本发明涉及免疫原性肽和其用途，特别是在诊断病理中的用途。
背景技术：
：世界上有三分之一的人口感染结核病并且每20秒就有一例死亡，因此结核病(tb)仍然是世界上最致命的疾病之一。目前还没有能够依照卫生当局，尤其是世界卫生组织(who)的期望被验证的快速、准确的诊断测试，而参照测试需要数周才能得到结果。目前用于诊断tb的国际参考方法耗时长(细菌培养长达8周)、低效、昂贵且难以实施，因为它们采用肺标本，并且需要具有3级安全级别的实验室且需要患者住院。2011年，世界卫生组织首次公布了关于使用第一代用于结核病诊断的血清学检测的明确否定性一般政策建议(who2011年，用于诊断结核病的商业血清学诊断试验：政策声明)。在全球，尤其是在南半球(非洲、亚洲)国家，利用了当地监管限制较弱的优势，每年有超过100万次这些没有经过临床验证且低效的检验售出。几乎所有这些检验都采用相同的抗原，并且它们从未经过严格的临床验证，导致性能非常差，给患者带来风险。因此，who对满足严格的质量和临床验证标准的新一代检验提供了机会。在潜伏感染期间，由于其细胞质被脂质空泡饱和的微观外观，tb杆菌包含在符合泡沫状态的巨噬细胞中。结核分枝杆菌储存甘油三酯(tg)形式的脂肪酸，使得细菌能够进入休眠期(潜伏性tb)。这些脂质空泡组成了细菌的碳源并且被后者利用从而结束休眠并被再激活(活动性tb)。在tb的再激活期间tg水平的减少与分解tg的某些蛋白的活性增加是相一致的。迄今研究相对较少的这些蛋白中的一些似乎与tb从潜伏形式到再激活有密切联系并且因此在活动性tb的早期鉴定中获得了极大的关注，或用来监测有发展成结核病的严重形式的高风险的潜伏性tb病例。在现有技术中已知有专利申请wo/2012/164088，其教导了一种基于elispotb使用具有脂肪分解活性的脂肪酶蛋白来诊断活动性结核病的方法。然而，尽管这样的方法在活动性结核病的早期检测中是有效的，但是其仅能够在设备齐全的实验室中利用重型设备来实施，并且需要专门的技术技巧，因此其在处于危险中的人群的所在地不能容易地使用。因此，存在着提供一种更简单的方法的需求，所述方法可保留与利用申请wo/2012/164088的方法所获得的至少一样的活动性tb检测灵敏度水平。技术实现要素：因此本发明的一个目的是提供一种用于诊断活动性结核病的方法，所述方法可以容易地在所有情况下，特别是在医院基础设施装备非常不齐全的情况下实施。本发明的另一个目的是确定最佳的肽候选物，使其能够执行这种新的、快速的、有效的诊断方法。因此，本发明涉及一种用于筛选至少一种所关注的免疫原性肽的体外方法，其能够识别来源于患有活动性结核病的个体的血清的至少一种抗体，所述至少一种免疫原性肽是来源于疏水蛋白的亲水肽，所述疏水蛋白是壁蛋白，或分泌自分枝杆菌属细菌，所述疏水蛋白具有脂肪分解活性，所述方法包括下列步骤：+将来源于至少一种疏水肽的至少一种亲水肽-相继地与至少两个独立集合的来源于患有确诊活动性结核病的患者的血清接触，从而允许在所述抗体和所述待筛选的肽之间形成免疫复合物，以及-与至少一个来源于未患有结核的个体的对照样品接触，+检测前一步骤中免疫复合物的形成，+对于来源于患有确诊活动性结核病的患者的至少一个独立集合的血清，对比率r的值大于或等于1.5的所关注的肽进行第一轮选择，所述比率r是相对于血清和用来检测免疫复合物的成分的各自的背景噪声的免疫复合物形成的标准化测量值，与相对于血清和用来检测免疫复合物的成分的各自的背景噪声的从来源于健康个体的样品获得的标准化测量值的比值，或除以相对于血清和用来检测免疫复合物的成分的各自的背景噪声的从来源于健康个体的样品获得的标准化测量值。本发明基于由发明人所获得的惊人的观察结果，即来源于确定蛋白的某些肽是执行诊断活动性结核病的方法并同时谋求以高水平检测病理的灵敏度和效力的非常好的候选物。由本发明所提出的诊断可以在人类以及动物中完成。在下文中，结核病将统一地称作“结核病(tuberculosis)”或“tb”。在本发明中，术语“具有脂肪分解活性的疏水蛋白”用来指具有脂肪分解活性的酶，并且包括磷脂酶a、b、c或d，和脂肪酶，特别是甘油三酯脂肪酶、脂肪酶或甘油二酯脂肪酶、甘油一酯脂肪酶。在感染期间，结核分枝杆菌聚集填充了脂质的细胞内包涵体，其脂质有可能来源于宿主细胞膜的降解。已经有强力的证据来支持下面的事实：脂肪酸是休眠期间的碳源。