用于表征包含花生抗原的组合物的方法与流程

本申请要求2015年12月29日提交的美国临时申请号62/272,094和2016年12月8日提交的法国专利申请号163306642.6的权益，将其各自通过题述以其整体并入本文。发明领域本发明涉及用于表征例如测定包含花生过敏原的治疗性组合物的释放谱、过敏原特征等的方法，所述治疗性组合物用于治疗、缓解或以其他方式降低受试者中的花生过敏。
背景技术：
花生过敏在身体的免疫系统响应于一种或多种花生过敏原产生异常超敏反应时形成。花生过敏在儿童和成人中都是最常见的食物过敏之一。其受到特别的关注，因为其相对常见、通常伴随一生并且能够引起严重的过敏反应。花生过敏是因食物过敏引起过敏性反应(anaphylaxis)和死亡的主要原因。花生是一种常见的食物成分，这使得严格避免很困难。因此，对于那些尝试避免花生的人误食花生的比率相对较高。出于这些原因，花生过敏已经成为重要的公共卫生问题。当前进行的研究着眼于开发用于治疗花生过敏的组合物。需要体外测定已知的和新开发的组合物的花生过敏原释放数据的方法，用于质量控制和预测体内释放谱这两方面。技术实现要素：本发明部分基于发现了测定过敏原的释放谱和/或测定包含过敏原的组合物的致敏特征的高度灵敏的方法。本发明描述的方法提供了获得样品中存在的花生过敏原概貌并且允许测量样品中存在的低水平、相关过敏原所需的灵敏度和准确性，所述样品如蛋白质提取物、治疗性组合物或溶出或释放介质。在示例性实施方案中，所述方法包括检测样品中以一种或多种过敏原的一种或多种同种型形式存在的过敏原消化产物。以花生过敏原的多种同种型形式存在的过敏原消化产物的鉴定提供了关于样品的定性和定量信息，其可以作为批次间一致性的指示，并且能够提供储存在基质上或基质中的过敏原的释放谱，所述基质如纳米颗粒。一方面，本发明的特征在于一种用于确定组合物中花生过敏原的特征(signature)的高度灵敏的方法。该方法包括从组合物(例如，介质或其他样品)中消化组合物中存在的花生过敏原以产生过敏原消化产物，将过敏原消化产物片段化以产生肽片段，通过质谱法检测和鉴定过敏原消化产物，和确定组合物中花生过敏原的特征的步骤。在特定实施方案中，所述方法用于确定组合物中以低浓度存在的一种或多种花生过敏原的特征。所述特征包括组合物中过敏原的类型和量(例如，相对量)。在某些实施方案中，组合物是水性介质，例如水性药物组合物，分析样品，溶出介质或释放介质。在一些实施方案中，组合物中花生过敏原的总量非常低。例如，特定花生过敏原(例如，arah1、arah2、arah3或arah6)的量可低于约2μg/ml、低于约1.5μg/ml、低于约1μg/ml或低于约0.5μg/ml、例如约0.2μg/ml。在一些实施方案中，该方法还包括将花生过敏原特征与特征标准进行比较的步骤。特征标准可以是由监管机构例如fda(食品和药品管理局)或ema(欧洲药品协会)设定的肽谱，根据工业标准建立的肽谱，或通过重复实验确定的根据预期设定的谱。特征标准可以详细说明(specify)预期在样品中发现的花生过敏原的类型和相对量。在某些示例性实施方案中，过敏原消化产物的长度为约4个氨基酸至约50个氨基酸，长度为约6个氨基酸至约30个氨基酸，或者长度为约15个氨基酸至约20个氨基酸，或长度为约15、16、17、18、19或20个氨基酸。在某些示例性实施方案中，通过包括串联质谱的方法进行对过敏原消化产物的片段化和检测肽片段的步骤，所述串联质谱例如液相色谱-串联质谱(lc-ms-ms)、纳米串联质谱(nanolc-ms-ms)或纳米高效液相色谱-串联质谱(nanohplc-ms-ms)。在某些示例性实施方案中，所述特征(例如，花生过敏原特征和/或特征标准)包含一种或多种arah1过敏原消化产物，其具有选自下组的氨基酸序列：seqidno:17、seqidno:70、seqidno:177、seqidno:155、seqidno:93和seqidno:40。