本发明涉及一种确定来源于人或哺乳动物并已与抗凝剂混合的血液样本或抽吸样本中上皮细胞浓度的方法。该抽吸样本可以是骨髓抽吸物、胸腔抽吸物或腹膜抽吸物的样本。
背景技术：
从US 7,615,358 B2中已获知这种(确定血液样本或抽吸样本中上皮细胞浓度的)方法。在该方法中，通过添加抗体或抗体片段对存在于体液中的上皮肿瘤细胞进行标记，所述抗体或抗体片段针对由单克隆抗体HEA 125识别的人体上皮抗原。随后，将该样本施加到载体(support)上并对其进行温育，以使所述肿瘤细胞粘附到所述载体上。关于这一点，所述载体的表面上可以涂覆有支持非特异性细胞结合的试剂，例如聚-L-赖氨酸(poly-L-lysine)。所述细胞的粘附通常需要花费10到15分钟。在这之后，通过细胞形态识别粘附的上皮肿瘤细胞中的活细胞，并对其进行量化，计算所述体液中存活的上皮肿瘤细胞的浓度。这涉及到通过激光扫描细胞计术对所述粘附的上皮肿瘤细胞的形态进行分析，其中通过活肿瘤细胞上特有的表面染色对它们进行检测，并基于胞内染色(intracellular staining)消除死细胞。
WO2014/047285 A1公开了一种检测和/或治疗可能受益于紫杉烷疗法的前列腺癌患者子群的方法。该方法确定从所述患者处采集的样本中是否存在雄激素受体剪接变体。为实现该目的，可以从所述样本中捕获循环肿瘤细胞，并测试其中是否存在特定剪接变体中的一个。可以通过固定化的抗体实现(所述)捕获。(所述)测试包括使用针对所述剪接变体的抗体接触所述样本，并检测所述抗体与所述剪接变体的结合。
Pizon M等人于2013年2月在《科学公共图书馆综合卷(PLOS ONE)》第8卷、第2期、e56836、第1-6页公开了一种确定乳腺癌患者血液样本中的循环上皮肿瘤细胞上的IGF受体I和VEGF受体2的方法。该方法中，在采集后的48小时内用EDTA作为抗凝剂对所述血样进行处理。此外，所述血样中的红细胞被裂解。在4℃下，在晚上对剩余的细胞与经PE标记的针对VEGF受体2的小鼠单克隆抗体以及经FITC缀合的针对EpCAM的小鼠抗体进行温育，或是在晚上对剩余的细胞与经PE标记的针对IGF受体I的小鼠单克隆抗体以及经FITC缀合的针对EpCAM的小鼠抗体进行温育。将所得确定体积的细胞悬浮液转移至ELISA板的孔中，并使用激光扫描细胞计术对其进行测量。
Hekimian K等人于2012年在《临床和实验医学杂志(Clin.Chem.Lab.Med)》的50(4)的第701-708页公开了去掩蔽(demask)乳腺癌患者体内循环的上皮肿瘤细胞上的上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)的吐温20(20)疗法。该出版物推测EpCAM由糖蛋白或膜脂蛋白掩蔽(mask)，这意味着将阻止抗体的结合。在一实验中，分别在采集当天、在采集后的第一天和采集后的第二天，每次取1ml抗凝的外周血与20μl的20一起温育5分钟，或是不用去污剂(detergent)，取1ml抗凝的外周血温育5分钟。之后，用红细胞裂解缓冲液使其中存在的红细胞裂解。然后，用针对EpCAM的抗体检测上皮细胞。实验发现，在采集当天、在采集后第一天和采集后第二天，均能够检测到在误差范围内同样高的细胞数量。而在没有20的情况下，在采集当天未能检测到任何细胞，在(采集后)第一天可能检测到比经20处理的情况下数量稍少的细胞，并可能在(采集后)第二天检测到与经20处理的情况下数量一样多的细胞。这表明，在对血液样本与所述抗体进行温育之前对该血液样本的储存也会增加细胞上的EpCAM对所述抗体的可性(accessibility)。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供一种确定来源于人或哺乳动物并已与抗凝剂混合的血液样本或抽吸样本中上皮肿瘤细胞浓度的替代方法。
