本发明涉及诊断或治疗阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病，例如cat1相关疾病。具体而言，本发明涉及包括检测阳离子氨基酸转运蛋白cat1/slc7a1与衍生自牛白血病病毒(blv)包膜糖蛋白的受体结合结构域(rbd)的结合的方法。
发明背景
精氨酸、赖氨酸、组氨酸和鸟氨酸是涉及不同代谢途径的氨基酸。这些途径控制脂肪酸、葡萄糖、氨基酸和蛋白质的代谢，但它们也参与氮的运输、加工和排泄，尿素合成以及肌酸和一氧化氮的合成。
这些途径之一的失调是多种疾病如癌症(包括特别是癌、肉瘤和白血病)、糖尿病、肥胖症、心血管疾病和炎性疾病的特征之一，所述多种疾病的特点在于精氨酸、赖氨酸、组氨酸和鸟氨酸在受这种失调影响的细胞、组织或器官中摄取增加或减少。因此，人们对靶向与这些氨基酸相关的途径的兴趣越来越大。例如，有许多类型的癌症以精氨酸相关途径失调为特征。精氨酸去除已成为战胜这些癌症的策略之一。然而，除了不希望的副作用之外，还出现对这些治疗的耐药性(feunetal.，2015.curr.opin.clin.nutr.metab.care.18(1)：78-82；qiuetal.，2015.cancerlett.364(1)：1-7)，因此有必要开发新的策略和替代疗法。
现有技术教导了阳离子l-氨基酸转运蛋白cat1是精氨酸(clossetal.，2004.j.nutr.134(10suppl)：2752s-2759s)或赖氨酸、组氨酸和鸟氨酸输入的主要转运蛋白。到目前为止，鼠c型同向性逆转录病毒包膜糖蛋白以其与小鼠或大鼠cat1的结合而众所周知(albrittonetal.，1993.j.virol.67(4)：2091-2096)。然而，缺乏准确配体去靶向其他哺乳动物cat1，特别是人、牛和猫cat1。
发明人发现，衍生自牛白血病病毒(blv)包膜糖蛋白的配体特异性结合包括人在内的不同哺乳动物的cat1。令人惊讶的是，本发明人证明该配体阻断细胞内的精氨酸输入，从而防止这些细胞内的精氨酸积聚。
因此，本发明涉及blv.rbd用于诊断或治疗cat1相关疾病的用途。
概述
本发明因此涉及用于检测和/或定量细胞中阳离子氨基酸转运蛋白-1(cat1)的体外方法，其中所述方法包括：
a.使所述细胞与至少一种牛白血病病毒(blv).rbd配体、其变体和/或片段接触，和
b.测定和/或定量所述至少一种配体、其变体和/或片段与cat1的结合。
在一个实施方案中，所述方法还包括比较在步骤b中测定和/或定量的结合水平与参考值。
在一个实施方案中，所述方法用于诊断或监测受试者中cat1相关疾病或blv感染。
在一个实施方案中，所述至少一种牛白血病病毒(blv).rbd配体、其变体和/或片段选自seqidno：21、3、4、13、15、17、19、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、47、48和49，其变体和片段。
本发明还涉及诊断组合物，其包含偶联有至少一种造影剂的至少一种blv.rbd配体或其变体和/或片段和药学上可接受的赋形剂。
本发明还涉及blv.rbd配体、其变体和/或片段，用于体内诊断cat1-相关疾病，优选通过医学成像。
本发明还涉及blv.rbd配体、其变体和/或片段，用于治疗cat1-相关疾病。
在一个实施方案中，所述cat-1相关疾病选自精氨酸相关疾病、赖氨酸相关疾病、组氨酸相关疾病、鸟氨酸相关疾病和炎性疾病。
本发明的另一目的是blv.rbd配体、其变体和/或片段，用于治疗blv感染。
本发明的另一目的是药物组合物，其包含至少一种blv.rbd配体、其变体和/或片段和/或片段和药学上可接受的赋形剂，用于如上所述的用途。
本发明还涉及药物(medicament)，其包含至少一种blv.rbd配体、其变体和/或其片段，用于如上所述的用途。
在一个实施方案中，blv.rbd配体包含seqidno：21、3、4、13、15、17、19、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、47、48和/或49，其变体和/或片段。
定义
在本发明中，以下术语具有以下含义：
-术语“细胞表面营养转运蛋白”是指营养转运蛋白cat1。cat1可以锚定在细胞的质膜中或细胞内。
-“cat1/slc7a1”是指阳离子l-氨基酸转运蛋白。cat1介导氨基酸包括精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸和组氨酸的不依赖钠和ph不敏感的转运。cat1是泛在表达的，尽管认为它不存在于肝细胞和泪腺细胞上。本文将cat1鉴定为blv.rbd的特异性受体。在一个实施方案中，cat1是由seqidno：2(登录号：kj892152)编码的人cat1(登录号：aic49738，seqidno：1)。在一个实施方案中，cat1包含与seqidno：1具有至少70％的序列同一性、优选与seqidno：1具有至少75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列，或由其组成。在一个实施方案中，cat1由与seqidno：2具有至少70％的序列同一性、优选与seqidno：2具有至少75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列编码。在一个实施方案中，cat1包含seqidno：1的片段，优选至少约100个氨基酸的片段，更优选至少约150、200、250、300、350、400、450、500、550、600个氨基酸的片段，或由其组成。在一个实施方案中，cat1不是小鼠cat1(登录号：q09143，seqidno：23)。在一个实施方案中，cat不是大鼠cat1(登录号：p30823，seqidno：24)。
-术语“诊断组合物”是指为了进行诊断并且特别是体内诊断而施用于受试者的组合物。在一个实施方案中，诊断组合物用于检测其中阳离子l-氨基酸转运蛋白、优选cat1的功能失调的细胞，优选在受试者体内。在另一实施方案中，本发明涉及用于检测被blv感染或尚未感染的细胞的诊断组合物，优选在受试者体内检测。
-术语“有效量”是指配体、优选至少一种blv.rbd配体的水平或量，其旨在结合cat1而不会对阳离子l-氨基酸转运蛋白、优选cat1功能失调的受试者或者感染blv的受试者产生显著的负面或不利副作用。
-术语“治疗有效量”是指在不对目标产生显著的负面或不利副作用的情况下旨在实现以下效果的药剂的水平或量，(1)延迟或预防cat1相关疾病或blv感染的发作；(2)减缓或终止cat1相关疾病或blv感染的一种或多种症状的进展、恶化或变坏；(3)导致cat1相关疾病或blv感染症状的缓解；(4)降低cat1相关疾病或blv感染的严重性或发病率；或(5)治愈cat1相关疾病或blv感染。治疗有效量可以在cat1相关疾病或blv感染的发作之前进行施用，用于预防或防止作用。备选地或另外地，治疗有效量可以在cat1相关疾病或blv感染启动之后进行施用，用于治疗作用。
-术语“治疗”是指治疗性治疗和预防或防止措施；其目的是预防或减缓(减轻)cat1相关疾病或blv感染。需要治疗的患者包括那些已经患有cat1相关疾病或blv感染的患者，以及那些容易患有cat1相关疾病或blv感染或那些待预防cat1相关疾病或blv感染的患者。如果在接受治疗量的本发明的配体后，患者显示可观察的和/或可测量的减少或不存在一种或多种以下情况，则受试者或哺乳动物被成功“治疗”：致病细胞数量减少；致病性细胞总数的百分比减少；和/或在一定程度上缓解与特定疾病或病症相关的一种或多种症状；发病率和死亡率降低，和改善生活质量问题。用于评估疾病的成功治疗和改善的上述参数可以通过医生熟悉的常规程序容易地测量。
-术语“药学上可接受的赋形剂”是指当施用于动物、优选人时不产生不利反应、过敏反应或其他不良反应的赋形剂。它包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。对于人体给药，制剂应符合监管部门例如fdaoffice或ema要求的无菌性、产热原性、一般安全性和纯度标准。
-术语“多肽”是指通过肽键连接在一起的氨基酸的线性聚合物(优选至少50个氨基酸)。
-术语“蛋白质”具体指由一种或多种多肽和任选的非多肽辅助因子形成的功能实体。
-当用于两个或更多个多肽或两个或更多个dna序列的序列之间的关系时，术语“同一性”(分别)是指多肽或dna序列之间的序列相关性的程度，通过在两个或更多个氨基酸残基的串或两个或更多个核苷酸的串之间匹配的数量所确定。“同一性”测量两个或更多序列的较小者之间的相同匹配数的百分比，其中缺口比对(如果有的话)由特定数学模型或计算机程序(即“算法”)解决。可以通过已知方法容易地计算相关多肽或dna序列的同一性。这样的方法包括但不限于在arthurm.lesk，computationalmolecularbiology：sourcesandmethodsforsequenceanalysis(new-york：oxforduniversitypress，1988)；douglasw.smith，biocomputing：informaticsandgenomeprojects(new-york：academicpress，1993)；hughg.griffinandannettem.griffin，computeranalysisofsequencedata，part1(newjersey：humanapress，1994)；gunnarvonheinje，sequenceanalysisinmolecularbiology：treasuretroveortrivialpursuit(academicpress，1987)；michaelgribskovandjohndevereux，sequenceanalysisprimer(newyork：m.stocktonpress，1991)；和carilloetal.，1988.siamj.appl.math.48(5)：1073-1082中所述的那些。用于确定同一性的优选方法被设计成给出测试序列之间的最大匹配。在公众可用的计算机程序中描述了确定同一性的方法。用于确定两个序列之间的同一性的优选计算机程序方法包括gcg程序包，其中包括gap(devereuxetal.，1984.nucl.acid.res.12(1pt1)l：387-395；geneticscomputergroup，universityofwisconsinbiotechnologycenter，madison，wi)、blastp、blastn、tblastn和fasta(altschuletal.，1990.j.mol.biol.215(3)：403-410)。blastx程序可从国家生物技术信息中心(ncbi)和其他来源公开获得(blastmanual，altschuletal.ncb/nlm/nihbethesda，md.20894；altschuletal.，1990.j.mol.biol.215(3)：403-410)。众所周知的史密斯沃特曼算法也可以用来确定同一性。
