗脱流，从而减少或甚至移除柱后扫掠和死体积。根据待分馏的样品的应用和复杂性，流可以分成两个或多个通道。请注意，在常规装置(诸如图1所示)中，分馏部位位于管末端。现有技术无法认识到这种分馏方法的固有缺陷。然而，根据本发明，分馏部位是流选择器的出口端口。

本发明的示例性纳米流分馏系统仅具有大约80nl的柱后扫掠体积和低于10nl的柱后死体积。常规馏分收集系统具有10μl或更大的柱后扫掠和死体积的总和。

为了表征色谱过程，现有技术通常使用流速、即每时间单位的体积、诸如体积每分钟。在所述过程的期间中，能够以简单的方式来确定。

本发明以每系统非常少的成本提供优异的性能。优化用于复杂样品的分馏条件是简单的方法。方法可以与超高压纳米流泵一起用于低微量和纳米流应用。本发明允许串接分馏方案的优异分馏和自动化。

在第二方面，本发明提供了一种套件，其包括或由以下组成：(a)色谱柱以及(b)流选择器，其中所述柱和所述流选择器被配置为用于所述流选择器到所述柱的远端的连接，使得柱后扫掠体积和柱后死体积的总和小于10μl。

根据第二方面的套件提供了根据第一方面的以分离形式的装置的两个构成元件。重要的是，两个构成元件被配置为由第二方面所要求的、即用于基本上直接的连接。这样配置用于基本上直接连接的示例性和优选实施方案在下面进一步详细描述，并且包括例如螺钉配件或套圈。

与此一致，本发明的套件还可包括具有用于组装根据第一方面的装置的指令的手册。

在根据第一方面的装置以及根据本发明第二方面的套件的优选实施例中，所述色谱柱(a)是空的；或(b)填充有色谱材料；和/或具有小于2mm的内直径；优选为250μm或更小；或200μm或更小，和/或体积为2ml或更小、1ml或更小、500μl或更小、200μl或更小、优选为100μl或更小、50μl或更小、20μl或更小或10μl或更小。

在柱填充色谱材料的情况下，可以理解，可使用珠式柱以及整体柱。在使用珠的情况下，优选给出的是珠尺寸低于30μm、特别是0.1和10μm之间、诸如1.0、1.5、1.9或2.0μm。

柱的术语“体积”定义了柱的内部体积、即v＝πd²l，d是内直径，l是筒形柱的长度。因此，该术语是指所述柱是空的，即没有色谱材料。

在柱填充有色谱材料的情况下，所述色谱材料优选选自反相、离子交换、正相、混合相、亲水相互作用、亲和与尺寸排阻材料。

上述优选实施例提供使用各种类别的色谱材料。在任何一个类中都有许多现有技术确定的产品。举几个示例，反相材料包括c18、c8和苯基键合材料。离子交换材料包括scx、wcx、sax和wax，正相材料包括二氧化硅。大多数二氧化硅基材料仅在酸性条件下是稳定的。优选的混合相材料包括磺化聚二乙烯基苯(dvb)和磺化聚苯乙烯二乙烯基苯(sdb)。制造商及其商业产品包括sepaxtechnologies(newark，delaware，us)的generikbcx和3m的sdb-rps(例如3m德国，neuss)。另外的制造商是dr.maisch(德国)。示例性亲水相互作用材料，也称为“正相”材料，包括hilic和erlic。亲和材料包括免疫亲和材料、固定化金属离子(imac)以及基于蛋白质相互作用的材料。尺寸排阻材料包括琼脂糖和葡聚糖。

本发明能够以用于纳米流应用或微流应用的柱实施。通常，术语“纳米流”是指1至1000nl/min的流量，术语“微流”是指1至1000μl/min的流速。

优选地，所述柱用于液相色谱。还优选的是，柱由用于微流或纳米流的管组成或包括用于微流或纳米流的管。换句话说，内直径优选为处于0.05和2mm之间的范围。优选的内直径为0.05mm或更小、0.075mm或更小、0.1mm或更小、0.2mm或更小、0.25mm或更小、0.5mm或更小、1.0mm或更小、1.5mm或更小、1.6mm或更小。