该目的通过权利要求1的特征实现。适当的实施例由权利要求2-15的特征揭示。
本发明提供了一种确定来源于人或哺乳动物且已经与抗凝剂混合的血液样本或抽吸样本中上皮细胞浓度的方法。在所述方法中，在加入各自针对上皮细胞的特异抗原的抗体、抗体片段或抗体模拟物之后，对所述样本进行储存，直至细胞结合的抗体、抗体片段或抗体模拟物的数量的增加随着时间减慢，即，直至结合率降低，或者直至通过绘制结合随时间变化得到的结合曲线开始变平并进入饱和区域。只有这样才能确定标记细胞的数量，并由此确定所述血液样本或抽吸样本中所述细胞的原始浓度。特别地，出人意料的是：达到所述饱和曲线平滑起始处的时间相较于对给定数量的结合配对(binding partner)所预期的时间的要长得多。我们猜测上皮细胞的许多特异性抗原最初是以掩蔽状态存在的，并且只有随着时间的推移才能够与所述抗体、抗体片段或抗体模拟物相结合。只有这样才有可能可靠地确定细胞的数量。
具体而言，根据本发明的确定来源于人或哺乳动物并已与抗凝剂混合的血液样本或抽吸样本中上皮细胞浓度的方法包括以下步骤：
a)通过加入引起红细胞裂解的缓冲液，裂解存在于所述血液样本或抽吸样本中的红细胞，对在该过程中没有被裂解的细胞进行分离，并将所分离的细胞悬浮于缓冲液中；
b)将各自带有至少一个标记且各自针对所述上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)和/或所述上皮细胞的至少一种其它特异抗原的抗体、抗体片段或抗体模拟物添加到从步骤a)得到的细胞悬浮液中，或是添加到所述细胞悬浮液的子量(subquantity)中，其中所述子量是通过分离获得的，将所述抗体、抗体片段或抗体模拟物与所述细胞悬浮液或所述子量混合，并对得到的混合物进行至少一段时间的温育，所述至少一段时间是所述抗体、抗体片段或抗体模拟物与所述细胞的结合达到降低的结合率所需要的时间，其中所述温育至少进行12小时；
c)确定从步骤d)得到的混合物中通过所述抗体、抗体片段或抗体模拟物的结合而标记的细胞的数量；以及
d)计算所述血液样本或抽吸样本中标记细胞的数量的浓度，所述标记细胞的数量已经在步骤c)中确定。
所述的整个方法在人体外和动物体外进行。可以在将所述抗体、抗体片段或抗体模拟物添加到所述子量后立即执行如步骤b)所述的对所述抗体、抗体片段或抗体模拟物与所述子量的混合。可以在预定温度下执行如步骤b)所述的温育，例如在0至20℃，尤其是2至15℃。
当根据步骤d)计算所述血液样本或抽吸样本中标记细胞的数量的浓度时，其中所述标记细胞的数量已经在步骤c)中确定，必须考虑之前对于所述血液样本或抽吸样本进行的任何细胞稀释和/或浓缩。
通常，在所述循环血液中不会发现上皮细胞。但是，很显然，对于例如肺肿瘤、乳腺肿瘤、肠肿瘤或前列腺肿瘤等恶性上皮肿瘤患者的血液，会在该血液中发现循环上皮肿瘤细胞。另外，在例如类风湿性关节炎、哮喘、COPD、克罗恩氏病(Crohn’s disease)或溃疡性结肠炎等上皮组织的慢性炎症性疾病患者的血液中，能够在外周血液发现上述组织的上皮细胞。除此之外，上皮细胞会因损伤上皮组织的事件(例如手术或挫伤)而进入外周血液。因此，当能够尽可能准确地测量来源于人或哺乳动物的血液样本或抽吸样本中上皮细胞的浓度时，这对于诊断上皮肿瘤疾病或上皮组织的慢性炎症性疾病、对于监测疾病进程或愈合过程，以及对于体格检查或群体筛查都有帮助。在这方面，所述细胞可以是上皮肿瘤细胞，发炎组织的上皮细胞，或是由于损害上皮组织的事件而进入血液的其他上皮细胞。