-术语“受试者”是指哺乳动物，优选人、牛(cattle)(例如奶牛(cow)、公牛(bull)、小牛(calf)、小母牛(heifer))、羊群(flock)、绵羊(ovine)(例如绵羊(sheep)、羊羔(lamb)、母羊(ewe))、山羊(caprine)(山羊(goat)，比利山羊(billygoat)，小山羊(kidgoat))，更优选人或牛(bovine)。在一个实施方案中，受试者可以是等待接受或正在接受医疗护理或曾经是/正在/将要成为医疗程序的对象或被监测疾病的发展的“患者”，即哺乳动物，温血动物，更优选人或牛。
-数字前面的“约”意味着所述值加上或减去10％。
详述
本发明涉及用于检测和/或定量细胞中细胞表面营养转运蛋白(cat1)的体外或体内方法，其中所述方法包括：
a.使所述细胞与至少一种配体、优选至少一种牛白血病病毒(blv).rbd配体、其变体和/或片段接触，和
b.测定和/或定量所述至少一种配体、其变体和/或片段与cat1的结合。
在一个实施方案中，本发明的方法还包括将在步骤b中测定和/或定量的结合与参考结合值比较的步骤。
如本文所用，术语“存在于细胞中的cat1”可以指存在于细胞表面或细胞内的cat1。
在一个实施方案中，本发明的方法用于评估存在于细胞表面上的cat1的表达水平。在另一个实施方案中，本发明的方法用于评估存在于细胞内的cat1的表达水平。
在一个实施方案中，本发明的方法用于检测和/或定量样品中的cat1。
在一个实施方案中，在实施本发明的方法之前从受试者获得样品。在一个实施方案中，本发明的方法不包括从受试者获得样品，即本发明的方法是非侵入性的。
在一个实施方案中，从受试者获得以实施本发明的方法的样品是生物样品。
在一个实施方案中，所述生物样品是体液样品。体液的实例包括但不限于血液、血浆、血清、淋巴、尿液、脑脊液或汗液。
在另一个实施方案中，所述生物样品是细胞样品。细胞样品的实例包括但不限于外周血单核细胞(pbmc)、外周血白细胞，从组织活检如淋巴结活检、肠或滑膜活组织检查获得的细胞样品，或从支气管肺泡灌洗获得的细胞样品或脑脊液。
在另一个实施方案中，所述生物样品是组织样品。组织样品的实例包括但不限于活检样品。
在一个实施方案中，从受试者获得以实施本发明的方法的样品是血液样品。在一个实施方案中，从受试者获得以实施本发明的方法的样品是全血样品或血浆样品。
在一个实施方案中，本发明的方法不是用于检测和/或定量粒细胞中的cat1。“粒细胞”是指属于髓细胞或单核细胞系的细胞，如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞。
用于测定和/或定量样品中蛋白质水平的体外方法在本领域中是众所周知的。这些方法的实例包括但不限于免疫组织化学、多重方法(luminex)、蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(elisa)、夹心elisa、荧光连接免疫吸附测定(flisa)、酶免疫测定(eia)、放射免疫测定法(ria)、流式细胞术(facs)等。
用于测定和/或定量蛋白质水平的体内方法在本领域中是众所周知的。这类方法的实例包括但不限于计算机断层摄影(ct)、内窥镜超声(eus)、磁共振成像(mri)、正电子发射断层摄影(pet)、单光子发射断层摄影(spect)、磁共振胆胰管断层摄影、荧光检测、荧光和近红外(nir)荧光成像。
用于分析细胞表面上或细胞、样品、组织或器官内蛋白质存在的方法是本领域技术人员众所周知的，并且包括但不限于facs分析、免疫组织化学、与细胞分级分离相关的蛋白质印迹、酶免疫吸附测定(elisa)、夹心elisa、荧光连接免疫吸附测定(flisa)、酶免疫测定(eia)、放射免疫测定(ria)、图像分析，例如高含量分析、计算机断层摄影(ct扫描)、内窥镜超声(eus)、磁共振成像(mri)、正电子发射断层摄影(pet)、单光子发射断层摄影(spect)、磁共振胆胰管断层摄影、荧光测定法、荧光和近红外(nir)荧光成像等。
在一个实施方案中，为了检测细胞表面上或细胞、样品、组织或器官内的蛋白质，在实施上文所列方法之一之前，可能需要固定所述细胞、样品、组织或器官的步骤。用于细胞、样品、组织或器官固定的工艺对于本领域技术人员来说是众所周知的，并且包括但不限于灌注、用甲醛或甲醇/乙醇浸渍。
用于分析细胞表面上蛋白质存在的方法是本领域技术人员众所周知的，并且包括但不限于facs分析、成像流式细胞术(例如amnis)、免疫组织化学、与细胞分级分离相关的蛋白质印迹、酶免疫吸附测定(elisa)、夹心elisa、荧光连接免疫吸附测定(flisa)、酶免疫测定(eia)、放射免疫测定(ria)、图像分析，例如高含量分析、计算机断层摄影(ct扫描)、内窥镜超声(eus)、磁共振成像(mri)、正电子发射断层摄影(pet)、单光子发射断层摄影(spect)、荧光光度计、荧光和近红外(nir)荧光成像等。
“测定和/或定量结合”至少一种配体(优选至少一种blv.rbd配体)、其变体和/或片段的表述意指，当存在细胞表面营养转运蛋白cat1时，复合物是在cat1与本发明的配体、其变体和/或片段之间形成的，其可以被检测并任选地定量。
在一个实施方案中，如果配体、其变体和/或片段已经例如但不限于与可检测分子例如抗体恒定片段(fc)或荧光化合物(例如花青染料、alexa染料、量子染料等)共价偶联，则可以检测复合物。如果配体已用本领域技术人员众所周知的不同手段加标签，则也可检测复合物。例如但不限于，用于本发明的标签可以是选自以下的标签：血凝素标签，聚精氨酸标签，聚组氨酸标签，myc标签，strep标签，s-标签，hat标签，3xflag标签，钙调蛋白结合肽标签，sbp标签，几丁质结合结构域标签，gst标签，麦芽糖结合蛋白标签，荧光蛋白标签，t7标签，v5标签和x-press标签。这些蛋白质标签可以位于本发明的blv.rbd配体的n端、c端和/或内部。
因此，配体的使用一方面允许识别和检测，另一方面允许形成的复合物的定量。在一个实施方案中，检测和/或定量结合是通过流式细胞术、免疫荧光或图像分析例如高含量分析进行。
在另一实施方案中，如果配体已经例如但不限于与至少一种造影剂共价偶联，则可以检测到该复合物。在一个实施方案中，通过医学成像技术检测和/或定量结合。
如本文所用，术语“造影剂”是指用于改善医学成像技术中的内部身体结构的可见性的试剂，所述医学成像技术包括但不限于磁共振成像(mri)，基于x射线的成像技术，例如计算机断层摄影(ct)，放射摄影，内窥镜超声(eus)，正电子发射断层摄影(pet)，单光子发射断层摄影(spect)，荧光检查，荧光检测，荧光和近红外(nir)荧光成像。
在一个实施方案中，配体与至少一种造影剂偶联，其中所述造影剂可以是放射性标记的药剂或荧光剂。
在一个实施方案中，本发明的放射性标记的药剂选自非金属放射性同位素、非金属或金属染料、顺磁性金属或放射性金属。
非金属放射性同位素的实例包括但不限于i-125、i-123、i-131、c-11、f-18、br-75、br-76、br-77、br-80和at-211。非金属放射性同位素可共价缀合至配体的任一末端，氨基酸侧链的官能团，作为另外的取代基而是线性稳定化肽的一部分，例如在携带氟、溴或碘的氨基酸苯丙氨酸或酪氨酸中，或作为另外的取代基羧基或甲基，或作为配体中任何常规碳原子的替代物。优选地，配体与i-125偶联。这些放射性同位素在配体中用作正电子发射断层摄影(pet)探针或作为单光子发射计算机断层摄影(spect)探针。
非金属或金属染料的实例包括但不限于有机分子，例如商业alexa
顺磁金属的例子包括但不限于gd、fe、mn。这些金属连接至配体。这些配体可用作磁共振成像(mri)探针。
放射性金属的实例包括但不限于cu-64、cu-67、ga-67、ga-68、zr-89、y-90、tc-99m、in-111、tb-161、lu-177、re-186、re-188和bi-213。放射性金属(和上述顺磁性金属)通过上述螯合剂与本发明的配体连接，直接与配体连接或通过间隔区连接。
荧光剂的实例包括但不限于gfp、mplumg、mcherryg、tdtomatog、mstrawberryg、j-red、ds-red单体h、morangeg、mko、mcitrinei、venus、ypetg、eyfp、emeraldg、egfp、cypet、mcfpm、ceruleang、t-sapphireg、吲哚菁绿、zw800-1、cy5.5和irdye800cw。
在一个实施方案中，造影剂是i-125。
典型的配体包括但不限于多肽和蛋白质。
在一个实施方案中，配体是特异性针对cat1的抗体，本发明的方法包括检测和/或定量所述抗体和cat1之间形成的复合物。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及用于检测和/或定量细胞中存在的细胞表面营养转运蛋白(cat1)的体外或体内方法，其中所述方法包括：
a.使所述细胞与特异性针对cat1的至少一种抗体接触，和
b.测定和/或定量所述至少一种抗体与cat1的结合。
在一个实施方案中，本发明的方法还包括比较在步骤b中测定和/或定量的结合与参考结合值的步骤。
在一个实施方案中，配体是受体结合结构域(rbd)配体，本发明的方法包括检测和/或定量所述rbd配体和cat1之间形成的复合物。
在本发明的一个方面，配体是受体结合结构域(rbd)配体、优选blv-rbd配体，其中所述rbd配体包含衍生自与cat1相互作用的包膜病毒的糖蛋白的可溶性部分的受体结合结构域(rbd)的一部分或全部。
表述“与cat1相互作用”是指糖蛋白易于识别存在于细胞中的cat1受体。在一个实施方案中，与cat1相互作用的配体将因此与cat1形成复合物，所述复合物可以通过如本文上述的方法进行检测。
表述“衍生自包膜病毒的糖蛋白的可溶性部分”是指配体是病毒包膜中含有的糖蛋白的片段或一部分并可以例如通过克隆获得。
术语“糖蛋白”应理解为包膜糖蛋白、衣壳糖蛋白或融合糖蛋白，其中术语“糖蛋白”是指含有与多肽侧链共价连接的寡糖链的蛋白质。
rbd尤其见于病毒包膜的糖蛋白中，因此受体结合结构域配体含有整个rbd或rbd的片段或部分。
在一个实施方案中，本发明的配体包含病毒的包膜糖蛋白的细胞表面(su)结构域或su结构域的片段例如blv.rbd。在另一实施方案中，本发明的配体不包含病毒的糖蛋白包膜的跨膜(tm)结构域。因此，在本发明的一个实施方案中，本发明的配体是可溶性肽，特别是可溶性blv.rbd。如本文所用，术语“可溶性肽”是指没有例如通过跨膜或gpi锚定结构域锚定在膜内的肽。