当进入非复制持续期(潜伏期)时，结核分枝杆菌储存甘油三酯(tag)形式的脂肪酸。此外，已经发现了含有泡沫状巨噬细胞的肉芽肿，所述泡沫状巨噬细胞是胞浆中含有大量被磷脂包绕的中性脂质的细胞。这些脂质体是由细菌的内化所诱导的，并且因此提供了病原体生存和再激活的碳源。更普遍地，这些发现支持了下面的事实：参与脂质降解的酶可以发挥显著的生理功能并且可以参与来自感染细胞的结核分枝杆菌的出色的生存能力和再激活。结核分枝杆菌对宿主脂质的降解可能通过脂解酶来完成，诸如脂肪酶和磷脂酶，包括角质酶家族。脂肪酶是具有脂肪分解活性的水溶性蛋白质，属于酯酶组并催化不溶于水的底物的水解，所述底物例如为三酰基甘油和磷脂的酯键。就此而言，脂解催化反应涉及界面处的不同过程，并且密切地取决于存在于水包油乳液中的脂质底物的结构、膜双分子层、胶束和囊泡。催化过程可以被描述为在油/水界面中发生的脂肪酶的吸收/解吸的可逆步骤，紧接着在界面处形成酶/底物复合物并释放脂解产物。在已鉴定的结核分枝杆菌脂肪酶中，24种已经归类在称为“lip家族”的酶家族中。然而，这种分类仅基于gxsxg共有序列的存在，gxsxg共有序列是酯酶的特征并且是具有α/β折叠的水解酶家族的成员。因此在本发明中，用于检测免疫原性肽的方法是基于利用具有脂肪分解活性的蛋白的特性(所述特性使得能够检测活动性结核病)，同时消除了利用全蛋白工作的困难，利用部蛋白会难以操作和/或制备起来昂贵且复杂。实际上，寻找所述具有脂肪分解活性的蛋白质的小免疫原性片段是特别有意义的，因为它们是膜蛋白(插入至脂质双分子层中)并且因此是疏水的，或简单地因为它们是降解脂质的蛋白，因此是疏水的。在本发明中，“疏水蛋白”是指总体上被认为对水性溶液亲和力小并且在水性液体中溶解能力小的蛋白。蛋白由氨基酸组成，氨基酸可以是极性的(亲水的)或疏水的。当合成蛋白时，其采取与其活性或其功能有关的特异性的三维构象，使得在序列中彼此远离的氨基酸可以在空间上彼此靠近地存在。如果在蛋白折叠期间，所有极性氨基酸都存在于被疏水氨基酸包绕的小袋中，则整个蛋白将被认为是疏水的，即便亲水氨基酸的比例高于疏水氨基酸的比例。同样，如果蛋白的三维构象使得存在于蛋白表面上的大多数氨基酸是亲水的，则所述蛋白被认为是亲水的。本领域专业技术人员对蛋白的亲水性和疏水性的概念是熟知的。对于本领域专业技术人员来说，从蛋白的基本序列也可通过预测其结构和其疏水性指数来确定亲水性/疏水性谱。在本发明中，“来源于疏水蛋白的亲水肽”是指如上所述的所述疏水蛋白的片段，其特性是在水性液体(即，水或极性溶剂)中易溶且是稳定的。为了从疏水蛋白预测根据本发明要筛选的亲水肽，特别地有可能基于所述肽本身的溶解度来进行。具有许多碱性残基而没有插入酸性残基(酸/碱平衡)的序列可能难以溶解。因此，确定平衡以便分析在筛选后可能具有免疫原性的每个肽序列的溶解度。因此重要的是使用下面的公式选择酸/碱平衡bab最大的肽：bab＝aaa-bbb其中aaa＝(na/n)x100，na＝序列中氨基酸的酸性残基的数目，n＝氨基酸的数目，以及bbb＝(nb/n)x100，nb＝序列中碱性氨基酸残基的数目，n＝氨基酸的数目。溶解度还可以通过对带电荷残基的数目进行计数并且加入肽的游离末端来预测。理论上，每5个残基需要至少一个电荷来获得最小溶解度。还需要避免连接超过3-4个以上的疏水残基。在ph为6.8时的疏水性使得有可能核实肽在水性缓冲液中的溶解度。所述值使得有可能核实在与载体蛋白缀合的步骤期间与偶联缓冲液的相容性。要注意的是在ph＝6.8时的疏水性对应于ph＝6.8时被考虑的肽的每个氨基酸的疏水性与所述肽的氨基酸的总数的比值。可能特别有利的是在检测它们的免疫原性之前核实待筛选的肽是例如i)柔性的，即，不是空间约束的，即，具有相对于肽的一般结构对任何抗体自由可及的表位，ii)是否位于保留的蛋白图谱或二级结构(螺旋，β折叠)中，这样会降低它们的特异性，iii)是否存在于其所来源的全蛋白上的暴露区。本领域专业技术人员还可以寻找可以完成对潜在的免疫原性肽的选择的其它适宜的特征。一旦鉴定了亲水肽，可使用下面的方法来测试它们的免疫原性：1-将每种肽与至少两个集合的血清接触，所述血清来源于患有临床上确诊的活动性tb的患者，以及2-平行地用来源于未患有结核病(特别是活动性结核病)的健康个体的对照样品测试，即，所述健康个体是从未接触结核病的个体或处于结核病潜伏期(并且因此不是进展的活动性结核病)的患者。