抗凝剂可以是，例如，乙二胺四乙酸盐(ethylenediaminetetraacetate，EDTA)、柠檬酸盐或肝素。
所述抗体片段可以是，例如，Fab′、F(ab′)2或Fab。然而，它们也可以是重组抗体片段，例如scFv、di-scFv、sdAb(单域抗体)，或是例如F(ab′)2的化学结合的抗体片段。抗体模拟物是与抗体一样能够结合抗原、但自身不是抗体或抗体片段的化合物。在大多数情况下，它们通常是人造的肽、蛋白质或凝集素。
根据步骤c)，以如步骤b)所述的混合作为起始，随着时间来进行对结合的抗体、抗体片段或抗体模拟物的量的确定。对于研究抗体、抗体片段或抗体模拟物与底物(substrate)的结合的本领域技术人员来讲，如何确定结合率是已知的。
本发明的发明人已发现：所述标记的抗体、抗体片段或抗体模拟物与循环上皮细胞表面上的上皮细胞特异性抗原的结合并不如预期的那样在所述添加和混合后的几分钟时间内达到饱和，反而在几个小时之后才达到饱和。由于这并不可能完全是基于抗原-抗体反应，因此，假定先前掩蔽的表位的可及性有所提高。如从Hekimian K等人处所知，通过在与所述抗体温育之前进行储存，已经使可及性得到了提高。然而，在抗体、抗体片段或抗体模拟物存在的情况下，通过延长温育，使得所述可及性再次得到提高。其原因可能是：由于其结合，实现了所述抗原的去掩蔽。这样的效果完全是本领域技术人员意料之外的。
以下其他步骤可以在步骤a)和b)之间执行：
a1)将从步骤a)得到的所述细胞悬浮液分离出至少一个子量或另一个子量；
a2)以一定的量将各自带有至少一个标记且各自针对上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)和/或上皮细胞的至少一种其它特异性抗原的抗体、抗体片段或抗体模拟物添加到所述另一个子量中，使得它们在所述另一个子量中的浓度与如步骤b)所述的细胞悬浮液或所述子量中的所述抗体、抗体片段或抗体模拟物的浓度相等，将所述抗体、抗体片段或抗体模拟物与所述另一个子量混合，并对在某个/所述预定温度下得到的混合物进行温育；
a3)以如步骤a2)所述的混合作为起始，随着时间连续地或反复地确定已经与所述另一个子量中的细胞结合的抗体、抗体片段或抗体模拟物的量，从中确定结合率，并确定所述抗体、抗体片段或抗体模拟物与所述细胞的结合达到降低的结合率所需的时间；
其中，在所述预定温度下进行步骤b)中的温育，其中选择如步骤b)所述的时间，使其至少与在步骤a3)中确定的时间一样长。
步骤a3)中待确定的抗体、抗体片段或抗体模拟物的量可以是相对量或绝对量。相对量足以用于确定降低的结合率。当在相同条件下重复执行步骤a)至c)或a)至d)时，仅执行一次用于确定如步骤a3)所述的时间的步骤a1)至a3)就已足够，并在每种情况下分别选择如步骤b)所述的时间，使得它至少与只在步骤a3)中一次确定的时间一样长。
按照结合实验中的惯例，分别以一定的量加入步骤a2)和b)中的抗体、抗体片段或抗体模拟物，使其在所述细胞悬浮液、所述子量或所述另一个子量中的浓度远高于EpCAM或其他上皮细胞的特异性抗原的可能浓度，不过至少高于所述可能浓度的2倍。
在步骤b)和a2)中，可以在添加所述抗体、抗体片段或抗体模拟物并温育5-60分钟之后，比如在温育15分钟后，对所述悬浮液进行稀释，或者，在步骤b)和c)之间或在步骤a2)和a3)之间对所述悬浮液进行稀释(例如使用PBS)，以便在如步骤c)和a3)所述的确定中获得更好的测量结果，比如，因为由未结合的抗体、抗体片段或抗体产模拟物生造成的背景信号得到了减少。