在一个实施方案中，rbd配体不是衍生自鼠c型同向性逆转录病毒的糖蛋白的可溶性部分。在一个实施方案中，rbd配体不是衍生自莫洛尼鼠白血病病毒分离株shinnick(登录号：p03385，seqidno：25)的糖蛋白的可溶性部分。在一个实施方案中，rbd配体不是衍生自friend鼠白血病病毒株57(登录号：p03390，seqidno：26)的糖蛋白的可溶性部分。
在一个实施方案中，rbd配体是衍生自δ-逆转录病毒的糖蛋白的可溶性部分。
δ-逆转录病毒属包括感染人、各种猿类和牛的病毒。δ-逆转录病毒包括但不限于牛白血病病毒(blv)，人t细胞白血病病毒1至4(htlv1-4)和猿猴t细胞白血病病毒1至4(stlv1-4)。
δ-逆转录病毒编码存在于成熟逆转录病毒病毒颗粒中的糖蛋白包膜。包膜蛋白以前肽的形式合成，其在高尔基体中被弗林肽酶切割，得到两个多肽：跨膜(tm)部分和细胞表面(su)部分。su结构域含有两个主要子结构域：与tm结构域相互作用的结构域和氨基末端rbd(可能与宿主细胞膜受体相互作用的最新部分)。
在一个实施方案中，受体结合结构域配体分离自牛白血病病毒的包膜糖蛋白，并在本文中被称为blv.rbd。
因此，在一个实施方案中，本发明的配体包含牛白血病病毒(blv)的包膜糖蛋白的细胞表面(su)结构域或su结构域的片段例如blv.rbd。在另一实施方案中，本发明的配体不包含牛白血病病毒(blv)的包膜糖蛋白的跨膜(tm)结构域。因此，在本发明的一个实施方案中，本发明的配体是可溶性肽，特别是可溶性blv.rbd。
在一个实施方案中，本发明因此涉及用于检测和/或定量细胞中存在的细胞表面营养转运蛋白(cat1)的体外或体内方法，其中所述方法包括：
a.使所述细胞与至少一种牛白血病病毒(blv).rbd配体、其变体和/或片段接触，和
b.测定和/或定量所述至少一种blv.rbd配体、其变体或片段与cat1的结合。
在一个实施方案中，本发明的方法还包括比较在步骤b中测定和/或定量的结合与参考结合值的步骤。
在本发明的一个方面，配体是blv.rbd配体，其中所述blv.rbd配体包含衍生自与cat1相互作用的blv包膜病毒的糖蛋白的可溶性部分的受体结合结构域(rbd)的一部分或全部。
在一个实施方案中，所述blv.rbd包含氨基酸序列seqidno：21(由seqidno：22或由seqidno：5编码)、其变体或片段，或由其组成。
在一个实施方案中，所述片段包含seqidno：21的氨基酸34至181，或由其组成。
在一个实施方案中，所述片段包含seqidno：21的氨基酸1至149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179或180，或由其组成。
在另一实施方案中，所述片段包含seqidno：21的氨基酸34至149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179或180，或由其组成。
在一个实施方案中，所述blv.rbd包含氨基酸序列seqidno：28、其变体或片段，或由其组成。
在一个实施方案中，所述片段包含seqidno：28的氨基酸34至181，或由其组成。
在一个实施方案中，所述片段包含seqidno：28的氨基酸1至149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179或180，或由其组成。
在另一实施方案中，所述片段包含seqidno：28的氨基酸34至149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179或180，或由其组成。
在一个实施方案中，所述blv.rbd包含氨基酸序列seqidno：29、其变体或片段，或由其组成。
在一个实施方案中，所述片段包含seqidno：29的氨基酸34至181，或由其组成。
在一个实施方案中，所述片段包含seqidno：29的氨基酸1至149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179或180，或由其组成。
在另一实施方案中，所述片段包含seqidno：29的氨基酸34至149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179或180，或由其组成。
在一个实施方案中，所述blv.rbd包含氨基酸序列seqidno：4、其变体或片段，或由其组成。
在一个实施方案中，所述片段包含seqidno：4的氨基酸34至181，或由其组成。
在一个实施方案中，所述片段包含seqidno：4的氨基酸1至149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179或180，或由其组成。
在另一实施方案中，所述片段包含seqidno：4的氨基酸34至149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179或180，或由其组成。
在一个实施方案中，所述blv.rbd包含氨基酸序列seqidno：3、其变体或片段，或由其组成。
在一个实施方案中，所述片段包含seqidno：3的氨基酸34至215，或由其组成。
在一个实施方案中，所述片段包含seqidno：3的氨基酸1至182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213或214，或由其组成。
在另一实施方案中，所述片段包含seqidno：3的氨基酸34至182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213或214，或由其组成。
在一个实施方案中，所述blv.rbd包含氨基酸序列seqidno：30、其变体或片段，或由其组成。
在一个实施方案中，所述片段包含seqidno：30的氨基酸34至215，或由其组成。
在一个实施方案中，所述片段包含seqidno：30的氨基酸1至182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213或214，或由其组成。
在另一实施方案中，所述片段包含seqidno：30的氨基酸34至182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213或214，或由其组成。
在一个实施方案中，所述blv.rbd包含氨基酸序列seqidno：31、其变体或片段，或由其组成。
在一个实施方案中，所述片段包含seqidno：31的氨基酸34至215，或由其组成。
在一个实施方案中，所述片段包含seqidno：31的氨基酸1至182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213或214，或由其组成。
在另一实施方案中，所述片段包含seqidno：31的氨基酸34至182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213或214，或由其组成。
在一个实施方案中，所述blv.rbd包含氨基酸序列seqidno：32、其变体或片段，或由其组成。
在一个实施方案中，所述片段包含seqidno：32的氨基酸34至215，或由其组成。
在一个实施方案中，所述片段包含seqidno：32的氨基酸1至182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213或214，或由其组成。
在另一实施方案中，所述片段包含seqidno：32的氨基酸34至182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213或214，或由其组成。
在一个实施方案中，所述blv.rbd包含氨基酸序列seqidno：13(由seqidno：14编码)、其变体或片段，或由其组成。
在一个实施方案中，所述blv.rbd包含氨基酸序列seqidno：15(由seqidno：16编码)、其变体或片段，或由其组成。
在一个实施方案中，所述blv.rbd包含氨基酸序列seqidno：17(由seqidno：18编码)、其变体或片段，或由其组成。
在一个实施方案中，所述blv.rbd包含氨基酸序列seqidno：19(由seqidno：20编码)、其变体或片段，或由其组成。
在一个实施方案中，所述blv.rbd包含氨基酸序列seqidno：33、其变体或片段，或由其组成。
在一个实施方案中，所述blv.rbd包含氨基酸序列seqidno：34、其变体或片段，或由其组成。
在一个实施方案中，所述blv.rbd包含氨基酸序列seqidno：35、其变体或片段，或由其组成。
在一个实施方案中，所述blv.rbd包含氨基酸序列seqidno：36、其变体或片段，或由其组成。
在一个实施方案中，所述blv.rbd包含氨基酸序列seqidno：37、其变体或片段，或由其组成。
在一个实施方案中，所述blv.rbd包含氨基酸序列seqidno：38、其变体或片段，或由其组成。
在一个实施方案中，所述blv.rbd包含氨基酸序列seqidno：39、其变体或片段，或由其组成。
在一个实施方案中，所述blv.rbd包含氨基酸序列seqidno：40、其变体或片段，或由其组成。
在一个实施方案中，所述blv.rbd包含氨基酸序列seqidno：41、其变体或片段，或由其组成。
在一个实施方案中，所述blv.rbd包含氨基酸序列seqidno：42、其变体或片段，或由其组成。
在一个实施方案中，所述blv.rbd包含氨基酸序列seqidno：43、其变体或片段，或由其组成。
在一个实施方案中，所述blv.rbd包含氨基酸序列seqidno：44、其变体或片段，或由其组成。
在一个实施方案中，所述blv.rbd包含氨基酸序列seqidno：45(由seqidno：46编码)、其变体或片段，或由其组成。
在一个实施方案中，所述blv.rbd包含氨基酸序列seqidno：47、其变体或片段，或由其组成。
在一个实施方案中，所述blv.rbd包含氨基酸序列seqidno：48、其变体或片段，或由其组成。
在一个实施方案中，所述blv.rbd包含氨基酸序列seqidno：49、其变体或片段，或由其组成。
如本文所用，如本领域众所周知的，“氨基酸”由其全名、其三字母代码或其单字母代码表示。肽的氨基酸残基缩写如下：苯丙氨酸是phe或f；亮氨酸是leu或l；异亮氨酸是ile或i；甲硫氨酸是met或m；缬氨酸是val或v；丝氨酸是ser或s；脯氨酸是pro或p；苏氨酸是thr或t；丙氨酸是ala或a；酪氨酸是tyr或y；组氨酸是his或h；谷氨酰胺是gln或q；天冬酰胺是asn或n；赖氨酸是lys或k；天冬氨酸是asp或d；谷氨酸是glu或e；半胱氨酸是cys或c；色氨酸是trp或w；精氨酸是arg或r；甘氨酸是gly或g。