优选的柱长度从1cm至100cm，特别优选为从10cm至50cm。

在本发明的装置以及套件的优选实施例中，所述选择器是n型转子阀，n优选为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24。更常见的n值为3、4、6、8、10、12、18和24。转子阀的制造商包括viciaginternational(瑞士)。

在本发明的装置以及套件的另一个优选实施例中，所述柱和所述选择器之间的连接是(a)使得柱后扫掠体积和柱后死体积的总和小于1μl、小于500nl、小于200nl、小于100nl、小于50nl、小于40nl、小于30nl、小于20nl或小于10nl；和/或(b)通过(i)将所述柱直接插入所述选择器的入口中、优选地利用螺钉配件或套圈将所述柱直接插入所述选择器的入口中来实现；或者(ii)将所述柱直接插入到诸如uv/vis单元的检测器中、优选地利用螺钉配件或套圈将所述柱直接插入到诸如uv/vis单元的检测器中来实现；并且将所述检测器直接插入所述选择器的入口中，优选地利用螺钉配件或套圈将所述检测器直接插入所述选择器的入口中来实现。

该优选实施例的项目(a)和(b)分别提供了用于实施根据本发明的第一和第二方面的特征的特别优选的限制或器具。

项目(b)(i)和(b)(ii)提供优选实施方案，该优选实施方案允许满足柱后体积标准以及如上给出的项目(a)的标准。项目(b)(i)要求在柱的远端和流选择器的入口之间直接连接。因此，根据项目(b)(i)的连接不仅基本直接，而且简单直接。项目(b)(ii)是“基本直接”的实施，在于可以在柱的远端和流选择器的入口之间放置另外的装置、特别是诸如uv/vis单元的检测器。如果将该装置放置在柱和流选择器之间，那么应当理解，优选地，不使用额外的管。替代地，针对每个所需的连接、即柱和检测器之间的连接以及检测器和流选择器之间的连接，使用直接连接的例如螺钉配件的器具。

标准螺钉配件在现有技术中是已知的，并且包括unf螺钉配件，例如用于1/32”、1/16”、1/8”等。螺钉配件的替代品包括套圈(可例如从thermoscientific获得)。

在本发明的装置和套件的另一优选实施例中，所述流选择器的一个、多个或所有出口连接到容器。容器用于收集馏分。

在第三方面，本发明提供根据第一方面的装置或根据第二方面的套件用于分离一种或多种分析物的用途。

与此相关，本发明在第四方面提供一种分析样品的方法，所述方法包括(a)使用根据本发明第一方面的装置进行所述样品的第一色谱分析步骤，其中收集馏分。

术语“分析”具有其现有技术确定的含义，并且包括分离、至少部分地分离样品的成分和/或确定样品的成分的特性。样品可以是任何样品，条件是以原始或加工形式的所述样品是可以加载到色谱柱近端上的流体。优选的样品是生物来源和/或环境样品的样品。生物来源的样品包括诸如源自哺乳动物或人的体液的体液。体液的示例包括血浆、血清、血液和痰。

短语“进行第一色谱分析步骤”包括使用色谱柱进行样品色谱分离的现有技术确定的测量(应当理解，所述测量在柱后扫掠和死体积方面并不是现有技术确定的)。在使用液相色谱的情况下，可以使用一种或多种缓冲液。在某些情况下，梯度可能是有用的。特别是在后一种情况下，可以使用在ep2944955中公开的器具和方法。为了完整起见，我们参考meyer,loc.cit。术语“第一步骤”仅用于区别可选的另外的色谱分析步骤。