目标是确定被测试的肽是否能够与来自患有活动性tb的个体的所述集合的血清中包含的至少一种抗体形成免疫复合物，这意味着所述肽是潜在诱变的。根据传统的方法检测潜在的免疫复合物，所述传统的方法由下列的步骤组成：标记并鉴定免疫复合物的存在，检测抗体中可能与待筛选的肽相互作用的恒定部分，使用抗体恒定部分的特异性免疫球蛋白与标记物偶联，允许定量。用于检测这些免疫复合物的传统实验室方法由elisa(酶联免疫吸附测定)测试组成。这种检测方法也可以适合在不同的固体基质上进行从而便于在实验室外鉴定免疫复合物。为了确定哪个肽是所关注的肽，计算比率r，所述比率r是相对于血清和用来检测免疫复合物的成分的各自的背景噪声的免疫复合物形成的标准化测量值，与相对于血清和用来检测免疫复合物的成分的各自的背景噪声的从来源于健康个体的样品获得的标准化测量值的比值，或除以相对于血清和用来检测免疫复合物的成分的各自的背景噪声的从来源于健康个体的样品获得的标准化测量值。这意味着适用下面的公式：其中：-vp+e对应于当将肽(p)与患有活动性tb的患者(e)的血清接触时在检测人复合物的过程中测量到的值，-vs+e对应于当将肽的溶剂(s)与患有活动性tb的患者(e)的血清接触时在检测人复合物时测量到的值，-vp+n对应于当将肽(p)与健康个体(n)的血清接触时在检测免疫复合物时测量到的值，-vs对应于当将肽的溶剂(s)与健康个体(n)的血清接触时在检测免疫复合物时测量到的值，以及-vblanc对应于在缺少任何血清、肽和溶剂的情况下在检测免疫复合物时测量到的值。所述值被称作是标准的，因为对于每次测量，考虑每种生物材料的潜在背景噪声：血清(阳性血清与健康个体的血清比较)，肽(肽与其溶剂进行比较)，等。无论使用哪种方法来获得比率r，如果对于确定的肽，如上所计算的比率大于或等于1.5，则所述肽被认为是所关注的肽，并且能够有效地检测活动性tb的标记抗体。相反，如果比率r小于1.5，则其不会被使用。在本发明中，如上所述，将每种肽与至少两个集合的血清接触。在第一轮中，使用集合或几种血清的混合物，所述血清来自不同的患者，每名患者都患有临床上确诊的活动性tb(阳性微生物培养结果-参考临床测试)。这些集合使得能够获得多种血清的混合物，并且因此增加了可以被检测到的抗体的多样性。使用独立的集合，即，不具有相同来源的血清的混合物。例如，如果第一个集合的血清包含来自4个不同个体的4种血清，则第二个独立集合的血清包含几种血清(这些血清中没有一种与第一个集合的血清中的至少一种血清有共同之处)。有利地是，如上所述，肽和集合中包含的抗体之间的免疫复合物通过使用与检测试剂偶联的免疫球蛋白通过免疫检测来进行定量。例如，取决于所使用的标记物，有可能测量光密度od。取决于所使用的标记物，本领域专业技术人员将知晓如何确定用于定量免疫复合物的最佳方法。在本发明中，优选的肽是对于至少两个集合的血清的所有集合来说，比率r大于1.5的那些肽。当然，对于至少两个集合的血清中的一个集合来说，比率r大于或等于1.5的肽也是所关注的肽。相反，无论至少两个集合的血清中哪个被考虑的集合中比率r小于1.5的肽都将不被选择。在一个有利的实施方案中，本发明涉及上述的筛选方法，所述方法进一步包括以下的步骤：-将在所述第一轮选择步骤中选择到的肽与组成来源于患有确诊活动性结核病的患者的所述独立集合的血清的每个个体血清接触，从而允许在所述抗体和待筛选的所述肽之间形成免疫复合物，-检测前一步骤中免疫复合物的形成，以及-对于组成患有确诊活动性结核病的患者的所述独立集合的血清的每个个体血清，对比率r的值大于或等于1.5的所关注的肽进行第二轮选择。有利地，一旦使用上述方法鉴定到肽，利用组成至少两个集合的血清的每种血清单个地进行第二轮反应性测试也是有利的。这种双重筛选对选择进行确认，使得有可能潜在地去除选择到的仅识别在集合中的一种血清中占比例过高的抗体的肽。如在第一轮筛选期间，根据上述的公式测量比率r，并且将比率r大于或等于1.5的肽选择作为性能最佳的肽，即，对活动性结核病(活动性tb)的特异性抗体具有强亲和力的肽。有利地，本发明涉及上述的方法，其中，在第一轮选择期间，对于来自患有确诊活动性结核病的患者的至少两个独立集合的血清仅选择比率r的值大于或等于1.5的肽。