如本文所用，术语“氨基酸”包括天然氨基酸和合成氨基酸，并且包括d和l氨基酸。“标准氨基酸”或“天然存在的氨基酸”是指天然存在的肽中常见的二十种标准l-氨基酸中的任何一种。“非标准氨基酸残基”是指除标准氨基酸以外的任何氨基酸，不管它是合成制备还是衍生自天然来源。例如，萘基丙氨酸可以代替色氨酸以促进合成。可置换的其它合成氨基酸包括但不限于l-羟丙基，l-3，4-二羟基苯丙氨酰基，α-氨基酸如l-α-羟基赖氨酰和d-α-甲基丙氨酰，l-α-甲基丙氨酰，β-氨基酸和异喹啉基。
如本文所用，“氨基酸”还包括化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐、氨基酸衍生物(如酰胺)和置换。可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化或用其他化学基团置换来修饰包含于本发明多肽中、特别是在羧基或氨基端的氨基酸，这些化学基团可以改变多肽的循环半衰期而不会不利地影响它们的活性。另外，在本发明的多肽中可以存在或不存在二硫键。
本发明的rbd配体可以包含标准氨基酸或非标准氨基酸。多肽模拟物包括具有以下修饰的多肽：i)多肽，其中肽酰-c(o)nr-连接(键)中的一个或多个已经被非肽酰连接替换，所述非肽酰连接例如-ch2-氨基甲酸酯连接(-ch2oc(o)nr-)、膦酸酯连接、-ch2-磺酰胺(-ch2-s(o)2nr-)连接、脲(-nhc(o)nh-)连接、-ch2-仲胺键，或用烷基化肽酰连接(-c(o)nr-)替换，其中r是c1-c4烷基；ii)多肽，其中n末端衍生化成-nrr1基团、衍生化成-nrc(o)r基团、衍生化成-nrc(o)or基团、衍生化成-nrs(o)2r基团、衍生化成-nhc(o)nhr基团，其中r和r1是氢或c1-c4烷基，条件是r和r1不同时为氢；iii)多肽，其中c末端衍生化成-c(o)r2，其中r2选自c1-c4烷氧基和-nr3r4，其中r3和r4独立选自氢和c1-c4烷基。
根据优选实施方案，blv.rbd配体选自序列seqidno：21、3、4、13、15、17、19、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、47、48和49，其片段和变体；更优选选自序列seqidno：21和4，其片段和变体；甚至更优选选自序列seqidno：21、其片段和变体。根据另一个实施方案，受体结合结合结构域配体由选自包含序列seqidno：22、5、14、16、18、20和46、其片段和变体的dna序列编码。
在一个实施方案中，blv.rbd配体包含与序列seqidno：21、3、4、13、15、17、19、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、47、48或49之一具有至少70％的序列同一性，优选与序列seqidno：21、3、4、13、15、17、19、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、47、48或49之一具有至少约75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或更高的序列同一性的序列，或由其组成。
在另一个实施方案中，本发明的blv.rbd配体由与序列seqidno：22、5、14、16、18、20或46具有至少70％的序列同一性、优选与seqidno：22、5、14、16、18、20或46具有至少约75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或更高的序列同一性的dna序列编码。
在一个实施方案中，本发明的blv.rbd配体是以下多肽之一的变体，所述多肽具有序列seqidno：21、3、4、13、15、17、19、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、47、48和/或49。
在本文中作为术语使用的多肽“变体”是通常与本文具体公开的多肽在一个或多个置换、缺失、添加和/或插入方面不同的多肽。这样的变体可以是天然存在的，或者可以是合成产生的，例如通过修饰一种或多种上述多肽序列和评估如本文所述的多肽的一种或多种生物学活性和/或使用本领域中众所周知的多种技术。可以对多肽的结构进行修饰并且仍然获得编码具有期望特征的变体或衍生多肽的功能分子。
当期望改变多肽的氨基酸序列以产生本发明的配体的等同的或甚至改进的变体或部分时，本领域技术人员通常将改变编码dna序列的一个或多个密码子。例如，蛋白质结构中的某些氨基酸可被其它氨基酸置换，而不会明显丧失其结合细胞表面受体、优选细胞表面营养转运蛋白的能力。由于蛋白质的结合能力和性质决定了蛋白质的生物功能活性，因此可以在蛋白质序列中当然也可以在其潜在的dna编码序列中进行某些氨基酸序列置换，并且仍然获得具有相似属性的蛋白质。因此涵盖了可以对肽序列或编码所述肽的相应dna序列进行各种改变，而不会明显损失其生物学效用或活性。在许多情况下，多肽变体将含有一个或多个保守置换。“保守置换”是其中氨基酸被具有相似性质的另一种氨基酸置换的置换，使得肽化学领域的技术人员预期该多肽的二级结构和亲水性基本上不变。如上所述，因此氨基酸置换通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到各种前述特征的示例性取代是本领域技术人员众所周知的并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性可进一步进行氨基酸置换。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括组氨酸、赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的不带电荷极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可能代表保守变化的其他氨基酸组包括：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。
如本文所用，术语“保守氨基酸置换”可进一步定义为在以下五组之一中的氨基酸交换：
i.小的脂肪族、非极性或轻微极性残基：ala、ser、thr、pro、gly，
ii.极性、带负电的残基及其酰胺：asp、asn、glu、gln，
iii.极性、带正电的残基：his、arg、lys，
iv.大的脂肪族非极性残基：met、leu、ile、val、cys，
v.大的芳香族残基：phe、tyr、trp。
变体也可以或者可选地包含非保守变化。在优选的实施方案中，变体多肽通过置换、缺失或添加1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸而与天然序列不同。变体还可以(或者可选地)通过例如缺失或添加对多肽的免疫原性、二级结构和亲水性质影响最小的氨基酸进行修饰。
在一个实施方案中，seqidno：21、3、4、13、15、17、19、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、47、48或49的变体能够以至少分别等于seqidno：21、3、4、13、15、17、19、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、47、48或49之一的亲和力结合cat1。
在一个实施方案中，seqidno：21、3、4、13、15、17、19、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、47、48或49的变体与seqidno：21、3、4、13、15、17、19、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、47、48或49的序列相比分别包含保守氨基酸置换，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸置换。
在另一个实施方案中，seqidno：21、3、4、13、15、17、19、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、47、48或49的变体是多肽，其中seqidno：21、3、4、13、15、17、19、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、47、48或49的序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸分别缺失或被任何氨基酸置换，或者其中添加了1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸(或连续或不连续)。
在本发明的一个实施方案中，如上所述的rbd配体通过本领域众所周知的方式修饰，例如通过添加一个或多个官能团如磷酸酯、乙酸酯、脂质或碳水化合物基团和/或者通过添加一个或多个保护基。例如，rbd配体可以通过添加一个或多个官能团如磷酸酯、乙酸酯或各种脂质和碳水化合物而被修饰。本发明的rbd配体也可以作为多肽衍生物存在。术语“多肽衍生物”是指具有氨基(--nh--)、更具体地说是肽键的化合物。多肽可以被视为取代的酰胺。像酰胺基团一样，肽键显示出高度的共振稳定性。肽连接中的c--n单键通常具有约40％的双键特征，而c＝o双键具有约40％的单键特征。“保护基团”是防止涉及未受保护的功能基团的不良反应(如蛋白水解)的基团。氨基保护基的具体例子包括甲酰基；三氟乙酰基；苄氧羰基；取代的苄氧羰基如(邻-或对-)氯苄氧羰基和(邻-或对-)溴苄氧羰基；和脂肪族氧羰基如叔丁氧羰基和叔戊氧羰基。氨基酸的羧基可以通过转化为酯基来保护。酯基包括苄基酯、取代的苄基酯如甲氧基苄基酯；烷基酯如环己基酯、环庚基酯或叔丁基酯。胍基部分可以被硝基保护；或芳基磺酰基如甲苯磺酰基、甲氧基苯磺酰基或均三甲苯磺酰基，尽管它不需要保护基。咪唑的保护基团包括甲苯磺酰基、苄基和二硝基苯基。色氨酸的吲哚基团可以被甲酰基保护或不受保护。
rbd配体的修饰特别旨在改善它们在体内的寿命。一种类型的修饰是向rbd配体的n末端或c末端添加聚乙二醇(peg)。本领域技术人员已知peg具有许多性质，使其成为多肽的理想承载体，例如高水溶性、溶液中的高迁移率和低免疫原性。这种修饰也保护多肽免受外肽酶的影响并因此增加它们在体内的整体稳定性。