通过如步骤a3)所述的确定，确定了用于可靠地确定上皮细胞的浓度所需要的对所述细胞与所述抗体、抗体片段或抗体模拟物进行温育的时间。所述时间可以在8-25小时之间。然而，如果选择了较高的温度，那么也可能更早地达到降低的结合率，例如在6-8小时之后。反之亦然，在温度相对较低的情况下，即0-8℃，尤其是2-8℃的温度下，也可能需要多于25小时才能达到降低的结合率，并且所述降低的结合率可能，例如，只在25-30个小时后出现。
所述预定温度可以是0-30℃范围内的温度，尤其是0-20℃范围内、尤其是2-15℃范围内，尤其是8-15℃范围内的温度。
如步骤b)所述的温育可以，例如，进行至少13小时、至少14小时、至少15小时、至少16小时、至少17小时、至少18小时、至少19小时、至少20小时、至少21小时、至少22小时、至少23小时、至少24小时、至少25小时、至少26小时、至少27小时、至少28小时、至少29小时或者至少30小时。
所述标记可以是通过诸如异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)或藻红蛋白(phycoerythrin，PE)的荧光染料产生的荧光标记，可以是通过生色团产生的颜色标记，或是通过生物素、亲和素、链霉亲和素或其他一些亲和标签、表位标签或蛋白质标签产生的间接可检测标记。直接标记所述抗体比间接标记更有优势，例如通过二级抗体，可以省略清洗步骤，在所述清洗步骤中，通常会丢失一部分所述上皮细胞。
可以通过激光扫描细胞计术、荧光显微术，更具体地，定量荧光显微术，或光学显微术，更具体地，定量光学显微术，执行如步骤a3)所述的对结合的抗体、抗体片段或抗体模拟物的量的确定和/或如步骤c)所述的通过与所述抗体、抗体片段或抗体模拟物的结合所标记的细胞的数量的确定。若是通过荧光显微术或光学显微术确定结合的抗体、抗体片段或抗体模拟物的量和/或确定标记的细胞的数量，则可以使用图像识别软件来鉴定所述细胞。该软件可以将标记的细胞与标记的细胞碎片或其他非特异性的标记结构区分开。
如果所述标记是荧光标记，那么可以在激光扫描细胞计术或荧光显微术中为每个细胞动态地确定每个细胞的总荧光和该细胞的背景荧光，从而获得所述细胞的等效荧光值，作为在每种情况下为特定细胞确定的总荧光和为该细胞确定的背景荧光之间的差异。当对所述背景荧光进行动态确定时，在每种情况下测量的细胞的总荧光(在所述测量的时刻)，也是该细胞的区域中的背景荧光，即距该细胞的细胞膜约达半个细胞直径长度的区域的背景荧光。这可以提高特定测量的准确性以及测量结果的有效性。
可以通过离心、简单地沉淀或过滤执行如步骤a)所述的对未经裂解的细胞的分离。在进行所述分离后立即执行如步骤a)所述的在缓冲液中对所述分离的细胞的悬浮，即，使得细胞不会干燥(dry)并在所述分离之后不会因干燥而受损。所述缓冲液可以是PBS，即磷酸缓冲盐溶液。
在所述方法的一个实施例中，在每种情况下，在添加如步骤b)和a2)所述的各自至少带有一个标记的抗体、抗体片段或抗体模拟物之前，将用于阻断非特异性结合位点和/或Fc受体的阻断剂添加至所述细胞悬浮液、所述细胞悬浮液的子量或另一个子量中，并与所述细胞悬浮液、所述细胞悬浮液的子量或另一个子量进行混合及温育。对于此，所述温育可以，例如，在8℃的条件下进行约15分钟。
在所述方法的一个实施例中，所有步骤均没有使用去污剂，和/或在所有步骤中都没有对细胞进行固定。因此，可以避免对所述上皮细胞的破坏，从而避免对测量结果产生影响。当意图在该方法中确定具有完整细胞膜的细胞的浓度，或者甚至是活上皮细胞的浓度时，这点尤为重要。
所述方法的所有步骤，或者至少是步骤b)和c)，或者至少步骤b)、a2)、a3)和c)可以通过为此目的设计的机器以自动方式执行。因此，可以实现测量结果再现性的客观化以及改善。