当然特别感兴趣的和有利的是选择下面的肽：在集合中的第一轮筛选期间，对于所述至少两个集合中的每一个，其比率r大于或等于1.5的肽，以及对于组成所述至少两个集合的所述血清中的每一种，其比率r大于或等于1.5的肽。在另一个有利的实施方案中，本发明涉及如上所述的方法，其中基于其表观亲水性通过生物信息学来鉴定所述亲水肽。如上所讨论的，可以使用不同的标准来确定潜在的亲水肽，必须根据本发明的方法来测试所述潜在的亲水肽以确定它们的免疫原性。这种肽选择可以通过信息学通过为本领域技术人员评估不同的相关标准来完成，诸如亲水性、稳定性、溶解性、二级结构、全蛋白中肽的可及性、柔性，等等。本领域技术人员将知晓如何来选择最相关的一个或多个标准来确定所述肽是否被认为在本发明的含义范围内是亲水的，以及其是否应当使用上述的方法来筛选。根据另一个有利的实施方案，本发明涉及上述的方法，其中所述亲水肽的长度为15至25个氨基酸。本发明中筛选的肽是平均长度在15至25个氨基酸的肽，即，具有15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个天然氨基酸。这些肽还可以在一个或数个氨基酸残基上进行修饰。例如，通过保护某些残基诸如半胱氨酸ii残基，有可能在这些肽上添加另一个n-末端或c-末端化学基团，使得它们更容易在快速测试中操作和使用(接枝到底物上、表位呈递、构象等)。这些基团可以是例如生物素，bsa的可溶性“载体”蛋白、硫醇或nh2型，只要其不存在于所关注的肽序列中即可。有利地，本发明涉及前面描述的方法，其中使用针对免疫球蛋白的恒定部分的标记抗体通过免疫检测来检测免疫复合物。本发明还涉及至少一种亲水肽，所述亲水肽意在检测患者血液样品中的活动性结核病，其能够使用上述的方法来获得或筛选。此外，本发明涉及能够使用上述方法筛选的肽，其用于诊断个体中的活动性结核病。本发明进一步涉及至少一种亲水肽，其包含来源于疏水蛋白的15至25个氨基酸，所述疏水蛋白是来自分枝杆菌属的细菌壁蛋白，所述疏水蛋白具有脂肪分解活性。本发明还涉及一种亲水肽，其包含来源于疏水蛋白的15至25个氨基酸，所述疏水蛋白是来自分枝杆菌属的细菌壁蛋白，所述疏水蛋白具有脂肪分解活性，所述亲水肽用于诊断个体中的活动性结核病。如前所述，使用上述方法筛选的肽特别有利于用于执行诊断个体中的活动性结核病的方法。事实上，由于对这些肽选择的是它们检测患有活动性结核病的患者的血清中存在的特异性抗体的能力，因此它们将特别有效地用于确定个体的关于结核病的血清学状态。在一个有利的实施方案中，本发明涉及如上所述的一种亲水肽，所述肽由下列序列中的任一个表示：seqidno:1至seqidno:30。在本发明中，seqidno:1至seqidno:30是指下列的序列：seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19、seqidno:20、seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23、seqidno:24、seqidno:25、seqidno:26、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29和seqidno:30。本发明的最有利的肽是具有下列序列的肽：seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4和seqidno:5,对于四个独立集合的血清，其比率r明显地大于1.5。seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18和seqidno:19所表示的肽也是所关注的肽，因为对于测试的4种血清中的三种，比率r大于1.5。本发明还有利地涉及一种组合物，所述组合物包含选自具有下列序列的肽的至少一种肽：seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19、seqidno:20、seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23、seqidno:24、seqidno:25、seqidno:26、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29和seqidno:30，其用于诊断个体中的活动性结核病。