用于防止内肽酶或外肽酶降解多肽的其他修饰包括n末端修饰如乙酰化或糖基化，c末端修饰如酰胺化和在多肽内特定位点使用非天然氨基酸(β-氨基和α-三氟甲基氨基酸)。在一个实施方案中，本发明的blv.rbd配体是糖基化的。在另一个实施方案中，本发明的blv.rbd配体是非糖基化的。
增加多肽分子大小的另一种替代方式是多肽与人免疫球蛋白(包括例如iga、igm和igg)的fc结构域的基因融合或多肽与白蛋白的融合。
在一个实施方案中，本文上述的blv.rbd配体是包含融合至检测标签例如fc片段或gfp的rbd的一部分或全部的融合蛋白。fc片段的实例包括但不限于兔fc片段(由seqidno：9编码的氨基酸序列seqidno：8)、小鼠fc片段(由seqidno：11编码的氨基酸序列seqidno：10)。
在一个实施方案中，受体结合结构域配体是融合至兔fc片段(其可以由例如dna序列seqidno：12编码)的blv.rbd。
在一个实施方案中，本发明的受体结合配体与至少一种造影剂偶联。在上文列出了造影剂的非限制性实例。优选的造影剂是i-125。
本文所述的本发明的rbd配体可以通过本发明众所周知的化学合成或酶法合成来合成产生。或者，编码本发明的多肽的核苷酸序列可以被引入蛋白质表达载体并在合适的宿主生物(例如细菌、昆虫细胞等)中产生然后纯化。在一个实施方案中，通过克隆方法例如使用本领域已知的任何产生体系如大肠杆菌、酵母、杆状病毒-昆虫细胞或哺乳动物细胞如hek或cho表达系统获得受体结合结构域配体。
本发明的另一目的是偶联有至少一种造影剂的如上所述的blv.rbd配体。在一个实施方案中，至少一种造影剂是放射性标记的药剂或荧光剂。在一个实施方案中，至少一种造影剂是i-125。
在一个实施方案中，偶联有至少一种造影剂的至少一种blv.rbd配体可以用作探针用于医学成像。
用于将至少一种造影剂偶联至rbd配体的方法是本领域众所周知的。例如至少一种造影剂可以是共价结合或非共价结合的。
例如，将多肽偶联至i-125的技术是本领域众所周知的。这类方法的非限制性实例如下：以还原形式存在的碘(nai)与酪氨酸的苯酚基或与组氨酸残基的侧链反应。这些基团用氧化剂(iodogen)预先氧化。然后将肽制备物(100μg，1mci＝37mbq)加入到iodogen溶液中，并在4℃孵育10分钟。使用终止溶液终止反应，所述终止溶液包含例如每个标记200μl含有叠氮化钠的pbs。平行地，将小鼠血清添加到pd10柱上。然后将反应溶液加到pd10柱上并收集与碘偶联的肽。
在本发明的一个实施方案中，偶联有至少一种本发明的造影剂的至少一种blv.rbd配体、其变体和/或片段用作示踪剂。如本文所用，术语“示踪剂”是指提供对cat1相关的疾病位置、进展和/或结构的观察从而用于手术前、手术中和手术后的识别剂。
因此，本发明进一步涉及在有需要的受试者中追踪感染或尚未感染blv的细胞或阳离子l-氨基酸转运蛋白、优选cat1功能失调的细胞的体内方法，其包括：
a.将有效量的偶联有至少一种造影剂的至少一种blv.rbd配体、其变体和/或片段施用于受试者，和
b.使用医学成像技术检测和/或定量结合所述细胞的所述至少一种blv.rbd配体、其变体和/或片段。
在一个实施方案中，所述方法用于手术前、手术中和手术后。在另一个实施方案中，所述方法用于荧光引导的手术。
可以使用的具体医学成像技术方法的实例对于本领域技术人员是众所周知的，并且包括但不限于例如计算机辅助断层摄影(cat)、磁共振波谱学(mrs)、磁共振成像(mri)、正电子发射断层摄影(pet)或单光子发射计算机断层摄影(spect)并描述于boonstraetal.(2015.oncotarget.6(16)：14260-73)中。
在一个实施方案中，如上所述的blv.rbd配体偶联有如本文所述的放射性标记的药剂或荧光剂。可用于靶向的放射性标记的药剂或荧光剂的实例包括但不限于i-125、i-131、f-18(即18-f-氟-2-脱氧-d-葡萄糖，18-f-氟-17-雌二醇)、11-c-乙酸酯、tc-99m、o-15、n-13、br-76、in-111、cu-64、ga-68、zr-89、zw800-1、cy5.5、irdye800cw。
如本文所用，术语“阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病”是指其中涉及精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或组氨酸体内平衡和/或代谢的途径失调的疾病。
阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病的实例包括但不限于精氨酸相关疾病、赖氨酸相关疾病、组氨酸相关疾病、鸟氨酸相关疾病、一氧化氮相关疾病和炎性疾病。
精氨酸相关疾病的实例包括但不限于精氨酸相关癌症、精氨琥珀酸裂合酶相关疾病、精氨琥珀酸合成酶相关疾病、心脏纤维化和肌纤维化。
精氨酸相关癌症的实例包括但不限于精氨酸相关肿瘤、精氨酸相关肉瘤、精氨酸相关白血病、精氨酸相关癌症、精氨酸相关淋巴瘤、精氨酸相关转移和精氨酸相关黑素瘤、精氨琥珀酸合成酶相关癌症、精氨琥珀酸裂合酶相关癌症、精氨酸营养缺陷型肿瘤和急性骨髓性白血病。
精氨基琥珀酸合成酶相关癌症的实例包括但不限于结直肠癌、膀胱癌、胰腺癌、肝癌、黑素瘤、鼻咽癌、肝细胞癌、粘液纤维肉瘤、脑瘤、成胶质细胞瘤、葡萄膜黑素瘤、肺癌、小细胞肺癌、结肠癌、结肠直肠癌、肝癌、肾细胞癌、前列腺癌、乳腺癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、恶性黑素瘤、骨肉瘤、恶性胸膜间皮瘤、食管腺癌、肺转移、卵巢癌、急性粒细胞白血病、间皮癌、泌尿系统癌症和伯基特淋巴瘤。
精氨基琥珀酸裂解酶相关疾病的实例包括但不限于肝癌、肝纤维化、结肠直肠癌、精氨琥珀酸裂解酶缺乏症、精氨基琥珀酸尿症、尿素循环障碍、高氨血症、发育迟缓、急性感染或对认知障碍的应激、行为异常和/或学习障碍、肝肿大、进行性脑病、嗜睡、癫痫发作、注意力缺陷多动障碍、肝炎、肝硬化、系统性高血压、低钾血症和成胶质细胞瘤。
精氨基琥珀酸合成酶相关疾病的实例包括但不限于瓜氨酸血症i、高氨血症、尿素循环障碍和精氨琥珀酸合成酶相关癌症。
赖氨酸相关疾病的例子包括但不限于高胰血症、i型戊二酸尿症、l-2羟基戊二酸尿症、d-2羟基戊二酸尿症和单纯疱疹病毒感染。
组氨酸相关疾病的例子包括但不限于组氨酸血症和组氨酸氨裂解酶缺陷。
鸟氨酸相关疾病的实例包括但不限于鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症、肝硬化和癌发生。
一氧化氮相关疾病的实例包括但不限于慢性肾衰竭、慢性心力衰竭、充血性心力衰竭、高血压、动脉粥样硬化、中风和血栓形成。
代谢疾病的实例包括但不限于肥胖症、糖尿病、心血管病死亡、肾损伤和局部缺血。
炎性疾病的实例包括但不限于多关节炎、类风湿性关节炎、哮喘、炎性肠病、乳糜泻、自身免疫疾病和多发性硬化症。
牛白血病病毒感染奶牛(dairycattle)和牛(bovine)或绵羊的血细胞和乳腺组织。逆转录病毒容易在牛间传播，主要通过直接接触、感染血液、奶和可能通过叮咬的昆虫传播。此外，最近的研究表明，暴露于blv的女性患乳腺癌的风险增加。
blv感染的实例包括但不限于白血病、持续淋巴细胞增多症、淋巴增殖、淋巴样肿瘤、恶性b细胞淋巴瘤、流行性牛造白细胞组织增生(在奶牛中)和乳腺癌。
在一个实施方案中，本发明的方法用于诊断阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病或blv感染。在一个实施方案中，本发明的方法不用于诊断炎性状态。
因此，本申请涉及用于诊断阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病或blv感染的方法，其包括以下步骤：
a.使有效量的至少一种blv.rbd配体、其变体和/或片段与细胞、样品、组织和/或器官接触，
b.检测和/或定量至少一种blv.rbd配体、其变体和/或片段与所述细胞、样品、组织和/或器官中的cat1结合。
在一个实施方案中，本发明的方法还包括比较在步骤b中测定和/或定量的结合与参考结合值的步骤。
如本文所用，术语“参考”广泛地涵盖任何合适的参考结合水平，其可以用作比较所测定的结合的基础。在一个实施方案中，使用算法和/或其它统计和分级分类方法构建参考。在另一方面，参考结合水平存储在数据中以提供存储的结合水平，并且存储的结合水平用于确定结合水平的差异。数据库例如可存储在计算机或服务器上。
在一个实施方案中，参考结合水平是针对阳离子l-氨基酸转运蛋白的功能、优选cat1功能失调的细胞或者被blv感染或尚未被blv感染细胞的存在的指数值或衍生自一种或多种风险预测算法或计算的指数。参考结合水平可以相对于衍生自群体研究的数字或数值，包括但不限于具有相似年龄范围的受试者群体、相同或相似种族群体中的受试者。
如本文所用的术语“其中阳离子l-氨基酸转运蛋白、优选cat1的功能失调的细胞”是指其中精氨酸或赖氨酸或组氨酸或鸟氨酸代谢或输入异常增加或降低的细胞。
精氨酸或赖氨酸或组氨酸或鸟氨酸代谢包括它们的合成、分解代谢，还有饮食摄取。精氨酸通过两种关键酶合成：精氨琥珀酸合成酶和精氨琥珀酸裂合酶，其在不同病理学中表现出缺陷或异常活性，导致精氨酸在受这些病理影响或尚未受这些病理影响的某些器官、组织、样品或细胞中的累积。赖氨酸和组氨酸是必需氨基酸，因此不在动物中合成。鸟氨酸通过精氨酸酶对l-精氨酸的作用参与尿素的生产。
在本发明的一个实施方案中，参考结合水平是在诊断患有阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病或blv感染的患者群体中测量的结合水平。
根据这个实施方案，测定的结合水平和参考结合水平之间的等同性(即，不存在差异)，或高于参考结合水平的测定的结合水平可以指示存在阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病或blv感染。
在本发明的一个实施方案中，参考结合水平是在基本上健康的受试者群体中即在没有诊断患有阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病或blv感染的受试者群体中测定的结合水平。根据这个实施方案，高于参考结合水平的测定的结合水平可以指示存在阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病或blv感染。
在本发明中，如果第一数值比第二数值高(例如，第一数值比第二数值高约20％，优选比第二数值高约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)或者比第二数值低(例如，第二数值比第二数值低约20％，优选比第二数值低约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更低)，则认为两个数值、尤其是两个结合水平不同。