在一个优选的实施例中，所述馏分串接以收集串接馏分。馏分的串接本身是现有技术确定的过程，其在上文背景部分中讨论。

在根据第四方面的方法的另一个优选实施例中，所述方法还包括(b)使用根据本发明第一方面的装置，利用从所述第一色谱分析步骤获得的馏分或利用从所述第一色谱分析步骤获得的串接馏分进行第二色谱分析步骤，其中收集馏分；和可选地(c)使用根据本发明第一方面的装置，利用从各自的先前色谱分析步骤获得的馏分或利用从各自的先前色谱分析步骤获得的串接馏分，进行一个或多个进一步的色谱分析步骤，其中馏分为在所述一个或多个进一步色谱分析步骤中被收集。

该优选实施例提供了第二色谱分析步骤和一个或多个可选的进一步的色谱分析步骤。优选地，各种色谱分析步骤中使用的条件(诸如ph值)和/或色谱材料是不同的。理想情况下，应使用正交分离条件。术语“正交”是指在一种情况，其中两个不同色谱分析步骤中的物理化学分离条件和/或选择性如此明显，使得如何分离分析物的方式根本不同，和/或洗脱液不会以相同的顺序洗脱。实际上，这并不总是可以实现的。下面描述使用两个不同色谱分析步骤的方法的优选实施方案。

在优选的实施例中，用于所述第一色谱分析步骤和/或所述第二色谱分析步骤的色谱材料是反相材料。

在特别优选的实施例中，用于所述第一色谱分析步骤和所述第二色谱分析步骤的色谱材料是反相材料，并且第一和第二色谱分析步骤中的一个在中性或碱性条件下进行，优选在7和10之间的ph，另一个在酸性条件下进行，优选在1和4之间的ph。

进一步优选的碱性条件包括8和9的ph值。进一步优选的酸性条件包括2和3的ph值。为了实际目的，我们注意到，酸性条件并不总是根据其各自的ph值为特征，而是根据存在酸的浓度，例如0.01至1％、优选0.1％甲酸；0.01至1％、优选0.1％三氟乙酸；或0.01至1％、优选0.1％乙酸为特征。

下表1显示了根据本发明的优选的ph调节剂。

表1：优选的ph调节剂。相关的pka值在括号中表示。

在另一优选实施例中，所述第一色谱分析步骤在流动相改性剂存在下进行，所述流动相改性剂优选为三氟乙酸(tfa)或三乙胺(tea)。

根据本发明的术语“流动相改性剂”是有助于改进色谱性能(如峰分离和峰形)的化合物的功能表征。流动相改性剂可作为分析物的离子配对试剂。在使用tfa或tea作为流动相改性剂的情况下，优选将其用于第一色谱分析步骤。

在本发明方法的另一优选实施例中，所述方法还包括(d)一种或多种馏分的质谱分析，所述馏分由所述第一色谱分析步骤和/或在存在的情况下由所述第二和/或所述进一步的色谱分析步骤获得。

在本发明方法的另一优选实施例中，包括在所述装置中的流选择器由检测器控制，所述检测器优选为uv/vis单元或质谱仪。

后一优选实施例提供了信号依赖分馏。为了进一步解释，可以使用例如放置在柱的远端和流选择器之间的检测器的检测器，或者在替代方案中诸如质谱仪的下游检测器，以确定峰的位置和性质，所述峰对应于感兴趣的分析物。取决于由检测器检测到的信号的性质，流选择器可操作使得某些分析物的分离和/或收集是最佳的。

在本发明方法的另一个优选实施例中，色谱是液相色谱(lc)。

在本发明方法的另一个优选实施例中，所述样品包括或由以下组成：肽或多肽、脂质和/或糖类，其中所述肽优选是蛋白水解、优选胰蛋白酶消化的结果。

如现有技术中已知的，包括肽、多肽和/或蛋白质的样品(该样品包括全部蛋白质组)优选蛋白水解消化，用于随后的质谱分析。优选的蛋白水解酶包括胰蛋白酶。在这些实施例中，加载到色谱柱上的样品不同于从生物系统抽取的初级样品，因为它已经经过预处理，所述预处理包括所提及的蛋白水解消化或由所提及的蛋白水解消化组成。