在一些实施方案中，所述特征包含来自arah1、arah2和arah6的过敏原消化产物。在其他实施方案中，标记包括来自arah1、arah2、arah3和arah6的过敏原消化产物。在一些实施方案中，所述特征包括一种或多种过敏原消化产物，所述过敏原消化产物具有选自下组的氨基酸序列：seqidno:17、seqidno:70、seqidno:177、seqidno:197、seqidno:198、seqidno:199、seqidno:200、seqidno:201、seqidno:236和seqidno:237。在一些实施方案中，所述特征包括一种或多种过敏原消化产物，所述过敏原消化产物具有选自下组的氨基酸序列：seqidno:17、seqidno:70、seqidno:197、seqidno:198、seqidno:199、seqidno:200、seqidno:201、seqidno:236和seqidno:237。在一些实施方案中，适用于建立花生过敏原谱的过敏原消化产物存在于花生过敏原超过一种的同种型中，例如特定过敏原(例如，arah蛋白或多肽)的2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16或更多种同种型。例如，适用于花生过敏原特征谱的过敏原消化产物可以存在于如下之一或任何组合中：arah1的2、3、4、5、6、7、8或更多种同种型，arah2的2、3、4、5、6、7、8或更多种同种型，arah3的2、3、4、5、6、7、8或更多种同种型，和/或arah6的2、3、4、5、6、7、8或更多种同种型。在一些实施方案中，适用于花生过敏原特征谱的过敏原消化产物存在于一种或多种花生过敏原的所有同种型中。在某些示例性实施方案中，将花生过敏原用一种或多种蛋白酶消化。例如，将花生过敏原可以用一种或多种选自胰蛋白酶、内蛋白酶lys-c和内蛋白酶arg-c的蛋白酶消化。在某些示例性实施方案中，包含花生过敏原的组合物还包含内标(internalstandard)。例如，在一些实施方案中，内标包含一种或多种重同位素，例如13c和/或15n。在某些实施方案中，内标不是全长过敏原，而是肽的片段。该片段通常长度小于50个氨基酸(比如，例如，长度为约4至约50个氨基酸，长度为约6至约30个氨基酸，或者长度为约10至约20个氨基酸)。在一些实施方案中，该片段具有预期或预测的过敏原消化产物的序列。在一个实施方案中，内标由多种花生过敏原肽组成，每种花生过敏原肽在c-末端用重同位素标记。例如，示例性内标可包括arah1肽的两种或更多种同位素标记的片段、arah2肽的两种或更多种同位素标记的片段、arah3肽的两种或更多种同位素标记的片段和arah6肽的两种或更多种同位素标记的片段的任何组合。在一个实施方案中，用胰蛋白酶消化包含花生抗原的组合物，将包含13c和/或15n标记的花生过敏原肽的标准混合物加入到消化的混合物中，然后通过片段化测定组合物，例如，通过质谱法，比如例如lc-ms或lc-ms-ms。在某些示例性实施方案中，特征包括不含遗漏的蛋白水解切割位点的过敏原消化产物。另一方面，本发明的特征在于一种用于确定包含一种或多种花生过敏原的组合物的释放谱(releaseprofile)(例如，体外释放谱)的方法。在一个实施方案中，该方法包括在多个时间点的每一个时间点从组合物中获得一个或多个样品，消化所述一个或多个样品中存在的花生过敏原以产生过敏原消化产物，将过敏原消化产物片段化以产生肽片段，并且在所述多个时间点中的至少两个时间点检测肽片段以确定花生过敏原的释放谱。所述组合物可以是，例如，花生提取物，包含花生过敏原的治疗性组合物，溶出介质或分析样品。在一些实施方案中，所述组合物是水性介质。在一些实施方案中，所述组合物中花生过敏原的量非常低。