在一个实施方案中，参考值是早先在相同受试者中确定的个性化参考值(例如，在接受用于阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病或blv感染的治疗之前)。
在一个实施方案中，所述至少一种blv.rbd配体、其变体和/或片段是如上所述偶联有至少一种造影剂的blv.rbd配体。
在一个实施方案中，本发明的诊断方法是体内诊断方法。优选地，所述诊断方法基于医学成像。
在另一实施方案中，本发明的诊断方法是体外或离体方法，即对在实施本发明的方法之前从患者获得的细胞、样品、组织和/或器官进行本发明的方法。因此，在一个实施方案中，本发明的方法不包括从患者获得样品，即本发明的方法是非侵入性的。
在一个实施方案中，本发明的方法用于监测受试者中阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病。在一个实施方案中，本发明的方法用于监测受试者中blv感染。如本文所用的术语“监测”是指作为时间的函数测定试者体内精氨酸、赖氨酸、组氨酸或鸟氨酸代谢失调的细胞的量，例如在针对阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病或针对blv感染的疗法之前、期间和之后。
如本文所述的术语“针对阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病或针对blv感染的治疗”可以指精氨酸去除、化疗、放疗、手术、免疫疗法和本领域技术人员已知的药物(drug)如用于治疗阳离子l-氨基酸转运蛋白疾病(包括cat1相关疾病)或blv感染的药物。
在一个实施方案中，本发明的监测方法包括比较两个结合水平，例如在治疗前测定的结合与治疗后测定的结合水平。
在一个实施方案中，治疗后至少一种blv.rbd配体的结合水平降低表明治疗有效。
在一个实施方案中，治疗后的结合水平等于或高于治疗前测定的结合水平表明治疗无效。
本申请还涉及用于监测受试者中阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病或blv感染的方法，其包括以下步骤：
a.使有效量的至少一种blv.rbd配体、其变体和/或片段，优选偶联有至少一种造影剂的有效量的至少一种blv.rbd配体、其变体和/或片段，与所述受试者的细胞、样品、组织和/或器官接触，
b.检测和/或定量至少一种blv.rbd配体、其变体和/或片段与所述细胞、样品、组织和/或器官中的cat1结合，优选通过医学成像，
c.用针对阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选针对cat1相关疾病或针对blv感染的疗法治疗受试者，
d.使有效量的至少一种blv.rbd配体、其变体和/或片段，优选偶联有至少一种造影剂的有效量的至少一种blv.rbd配体、其变体和/或片段，与所述受试者的细胞、样品、组织和/或器官接触，和
e.检测和/或定量至少一种blv.rbd配体、其变体和/或片段与所述细胞、样品、组织和/或器官中的cat1结合。
在一个实施方案中，本发明的方法还包括比较步骤e)中测定的结合与步骤b)中测定的结合，从而监测受试者中的阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病或blv感染的步骤。
在一个实施方案中，针对阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病(包括cat1相关疾病)或针对blv感染的疗法之后细胞、样品、组织和/或器官中cat1检测的不存在或降低表明缓解。具体而言，这样的疾病可以包括例如一氧化氮相关疾病、优选慢性肾衰竭和慢性心力衰竭。
在另一个实施方案中，针对阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病(包括cat1相关疾病)的疗法之后细胞、样品、组织和/或器官中cat1检测的存在或增加表明缓解。具体而言，这样的疾病可以包括代谢疾病例如肥胖、糖尿病、心血管病死亡、肾损伤或局部缺血。
本发明还涉及组合物，其包含如上所述的至少一种blv.rbd配体、其变体和/或其片段，或由其组成或基本上由其组成。
本申请还涉及药物组合物，其包含如上所述的至少一种blv.rbd配体、其变体和/或其片段和至少一种药学上可接受的赋形剂，或由其组成或基本上由其组成。
本发明还涉及药物，其包含如上所述的至少一种blv.rbd配体、其变体和/或其片段，或由其组成或基本上由其组成。
如本文所用的相对药物组合物或药物的术语“基本上由其组成”是指本发明的至少一种blv.rbd配体是所述药物组合物或药物内唯一一种治疗剂或具有生物活性的药剂。
本申请还涉及诊断组合物，其包含如上所述的偶联有至少一种造影剂的至少一种blv.rbd配体、其变体和/或其片段和至少一种药学上可接受的赋形剂，或由其组成或基本上由其组成。
在一个实施方案中，根据如上所述的本发明的方法，本发明的诊断组合物用于诊断阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病或用于监测阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病。在另一实施方案中，根据如上所述的本发明的方法，本发明的诊断组合物用于诊断blv感染或监测blv感染。在一个实施方案中，本发明的诊断组合物不用于诊断炎性状态。
药学上可接受的赋形剂包括水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液、和乙醇、葡萄糖、蔗糖、葡聚糖、甘露糖、甘露醇、山梨糖醇、聚乙二醇(peg)、磷酸盐、乙酸盐、明胶、胶原蛋白、
可用于本发明的组合物的药学上可接受的赋形剂的其它实例包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
此外，药学上可接受的赋形剂可包括一些赋形剂例如表面活性剂(例如羟丙基纤维素)；合适的承载体例如含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)的溶剂和分散介质，其合适的混合物，和植物油例如花生油和芝麻油；等渗剂例如糖或氯化钠；包衣剂，例如卵磷脂；延迟吸收的药剂例如单硬脂酸铝和明胶；防腐剂例如苯扎氯铵、苄索氯铵、氯丁醇、硫柳汞等；缓冲剂例如硼酸、碳酸氢钠和碳酸氢钾、硼酸钠和硼酸钾、碳酸钠和碳酸钾、乙酸钠、磷酸二氢钠等；张力剂例如葡萄糖、氯化钾、丙二醇、氯化钠；抗氧化剂和稳定剂例如亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代亚硫酸钠、硫脲等；非离子润湿剂或澄清剂例如聚山梨酯80、聚山梨酯20、泊洛沙姆282和泰洛沙泊；粘度调节剂例如葡聚糖40、葡聚糖70、明胶、甘油、羟乙基纤维素、羟甲基丙基纤维素、羊毛脂、甲基纤维素、凡士林、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素；等等。
本申请还涉及如上所述的至少一种blv.rbd配体、组合物、药物组合物或药物，用于治疗阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病或blv感染，或在其中的用途。
在一个实施方案中，如上所述的至少一种blv.rbd配体、组合物、药物组合物或药物不是用于治疗炎性状态或在治疗炎性状态中的用途。
在一个实施方案中，如上所述的至少一种blv.rbd配体、组合物、药物组合物或药物不是疫苗。因此，在一个实施方案中，如上所述的至少一种blv.rbd配体、组合物、药物组合物或药物不是用于产生抗体、特别是针对blv的抗体，或在其中的用途。
本申请还涉及用于治疗阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病或blv感染的方法，其中所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如上所述的至少一种blv.rbd配体。
本申请还涉及用于靶向感染了或还未感染blv或其中阳离子l-氨基酸转运蛋白的功能、优选cat1功能失调的细胞、样品、组织和/或器官的方法，其中所述方法包括向受试者施用至少一种blv.rbd配体、其变体和/或片段。所述方法可以用于例如将治疗剂靶向感染了或还未感染blv或其中阳离子l-氨基酸转运蛋白的功能、优选cat1功能失调的细胞、样品、组织和/或器官。在一个实施方案中，本发明的方法用于保护受试者免受其它已经感染blv的受试者的感染，或用于预防blv感染并且特别是用于预防blv感染的传播。
在一个实施方案中，所述至少一种blv.rbd配体、优选偶联有至少一种造影剂时是被包囊的。偶联有至少一种造影剂的至少一种blv.rbd配体的包囊可以避免任何降解。包囊的技术是本领域众所周知的。
胶囊的实例包括但不限于磷脂、聚合物、脂质体和量子点。
在一个实施方案中，待特异性施用于感染了或还未感染blv或其中受试者体内的阳离子l-氨基酸转运蛋白的功能、优选cat1功能失调的细胞、样品、组织或器官的治疗剂与至少一种blv.rbd配体被包囊。
在一个实施方案中，本发明的至少一种blv.rbd配体、偶联有至少一种造影剂的至少一种blv.rbd配体、组合物、诊断组合物、药物组合物或药物将以本领域技术人员确定并且个性化适应于每个受试者的剂量施用。
在一个实施方案中，本发明的至少一种blv.rbd配体、偶联有至少一种造影剂的至少一种blv.rbd配体、组合物、诊断组合物、药物组合物或药物将以有效量施用。
应当理解的是，本发明的至少一种blv.rbd配体、偶联有至少一种造影剂的至少一种blv.rbd配体、组合物、诊断组合物、药物组合物或药物的使用将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。任何特定患者的具体有效量将取决于多种因素，包括所采用的具体组合物、受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径和医学领域中众所周知的因素。
在一个实施方案中，本发明的至少一种blv.rbd配体、偶联有至少一种造影剂的至少一种blv.rbd配体、组合物、诊断组合物、药物组合物或药物将通过注射、口服、局部、鼻腔、口腔、直肠、阴道、气管内、经内窥镜、透粘膜或经皮给药来施用。