有利地，本发明涉及一种用于上述用途的组合物，其包含选自具有下列序列的肽的至少一种肽：seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4和seqidno:5。有利地，本发明涉及一种用于上述用途的组合物，其包含选自具有下列序列的肽的至少一种肽：seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19。本发明还涉及一种用于诊断可能患有活动性结核病的个体的体外方法，所述方法包括：-将来自所述个体的血液样品与如上所述的至少一种亲水肽接触的步骤，以及-检测所述血液样品的至少一种抗体和所述肽之间的免疫复合物的步骤。根据另一个方面，本发明涉及一种用于诊断个体中的活动性结核病的方法，包括将来自所述个体的血液样品，尤其是血清，与选自具有下列序列的肽的至少一种肽接触的步骤：seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19、seqidno:20、seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23、seqidno:24、seqidno:25、seqidno:26、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29和seqidno:30,以及检测所述血液样品的至少一种抗体与所述至少一种肽之间的至少一种免疫复合物的步骤。本发明进一步涉及一种用于诊断活动性结核病的试剂盒，其包含：-如上所述的至少一种亲水肽，以及-用于鉴定来源于个体的血液样品的至少一种抗体和所述至少一种肽之间的免疫复合物的装置。在根据本发明的试剂盒中，所述至少一种肽特别地是选自具有下列序列的肽的一种肽：seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19、seqidno:20、seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23、seqidno:24、seqidno:25、seqidno:26、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29和seqidno:30。用于检测免疫复合物的装置可以涉及提供特异性地识别抗体(特别是人抗体)的恒定部分的免疫球蛋白，所述免疫球蛋白特别地能够与荧光染料、酶等偶联。本领域技术人员知晓哪种类型的标记的免疫球蛋白适宜用于制备这样的试剂盒并且执行对免疫复合物的检测。有利地，本发明涉及如上所述的试剂盒，其包含用于鉴定来源于个体的血液样品的至少一种抗体之间的免疫组合物的装置被配置在色谱型基质上。还可以使用其它形式，诸如磁球或“电传感器”。根据本发明的一个有利的方面，提供了一种用于检测活动性结核病的试剂盒，所述试剂盒是便携式试剂盒的形式，可在所有情况下使用，以及可通过留取一滴血在所有情况下使用。这样的试剂盒是一种可在数分钟内实现的快速检测试剂盒。这样的一种便携式试剂盒的实例图示在图1中。有利地，本发明涉及上述的试剂盒，其进一步包括至少一个阳性对照。无论其是否包含要在实验室中使用的试剂盒，或尤其是便携式试剂盒，其特别有意义的是具有阳性对照，即，来自其活动性结核病被临床确认或已经被确认的一个或数名患者的血清。从静脉血或毛细管血简单、可靠并快速地诊断活动性tb的可能性是医疗上和经济上的成功，至少与用于检测其它感染(例如，hiv)的快速测试一样。尽管所述测试的特异性不是最佳的，但良好的阴性预测值允许这种类型的测试成为广泛使用的一线应用以用于筛选疾病并且为验证测试提供方向。对用于筛选或诊断活动性tb的快速测试的开发明显地有助于满足由who所设定的消除结核病的目标。在另一个有利的实施方案中，本发明涉及上述的试剂盒，其中所述至少一种亲水肽与磁性纳米壳偶联。根据本发明的肽与磁性纳米壳的偶联使得能够利用较小量的肽以及尤其是在10分钟内(相比而言，传统elisa需要大约2小时)获得类似于传统elisa免疫学测试的结果。