在该方法的一个实施例中，在步骤a1)中分离出两个或更多个子量，其中，在步骤a2)中，在每种情况下将不同量的所述抗体、抗体片段或抗体模拟物添加到每个所述子量，并且，尤其是立即地，与对应的子量进行混合，其中，在步骤a3)中，确定每个所述子量达到降低的结合率所需的时间，其中，选择在期望的时间内达到所述降低的结合率时的所述抗体、抗体片段或抗体模拟物的量，用于步骤b)的执行。
上皮细胞的其它特异性抗原可以，例如，选自下面给出的组中：雄激素受体、上皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGF受体)、雌激素受体、孕酮受体、前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen，PSA)、前列腺特异性膜抗原(prostate-specific membrane antigen，PSMA)、程序性死亡配体1(programmed death ligand 1，PDL-1)、melan A、B7-H3、血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGF受体)、Ki67、胰岛素样生长因子受体(insulin-like growth factor receptor，IGF受体)和Her2neu。
在裂解所述红细胞前，所述血液样本或抽吸样本可以在0-40℃的温度下，尤其是在15-25℃的温度下保存至少14小时，尤其是至少16小时、尤其是至少18小时、尤其是至少20小时、尤其是至少22小时、尤其是至少24小时。因此，可以进一步提高上皮细胞的特异性抗原的可及性。
具体实施方式
下面将基于示例性实施例更具体地阐述本发明。
将1ml用EDTA抗凝的血液在室温下放置24小时。然后，用红细胞裂解缓冲液(155mM NH4Cl、10mM KHCO3、1mM Na2EDTA)将所述样本加满至15ml，并在8℃下储存15分钟。之后，将所述样本以780g离心7分钟。将上清液全部丢弃。将沉淀(pellet)重悬于500μl的PBS-EDTA(137mM NaCl、2.8mM KCl、8.1mM NaHPO4、1.47mM KH2PO4、2mM EDTA、pH7.4)中。
从样本中取50μl加入反应管，与15μl的FcR阻断剂(Miltenyi Biotec GmbH)混合，并在8℃下温育15分钟。然后，加入5μl针对EpCAM的单克隆抗体(HEA-125，Miltenyi Biotec GmbH)，并与所述悬浮液混合。随后，在8℃避光条件下温育15分钟。此后，加入430μl的PBS-EDTA，并将其与所述悬浮液混合。在8℃的条件下，将得到的悬浮液在暗处温育。重新混合后，每次从中去掉100μl，(如此操作)不同次之后，再使用iCys激光扫描显微镜(CompuCyte、Beckman Coulter GmbH)进行测量。也可以使用其他适于荧光捕获的显微镜来完成所述测量。根据在不同时间测量的结合，可以确定，从与所述抗体进行混合开始算起，达到降低的结合率所需的时间。
然后，将另一50μl重悬于PBS-EDTA中的细胞沉淀与15μl的FcR阻断剂混合，并在混合后于8℃下温育15分钟。之后，加入5μl上述针对EpCAM的抗体，并与所述细胞悬浮液混合。在进行8℃避光温育15分钟后，加入430μl的PBS-EDTA，并与所述悬浮液混合。然后，在8℃的暗处条件下，对所述悬浮液进行温育，该温育的时间为达到降低的结合率所需的时间，例如14或16小时。在重新彻底混合所述悬浮液后，取出其中的100μl，并在激光扫描显微镜或其他适于荧光捕获的显微镜下对其进行检查。在所述检查中，确定通过结合抗体所标记的细胞的数量，并由此确定原始血液样本中该细胞的浓度。