在一个实施方案中，本发明的至少一种blv.rbd配体、偶联有至少一种造影剂的至少一种blv.rbd配体、组合物、诊断组合物、药物组合物或药物将通过注射施用，优选将全身注射。适合于全身注射的制剂的实例包括但不限于液体溶液或悬浮液、适于在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式。全身注射的实例包括但不限于静脉内、皮下、肌内、皮内、玻璃体内和腹膜内注射或灌注。在另一实施方案中，当注射时，本发明的组合物、诊断组合物、药物组合物或药物是无菌的。用于获得无菌组合物、诊断组合物、药物组合物或药物的方法包括但不限于gmp合成(gmp代表“良好生产规范”)。
在一个实施方案中，本发明的至少一种blv.rbd配体、偶联有至少一种造影剂的至少一种blv.rbd配体、组合物、诊断组合物、药物组合物或药物将口服施用。适合于口服施用的制剂的实例包括但不限于固体形式、液体形式和凝胶。适合于口服施用的固体形式的实例包括但不限于丸剂、片剂、胶囊、软明胶胶囊、硬明胶胶囊、囊片(caplet)、压制片剂、扁囊剂(cachet)、薄片、糖衣丸剂、糖衣片剂或分散/崩解片剂、粉剂、适于溶解或悬浮的固体形式、口服施用前的液体和泡腾片剂。适合于口服施用的液体形式的实例包括但不限于溶液、悬浮液、可饮用溶液、酏剂、密封的瓶(sealedphial)、饮剂(potion)、药水(drench)、糖浆(syrup)和饮料酒(liquor)。
在另一个实施方案中，本发明的至少一种blv.rbd配体、偶联有至少一种造影剂的至少一种blv.rbd配体、组合物、诊断组合物、药物组合物或药物将局部施用。适合于局部施用的制剂的实例包括但不限于棒、蜡、乳膏、洗剂、软膏、香膏、凝胶、面膜、免洗洗涤剂和/或类似物。
根据靶向的细胞、样品、组织和/或器官，本领域技术人员能够确定将至少一种blv.rbd配体引入靶向细胞、样品、组织和/或器官中所需的技术。
在一个实施方案中，本发明的至少一种blv.rbd配体、偶联有至少一种造影剂的至少一种blv.rbd配体、组合物、诊断组合物、药物组合物或药物将以缓释形式施用。在另一个实施方案中，本发明的至少一种blv.rbd配体、偶联有至少一种造影剂的至少一种blv.rbd配体、组合物、诊断组合物、药物组合物或药物包含控制药剂释放的递送系统。
如本文所用的“靶向细胞、样品、组织和/或器官”可以指受阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选受cat1相关疾病、或受blv感染影响或者怀疑将受其影响的细胞、样品、组织和/或器官。
在一个实施方案中，本发明的治疗有效量的blv.rbd配体、偶联有至少一种造影剂的blv.rbd配体、药物组合物或药物至少一天一次、一天两次或至少一天三次进行施用。
在另一个实施方案中，本发明的治疗有效量的blv.rbd配体、偶联有至少一种造影剂的blv.rbd配体、药物组合物或药物每两、三、四、五或六天进行施用。
在另一个实施方案中，本发明的治疗有效量的blv.rbd配体、偶联有至少一种造影剂的blv.rbd配体、药物组合物或药物每周一次、一周两次、每两周一次或一个月一次进行施用。
在另一个实施方案中，本发明的治疗有效量的至少一种blv.rbd配体、偶联有至少一种造影剂的至少一种blv.rbd配体、药物组合物或药物每月一次地施用至少2、3、4、5或6个月的时间段。
在另一个实施方案中，本发明的治疗有效量的至少一种blv.rbd配体、偶联有至少一种造影剂的至少一种blv.rbd配体、药物组合物或药物范围在约1μg至5g。
在另一个实施方案中，本发明的治疗有效量的至少一种blv.rbd配体、偶联有至少一种造影剂的至少一种blv.rbd配体、药物组合物或药物将以约0.1μg/kg至1g/kg的范围进行施用。
在另一实施方案中，如上所述的本发明的至少一种blv.rbd配体、偶联有至少一种造影剂的至少一种blv.rbd配体、组合物、药物组合物或药物将与用于阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病、或blv感染的另一治疗进行联合施用。
用于治疗阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病、或blv感染的药剂的实例包括但不限于精氨酸去除、化疗、放疗、手术、蛋白激酶抑制剂、微管抑制剂、抗代谢剂、肿瘤疫苗或免疫刺激性抗体。
在本发明的一个实施方案中，用于治疗有需要的受试者中阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病、或blv感染的方法包括在针对阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病、或blv感染的另一治疗之前、同时和/或之后向受试者施用本发明的至少一种blv.rbd配体、偶联有至少一种造影剂的至少一种blv.rbd配体、组合物、药物组合物或药物。
在一个实施方案中，受试者受到影响、优选被诊断为阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病或blv感染。在另一个实施方案中，本发明的受试者处于发展成阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病或blv感染的风险中。发展成阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病的风险因素的实例包括但不限于遗传因素、吸烟、肥胖、糖尿病、酒精和环境条件。发展成blv感染的风险因素的实例包括但不限于环境条件例如暴露于感染了blv的其他受试者。
在另一个实施方案中，本发明的受试者处于阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病之后的缓解阶段。
本发明的另一个目的是用于实施本发明方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含用于检测和/或定量细胞、样品、组织和/或器官中的cat1并特别用于测定至少一种blv.rbd配体与cat1的结合的装置/试剂(means)。
在一个实施方案中，本发明的试剂盒包含如上所述的偶联有至少一种造影剂的至少一种blv.rbd配体。
“试剂盒”是指用于特异性检测和/或定量cat1的包含至少一种试剂(例如，偶联有至少一种造影剂的blv.rbd配体)的任何产品(manufacture)(例如包装或容器)。试剂盒可作为用于进行本发明方法的单元进行推广、分发或销售。此外，任何或全部试剂盒试剂可以提供在保护它们免受外部环境影响的容器内，例如在密封和无菌容器中。该试剂盒还可以包含描述试剂盒及其使用方法的包装说明书。
本发明的另一个目的是用于检测和/或定量调节细胞中cat1功能的化合物的筛选方法，包括：
a.测定和/或定量在所述化合物存在下如上所述的blv.rbd配体与细胞中表达的cat1的结合，和
b.将在前一步骤中测得的结合与不存在所述化合物的情况下如上文所述的blv.rbd配体与所述细胞中表达的cat1的结合进行比较。
如本文使用的术语“调节”因此可以指细胞中cat1存在的增加或降低。
本申请还涉及用于体外或离体或体内诊断阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病或blv感染的方法，包括：
a.使至少一种blv.rbd配体、其变体和/或片段与细胞、样品、组织和/或器官接触，和
b.检测和/或定量与所述受试者内的细胞、样品、组织或器官中存在的cat1结合的至少一种blv.rbd配体。
本申请还涉及用于体内诊断阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病或blv感染的方法，包括：
a.向有需求的受试者施用有效量的至少一种blv.rbd配体、其变体和/或片段，和
b.检测和/或定量所述受试者内至少一种blv.rbd配体、其变体和/或片段。
在本发明的一个实施方案中，blv.rbd配体偶联有至少一种造影剂并且可以用于通过医学成像的体内诊断。
本申请还涉及用于治疗受试者中阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病或blv感染的方法，包括：
a.根据本发明的方法诊断有需要的受试者中阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病或blv感染，和
b.向在步骤(a)中诊断有阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病或blv感染的所述受试者施用治疗有效量的针对阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病或针对blv感染的治疗剂。
在一个实施方案中，用于治疗阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病或blv感染方法因此包括：
a.通过以下方法测定有需要的受试者中阳离子l-氨基酸转运蛋白的功能、优选cat1功能失调的细胞或感染了blv(或还未感染blv)的细胞的存在：
i.将有效量的偶联有至少一种造影剂的至少一种blv.rbd配体、其变体和/或片段施用于受试者，和
ii.使用医学成像检测和/或定量至少一种blv.rbd配体、其变体和/或片段，和
b.向在步骤(a)中诊断有阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病或blv感染的受试者施用治疗有效量的针对阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选针对cat1相关疾病或针对blv感染的治疗剂。
本申请还涉及用于治疗阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病或blv感染的方法，包括向有需要的受试者使用治疗有效量的至少一种blv.rbd、其变体和/或片段。
本申请还涉及用于治疗阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病或blv感染的方法，包括：
a.根据本发明的方法诊断有需要的受试者中阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病或blv感染，和
b.向在步骤a中诊断有阳离子l-氨基酸转运蛋白相关疾病、优选cat1相关疾病或blv感染的所述受试者施用治疗有效量的至少一种blv.rbd、其变体和/或片段。
本申请还涉及用于检测和/或定量细胞中的cat1的体内方法，包括：
a.向身体、器官、组织或细胞施用本发明的偶联有至少一种造影剂的至少一种blv.rbd、其变体和/或片段或诊断组合物，
b.使用医学成像技术检测和/或定量至少一种blv.rbd配体、其变体和/或片段与所述身体、器官、组织或细胞的cat1的结合。