这种偶联的优势在于其限制了消除非特异性相互作用所需的洗涤时间，因为是通过上面形成免疫复合物的壳所产生的磁性来分离免疫复合物。本发明进一步涉及如上所述的亲水肽，特别是基本上由序列seqidno:1至30中的任一个组成的肽，或由序列seqidno:1至30中的任一个组成的肽，其用于诊断个体中的活动性结核病。如上所述，本发明的特异性肽非常适宜于检测针对结核分枝杆菌肽的抗体，并且因此使得能够对个体做出活动性结核病诊断。附图说明借助于下面的附图和实施例将更好地理解本发明。附图图例图1显示了根据本发明的示例性的便携式试剂盒。图2显示了表示图1的实施方案的示意图。图3是在活动性结核病的阳性诊断(++)或阴性诊断(-)时获得的可视化结果的示意性图示。t表示对样品阳性的显著性标记，t+指示反应的阳性对照。箭头指示迁移方向。图4-7显示了以指数形式(根据本发明的比率r)表示的被测试肽的反应性的直方图。图8显示了以指数形式(根据本发明的比率r)表示的肽c2、c12、m3、v5和g9的反应性(分别由序列seqidno:1至5显示)的直方图。直方条显示了对每个肽所测试的4个集合的血清。图9描绘了直方图，该图显示了使用肽seqidno:3，传统elisa技术(深灰色的柱)和纳米壳技术(浅灰色的柱)获得的结果之间的比较。样品1和2对应于阳性对照，样品3和4对应于阴性样品，样品5至7对应于来自患者的血清，样品8对应于被认为是阴性的样品。图10描绘了直方图，该图显示了来自实验室的“labtable”形式(黑色柱)与所开发的原型的“便携式”形式(灰色柱)对19份人血清(13份具有活动性tb的阳性样品，样品1-27，以及6份未感染的阴性样品，样品neg1至neg6)的评估结果之间的比较。图11显示了直方图，该图显示了分析在优化的便携式原型上以单盲方式测试的20个样品(15个阳性和5个阴性)所获得的信号的平均值。阳性样品为编号1,3,4,5,7,8,10,11,12,14,15,16,17,19,20。阴性样品为编号2,6,9,13,18。图12描绘了直方图，该图显示了对于阴性(neg6)或阳性(pos1)样品，对磁性纳米壳-诊断候选肽偶联的稳定性随时间变化的评估。该直方图在此显示了利用相同技术在磁性纳米壳上，使用在纳米壳上以不同的时间间隔接枝的相同肽(m3)，对两名患者血清样品(一名阴性，一名阳性)的评估。对两者进行分析，将在11/24/2016接枝并进行测试的肽(对于两名患者中的每一个都是右侧的直方图)与在09/12/2017接枝并在11/30/2016和12/01/2016测试的相同肽(对于两名患者中的每一个都是前两个直方图)进行比较。对于所述肽，随着时间变化信号似乎在减小，这可以由肽在溶液中的不稳定或缺乏接枝重复性来解释。具体实施方式如果参照图1，则根据本发明的用于诊断活动性结核病的试剂盒由下列的装置组成，所述装置包括盒1,盒1包括三个窗2、3、4，使得分别能够检测具有阳性对照的样品的反应性、检测具有至少一种本发明所述的肽的样品的反应性，以及沉积待检测的血清样品。盒1遮盖位于窗4下方的容器，所述容器包括-样品基质5，其允许对所沉积样品(血液、血清、人血浆)进行大分子过滤，并且能够监测基质(离子强度、吸收速度，等)。-缀合基质6，其包括针对抗体(其可以包含在待检测样品中)的检测抗体，所述检测抗体偶联有示踪剂诸如胶体金、胶乳、碳。位于窗3和2下方的是由硝酸纤维素、尼龙或聚偏二氟乙烯(pvdf)制成的膜7，在膜7上固定了线形式的根据本发明的至少一种肽(窗3下方)和线形式的生物素化牛白蛋白(窗2下方)。所述容器进一步包括与膜7并置的吸收剂基质8，吸收剂基质8的功能是充当残液容器并且用于稳定迁移速度。图2显示了处于使用中的图1的装置。首先，将生物样品(特别是血液或血清)经由窗4沉积在样品基质5上。在由吸收剂基质8所产生的毛细作用以及促进毛细作用的专用迁移缓冲液的作用下，样品的内容物逐渐地以恒定的速度被转移到缀合基质6，在此生物样品的抗体能够与检测抗体偶联。在毛细作用的作用下，样品的内容物从缀合基质6迁移到膜7。当它们经过根据本发明的肽线时，针对本发明的肽的抗体通过免疫反应而被固定，剩余的样品继续迁移。对于对照线也是如此。如图3中所示，当待测试样品包含已经沉积在膜7上的针对本发明的肽的抗体时，后者被固定化并且积累，并且由于与标记抗体偶联，能够看见反应性的指示线在测试带t处出现。