大体上来说，如果没有明确地相反指出，优选实施例可协同工作。在这应用后两个实施例的情况下，在线lc-ms是特别优选的实施方案。

关于本说明书中特别描述的实施例、特别是权利要求中，旨在将从属权利要求中提及的每个实施例与所述从属权利要求从属于的每个(独立或从属)权利要求的各个实施例组合。例如，在独立权利要求1列举3个替代方案a、b以及c，从属权利要求2列举3个替代方案d、e和f以及根据权利要求1和2的权利要求3并且列举3个替代方案g、h以及i的情况下，应当理解，说明书明确地公开了对应于组合a、d、g；a、d、h；a、d、i；a、e、g；a、e、h；a、e、i；a、f、g；a、f、h；a、f、i；b、d、g；b、d、h；b、d、i；b、e、g；b、e、h；b、e、i；b、f、g；b、f、h；b、f、i；c、d、g；c、d、h；c、d、i；c、e、g；c、e、h；c、e、i；c、f、g；c、f、h；c、f、i的实施例，除非另有说明。

类似地，并且同样在独立和/或从属权利要求不列举替代方案的那些情况下，应当理解，如果从属权利要求涉及回引多个前述权利要求，从而认为所覆盖的主题的任何组合被明确地公开。例如，在独立权利要求1、回引权利要求1的从属权利要求2以及回引权利要求2和1两者的从属权利要求3的情况下，遵循权利要求3和1的主题的组合如权利要求3、2和1的主题的组合一样清楚和明确地公开。在存在引用权利要求1至3中任一项的进一步的从属权利要求4的情况下，遵循权利要求4和1的、权利要求4、2和1的、权利要求4、3和1的以及权利要求4、3、2和1的主题的组合是清楚和明确地公开。

上述考虑事项经必要修改适用于所有附带的权利要求。

附图说明

附图显示：

图1：现有技术确定的馏分收集系统的实例。

图2：用于流的分开的转子阀。a)示意性2通道转子阀的示例。当位置旋转90°时，进入线路和当前被阻塞的线路连接。b)多通道转子阀的两个示例。这里进入线路连接到中心端口，并且低体积通道连接到排出通道的径向端口(左侧：3通道阀的示例，右侧：9通道阀的示例)。

图3：比较选择器分馏系统与现有技术分馏结果的初步结果。a)本文描述系统的分馏效率使用15μg起始材料用纳米流分馏。初步结果表明蛋白质组深度为7,793个蛋白质鉴定在少于17h测量时间内。b)最近出版的方法论文中采用常规自动进样器和毫升流实现分馏效率。在该方法中，多于2.5mg的肽被分馏。该论文报道了在60h总测量时间内分析的蛋白质组深度为7,897个蛋白质鉴定(mertinsetal.,natmethods,10(7):634-7(2013))。

具体实施方式

示例说明了本发明。

示例1：单个或单一化合物将以少量定量损失和高纯度纯化。在这种情况下，可以用两个或多个通道(图2a、2b)执行系统，其中洗脱峰直接重定向到单独的通道中，导致完全干净的分离而没有不利的反混合效应。从而可将单一化合物与本体流分离，或者多个化合物可以分离进入一个或多个单独的通道中。

示例2：复杂样品必须被分馏成少量的馏分，其中馏分含量几乎不重叠，以降低样品的复杂性，但保留了化合物的定量差异。在该示例中，可以使用具有多个排出线路的转子阀(图2b)。收集一种馏分，转子切换到下一个通道，并且收集下一种馏分，等等。以这种自动化方式，少量的馏分能够以非常干净的分离和几乎不重叠的方式被分离。

示例3：通过具有分馏串接的2d方案分馏高度复杂的样品。这里可使用具有多个输出的旋转阀来分馏成许多子馏分，子馏分被串接到多个通道中。例如，如果使用10端口阀，那么转子阀以循环方式的连续方式切换。因此，当馏分1进入通道1、馏分2进入通道2等等继续时，自动进行串接，使得馏分11、21、31、41等也进入通道1以及馏分12、22、32、32等进入通道2。结果表明可比较的蛋白质组覆盖具有比常规方法更好的效率(图3)。