在一个实施方案中，本发明的方法还包括比较在步骤b中测定的结合与参考结合值。
本申请还涉及用于抑制有需求的受试者中cat1活性的方法，其中将治疗有效量的至少一种blv.rbd配体施用于所述受试者。
如本文使用的术语“抑制cat1活性”可以指抑制细胞内通过cat1的精氨酸、组氨酸、赖氨酸和/或鸟氨酸的转运流。
附图简要说明
图1是显示鉴定cat1为blv.rbd同源受体的blv.rbd自动筛选的图。使用tecan机器人和cellomics显微镜筛选172位slc成员上的blv.rbd结合。结合表示为每个孔的总荧光强度。
图2是显示特异性blv.rbd与cat1/slc7a1结合的一组图。hek293t细胞用siluc、sicat1、sicat1并组合cat1表达载体(拯救试验)、空载体(pchix)联合转染或仅用cat1表达载体转染。使用blv.rbd配体监测cat1表达水平。
图3是一组2个直方图，显示了牛白血病病毒包膜糖蛋白(blv.rbd)的受体结合结构域对精氨酸摄取的特异性抑制。通过用pcsimfc空载体(“空载体”)、在pcsi表达载体中与rfc标签融合的blv.rbd(“blv-rbd”，seqidno：12)或在pcsi表达载体中与rfc标签融合的htlv2.rbd(“htlv2-rbd”，seqidno：7)转染的hek293t细胞摄取的放射性标记的精氨酸和谷氨酰胺。n＝3，对未配对数据的双侧student检验(**，p＜0.01；所有其他差异均无统计学意义)。
图4是使用cho细胞显示传染性试验的直方图。在用作为阴性对照的空plxsn表达载体转染的细胞(lxsn)或表达人cat1(hu-cat1)、牛cat1(b-cat1)或人cat2(hu-cat2)的plxsn载体转染的细胞中，测试了blv(左图)和htlv(右图)的传染性。结果显示为感染性颗粒数/ml。
实施例
现在将通过下面的实施例进一步说明本发明，但决不限于此。
实施例1：blv.rbd与cat1的特异性结合
材料与方法
细胞培养和转染
所有细胞系均在由lifetechnologies提供的dmem培养基(dulbecco′smodifiedeaglemedium)(ref：11965-092)中培养，其中含有10％去补体化胎牛血清(panbiotech)、非必需氨基酸(11140-035，lifetechnologies)、谷氨酰胺(25030-081lifetechnologies)和抗生素(青霉素和链霉素)。全部在37℃下在5％co2-95％空气气氛中培养。
20000qt6个细胞接种于96孔板。使用jetprime转染方案用100ng的dna转染细胞。与blv.rbd结合的条件针对自动化条件进行了优化。
tecan机器人染色和cellomics显微镜
使用blv.rbd-mfc配体(seqidno：27)在转染48小时后进行染色。为此，以1/10(v∶v)稀释度测试rbd配体，并使用与alexa
rbd配体的培养在37℃、无摇动下进行，并且抗小鼠igg1-alexa二抗在室温下孵育(与之前方案中的4℃相反)。然后用4％pfa固定细胞，并使用cellomicsarrayscanxtihcs酶标仪(thermoscientific；可在cnrsmri平台获得)测量荧光强度。
高通量筛选检测到的slc候选物通过sirna和hek293t细胞中的过表达来证实(数据未显示)。
由于blv受体在293t细胞上的自然表达以及hek293t细胞单层与塑料的较松散贴壁，我们选择使用quailqt6细胞，其具有我们的blv.rbd配体的最低天然结合和对与我们的slc文库的自动化筛选相容的塑料的单层贴壁。我们选择建立基于cellomics的荧光自动化测定，该测定可以检测和定量可能离开quailqt6细胞单层的潜在分离灶，该单层细胞将由于blv.rbd同源受体的表达而发出高的荧光。
结果
建立了一个slc文库，其中包含近400个描述成员中的172个，来自用我们实验室中获得的构建体完成的人orfeome(mgc平台)。我们继续在quailqt6细胞系中建立一个瞬时过表达的自动化方案，并与用小鼠免疫球蛋白(mfc)的恒定片段框内加标签的blv.rbd结合，以检测和分离blv受体。
因此，当用特异性设计靶向cat1mrna的sirna转染hek293t细胞时，通过流式细胞术测量，blv.rbd结合降低3.5倍(n＝3)。相比之下，当用cat1/slc7a1表达载体转染hek293t细胞时，与用空载体对照转染的hek293t细胞相比，这些细胞中的cat1过表达伴随着blv.rbd结合的3倍增加(n＝3)。
我们的筛选方法提供了cat1(slc7a1)作为blv.rbd和blvenv受体的证据(图1)。根据图1所示的结果，我们将注意力集中在作为blv.rbd配体的推定受体的cat1(slc7a1)上。因此，通过特异性sirna(sicat15’-uaauugcaccuuuggcugctt-3’-seqidno：6)下调cat1mrna导致与hek293t细胞上的blv.rbd的结合显著降低(135对49，图2)。我们进行了拯救试验(共转染sicat1和cat1表达质粒)，并能够恢复cat1的表达，如用blv.rbd配体监测(49对218，图2)。此外，当比较用pchix对照空载体或人cat1表达载体转染的细胞时，blv.rbd可用于监测cat1的特异性增加表达(92对335，图2)。
实施例2：blv.rbd诱导的细胞中精氨酸摄取的抑制
材料与方法
摄取测定
将每孔3.5x105个hek293t细胞接种在涂有聚-d赖氨酸的6孔板中。第二天，使用磷酸钙以下述载体转染细胞：pcsi兔fc(rfc)、pcsiblv.rbdrfc(seqidno：12)和pcsihtlv2.rbdrfc(seqidno：7)。转染16小时后，更换细胞培养基，24小时后，将细胞接种于24孔板(5×104个细胞/孔)中以摄取放射性标记的l-精氨酸或l-谷氨酰胺或在6孔板(3×105个细胞/孔)中以裂解细胞并通过免疫印迹验证rbd的表达。
为了摄取，用稀释于经典dmem中的5μci/mll-精氨酸单盐酸盐[2，3，4-3h](net1123250uc，perkinelmer)或l-谷氨酰胺[3，4-3h(n)](net551001mcperkinelmer)，将细胞在250μl体积的培养基中于37℃孵育30分钟。用冷pbs洗涤2次后，用500μltritonx-1001％将细胞溶解，并在测量放射性之前与2ml液体闪烁混合物(ultimagold，perkinelmer)混合。
同化作用的值对应于每个孔中放射性标记的精氨酸或谷氨酰胺的捕获量(pmol)与蛋白质量(mg)之间的比率。计算结果并使用graphpadprism5进行报告。使用对不成对数据student的双侧统计检验。
结果
测试了blv.rbd在结合后功能性改变其同源受体的能力。为此，进行摄取测定并且它允许我们监测用小鼠fc(mfc)(数据未显示)或兔fc(rfc)标签的blv.rbd是否可以使用放射性标记的精氨酸阻断转运蛋白功能。
据描述cat1在除肝脏和泪腺外的所有细胞类型中泛在表达，并介导阳离子l-氨基酸(包括精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和组氨酸)的不依赖钠的转运。
使用放射性标记的精氨酸单盐酸盐l-[2，3，4-3h]提供了cat1/slc7a1的blv.rbd结合的进一步证据。因此，在引入blv.rbd后抑制由cat1介导的精氨酸转运，并且数据显示blv.rbd可以阻断cat1转运功能(图3)。
这些结果表明，blv.rbd配体能够用于监测cat1细胞表面表达并能够用于多种生物样品中。因此blv.rbd配体能够通过流式细胞术、免疫组织化学(未显示)和免疫荧光体外或通过spect-ct成像体内使用。
实施例3：体外测试blv.rbd对blv感染的影响
材料与方法
材料
来自不同哺乳动物物种的稳定表达cat1的a23细胞系的感染(a23-lxsn：空载体；a23-cat1人；a23-cat1牛；a23-小鼠car1小鼠和a23-仓鼠car1)。
培养基：hek293细胞在含有10％fbs、l-谷氨酰胺、非必需氨基酸和抗生素(青霉素链霉素)的dmem中生长。生产细胞(hek293)和感染的a23细胞将编码gfp。
方法
在第0天(d0)：用hek293细胞(atcc)以3x106个细胞/皿接种4个培养皿(10cm直径)。
在d1(晚上)：转染hek293以产生编码下列包膜(htlv2；blv；水泡性口炎印第安纳病毒(vsv)或无包膜)的病毒假型。用以下载体共转染：
lncg(编码gfp)：10μg，
beb.gp57(gag-pol)：5μg，
包膜糖蛋白：5μg。
磷酸钙转染(500μl的herbs和33μl的cacl2)。
在d2(早晨)：换hek293细胞的培养基。
在d3：收集并过滤hek293细胞的上清液(保持用于上清液感染)；分离并计数生产细胞(用于细胞与细胞感染)。
用上清感染
接种a23细胞(lxsn；hcat1；牛cat1；小鼠cat1和仓鼠cat1)：在96孔板中5000个细胞/孔(确保在50μl培养基中有5000个细胞)。加入等体积(50μl)的病毒上清。n＝4。
细胞与细胞感染
不同指示细胞(a23)与生产细胞(hek293)的共培养。每种条件下2500个细胞/孔的a23和2500个假型生产细胞(例如生产假型的hek293与a23-lxsn)。n＝4。
在d5：(仅用于细胞与细胞感染)。加入选择剂(2mg/ml的g418)。这样，我们将消除敏感的生产细胞，而a23是抗性的。
d8：使用highcontentcellomicsarrayscan获取图像(10x)和荧光强度(可在montpellierrioimagingplatform：mri上获取)。
实施例4：通过cat1结合体外测试带有blv.rbd的blvenv糖蛋白逆转录病毒感染
病毒感染
用空plxsn表达载体或用表达人(hu-)或牛(b-)cat1或人cat2同种型的plxsn构建体稳定转染的cho细胞接种在6孔板中，第二天用blv或htlvenv糖蛋白假型包装的复制缺陷型plko-1-puro慢病毒载体的系列稀释液感染。病毒攻击后一天，用3ug/ml嘌呤霉素在10天期间选择细胞，并计数抗性细胞以确定由于使用blv或htlvenv的进入而引起的病毒滴度。
结果
cho细胞对htlvenv介导的感染的易感性独立于cat1或cat2表达(图4，右图)；相比之下，当表达人(图4，左图，深灰色直方图)或牛(图4，左图，灰色直方图)cat1时，对blvenv介导的感染天然耐受的cho细胞(图4，左图，黑色直方图)变得对blvenv介导的感染特异性敏感，而在表达人cat2同种型时保持抗性(图4，左图，浅灰色直方图)。
这些结果证实，牛白血病病毒(blv)包膜糖蛋白特异性结合不同哺乳动物(包括牛和人)的cat1，但不结合cat2。