实施例实施例1–对待筛选的肽的鉴定从脂解酶家族的25个重组蛋白中，发明人已经进行了表位筛选以便基于不同的特征(如疏水性、二级结构等)通过计算机模拟将超过800种肽进行排序。这种排序允许选择200种候选物，这些候选物集中了用于诊断活动性结核病的最有潜力的多种特征。进一步在elisa测试中评估200种肽中每一种的免疫原性以用于这些肽的筛选。根据从患者集合所获得的结果，保留30个最佳候选物用于继续进行技术评估。使用计算机算法并且从所提供的基因序列，鉴定诊断性候选蛋白的主要特征并且建立了最有潜力的肽的分类。除此之外，发明人获得了15个氨基酸的833个重叠肽的清单，基于它们的计算机模拟的理论免疫原性归类为4组(1,2,3和“差”)(1为最好，“差”为最差)。关于200个测试肽的信息显示在下表1中：表1：200个测试肽的清单为了确定肽的免疫原性，使用下列的elisa测试对它们进行测试：将肽固定在maxisorp(高结合)板上：于4℃下孵育过夜，其中蛋白的浓度以μg/ml计为20至50。用300μl磷酸盐缓冲盐水(pbs)冲洗各孔。利用200μl牛血清白蛋白(bsa)2％和0.01％吐温20(tween20)在环境温度(19℃-25℃)将“各孔”封闭2小时。用200μlpbs冲洗各孔。沉积100μl以1/100在封闭溶液中稀释的来自患有活动性ta的患者的血清，并在37℃下孵育1小时。进行3次洗涤(300μl)pbs-tween20(0.05％)。加入100μl用封闭溶液以1/20,000稀释的与过氧化物酶缀合的抗体并且在37℃下孵育1h。进行3次洗涤(300μl)pbs-tween20(0.05％)。加入100μl3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)并且在暗处孵育20分钟。与1n下沉积50μl硫酸。使用分光光度计在450nm处读取被过氧化物酶转化的tmb(指示肽和血清中包含的抗体之间有免疫复合物形成)的量。图4至7显示了直方图，该图显示了不同的测试肽的比率r(指数)。图8显示了最有潜力的肽c2,c12,m3,v5和g9(分别由序列seqidno:1至5显示)的反应性。实施例2–来自用于筛选的集合中的不同个体患者的样品上的4种肽的反应性为了确认所研究的肽实际上能够诊断活动性结核病，发明人测试了4种肽(m3:seqidno:3；c12:seqidno:2；c2:seqidno:1和o7:seqidno:6)的反应性。下表显示了利用16名患者的血清获得的结果：患者m3c12c2o7#1++++++++++++#2++++++++/-#3++++/-+/-+/-#4+++++++/-+#5++++++/-#6+++++/-+++#7+++++++/-+/-#8++++/-++++++#9+++++++/--#10++++++++++++#11++/-+/--#12++/-+/-+/-#13+++/--#14+/-+++#15+/--+/--#16-+++--+++：强阳性；+：阳性；+/-：有限的阳性值；-：阴性。结果显示在最佳的5个经鉴定的候选物中，3个候选物(m3,c2,c12)检测出大多数的患有活动性tb的测试个体(或94％)，证实了利用患者的集合所获得的结果。相反，o7的诊断能力较低，对于这些测试患者，鉴定出活动性tb病例的灵敏度低于70％。实施例3–根据所使用的样品的集合的批数比较肽的反应性为了评估肽的反应性并选择用于活动性结核病诊断测试的最有潜力的肽，发明人对样品的几种不同集合上的每一种肽的免疫原性进行了评估。对所有测试的集合具有反应性的那些被选择为最佳候选物。下表显示了在阳性样品的两个不同的集合中3种测试肽的实例。肽od阴性集合阳性集合1的比率阳性集合2的比率d70.3031.71.7c40.077-0.31.8b40.4080.91.0在筛选结束时选择发现比率为1.5的肽，所述肽是活动性tb的最佳诊断性候选物。在所有测试肽中，对于患者的两种集合，一些肽的比率均>1.5(实施例d7)，而其它的肽对于两种集合中的一个是阳性的(实施例c4)或者对两种集合均是阴性的(实施例b4)。下一步通过使用被活动性tb感染或未感染的个体患者的样品对肽的筛选进行修正。实施例3–检测结核病的备选方法在发明人完成elisa概念验证之后，通过将本发明中所述的最佳的结核病诊断候选肽综合在一起，开发了横向流动测试。这些结果不够良好，从而不能满足who的规格以及目标产品特性的期望值。因此发明人倾向于搁置此横向流动策略以寻求性能更好的备选方法。发明人基于磁性纳米壳开发了一种技术，使得能够显著地改善elisa测试的性能，无需洗涤并且仅需几分钟。所述策略与小型化当前现有元件以提出一种快速的实验室诊断解决方案以及未来的床边诊断测试的角度相关。以用于实验室的labtable形式开发了纳米壳技术，其不能非现场地采用。这是所述测试的初始形式。利用此形式完成的第一批测试显示通过将磁性纳米壳与本发明的最佳诊断候选肽组合，并且使用检测患者血清中的抗体的策略，发明人获得了至少与elisa一样好的结果，但是使用了更少量的肽，并且尤其是在10分钟内完成(相比而言，传统elisa需要大约2小时)。对于最佳的5种肽之一的结果实例图示在图9中。因此发明人继续进行试验，并且在优化测试(血清的稀释度，对肽组合的测试，检测抗体的选择，背景噪声控制等)后，发明人从最佳的5种候选物中鉴定出待使用的最好的肽。并行地，开发出了便携式的原型，并且发明人测试了19个样品(13名患有活动性tb的患者，和6名疾病阴性者)。图10的结果显示此便携式原型使得能够获得与之前由发明人开发的labtable系统所获得的至少一样好的结果，由此能够清晰地区分阳性患者和阴性患者。最后，对20个其它样品完成的最新测试以单盲的方式评估了便携式原型区分活动性tb患者与未感染者的能力(图11)，证实了综合了诊断候选肽的组合以及在其便携式形式中纳米壳技术的测试的性能。还进行了再现性测试，没有显示任何变化。纳米壳-肽偶联的稳定性可被提高，因为观察到测试信号随时间推移而逐渐降低(图12)。因此便携式原型显示了非常令人鼓舞的结果。本发明并不限于已显示的各个实施方案，并且对于本领域技术人员来说其它实施方案是显而易见的。序列表<110>omunis公司朗格多克-鲁西永axlr技术转移加速公司法国国家健康和医学研究院蒙彼利埃大学蒙彼利埃大学医疗中心<120>免疫原性肽和其用途<130>br99293<141>2017-02-24<150>fr1651610<151>2016-02-26<160>200<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>15<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>unsure<223>源于lipc<400>1aspleuleuthrproglyileasngluvalargargargasparg151015<210>2<211>15<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>unsure<223>源于lipc<400>2argasnalapropropheleuvalilehisglyserargaspcys151015<210>3<211>15<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>unsure<223>源于lipm<400>3glyglythralalysthrproglyproleuargmetleuargile151015<210>4<211>15<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>unsure<223>源于rv2349c<400>4thrproleuthralaprogluglythrproglyglutrpilepro151015<210>5<211>15<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>unsure<223>源于lipg<400>5lysthrleualavalilepheserserasnasnhisargpheleu151015<210>6<211>15<212>prt<213>人工序列(artificialsequenc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