例如，特定花生过敏原(例如，arah1，arah2，arah3或arah6)的量可低于约2μg/ml，低于约1.5μg/ml，低于约1μg/ml或低于约0.5μg/ml，例如，约0.2μg/ml，或长度为约15、16、17、18、19或20个氨基酸。在一些实施方案中，将取自组合物的样品中的过敏原消化以产生长度在约4个氨基酸至约50个氨基酸之间，长度在约6个氨基酸至约30个氨基酸之间，或长度在约15个氨基酸至约20个氨基酸之间的过敏原消化产物。消化后获得的过敏原消化产物的格局(pattern)创造出样品的肽特征。在一些实施方案中，片段化过敏原消化产物和检测肽片段的步骤包括分离方法和肽检测方法中的一种或多种。例如，在一些实施方案中，检测和鉴定肽片段的步骤包括进行诸如lc-ms-ms、纳米-lc-ms-ms、hplc-ms-ms或nanohplc-ms-ms等的方法。在一些实施方案中，肽特征包括来自花生蛋白arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9、arah10、arah11、arah12和arah13中的一种或多种的片段的集合。在一些实施方案中，肽特征包括一种或多种具有选自seqidno:17、seqidno:70、seqidno:177、seqidno:155、seqidno:93和seqidno:40的氨基酸序列的arah1过敏原消化产物。在一些实施方案中，所述肽特征包含来自arah1、arah2和arah6的任何组合的一种或多种过敏原消化产物，或来自arah1、arah2、arah3和arah6的任何组合的一种或多种过敏原消化产物。在一些实施方案中，所述特征包含具有选自下组的氨基酸序列的一种或多种过敏原消化产物：seqidno:17、seqidno:70、seqidno:177、seqidno:197、seqidno:198、seqidno:199、seqidno:200、seqidno:201、seqidno:236和seqidno:237。在某些实施方案中，过敏原消化产物存在于花生过敏原的超过一种同种型中，比如花生过敏原的一种、两种、三种、四种或全部同种型中，比如arah1的一种、两种、三种、四种或全部同种型中。在一个实施方案中，所述过敏原消化产物在超过一种花生过敏原同种型中。在某些示例性实施方案中，将花生过敏原用一种或多种蛋白酶，如一种或多种选自由胰蛋白酶、内蛋白酶lys-c和内蛋白酶arg-c组成的组的蛋白酶。在某些实施方案中，样品，例如取自提取物或药物组合物的样品，进一步包含内标。内标通常是具有预期的或预测的过敏原消化产物的序列的肽，并且通常长度小于约50个氨基酸(如长度约4至约50个氨基酸，长度约6至约30个氨基酸，或长度约10至约20个氨基酸，或长度约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20个氨基酸)。可以将内标在采样前添加至所述组合物，和/或在酶消化步骤前添加至样品。在某些示例性实施方案中，所述内标包含一种或多种重同位素，比如，例如，13c和/或15n。在一些实施方案中，所述特征包含不含遗漏的(未切割的)蛋白水解切割位点的过敏原消化产物。在一些实施方案中，所述组合物包含包装了过敏原和/或表面结合了过敏原的颗粒。所述颗粒可以是例如纳米颗粒、微粒、膜(film)、胶囊或水凝胶。在一些实施方案中，获得一段时间内的释放谱，比如，例如，数小时的一段时间，例如，一段三个小时的时间，一段六个小时的时间，一段十二个小时的时间，或一段二十四个小时的时间。附图简述从以下结合附图对说明性实施方案的详细描述，将更全面地理解本发明的前述和其他特征和优点。图1a-1c描绘了通过胰蛋白酶消化然后进行ms-ms鉴定的高质量arah1肽(seqidno：70)。(a)描绘了序列，未切割的胰蛋白酶切割位点的数量(“遗漏”)，假发现率的百分比(fdr)，翻译后修饰位点的数量(“ptm”)，blast(basiclocal比对工具)中确认所鉴定的序列对于靶蛋白是独特的(“blast”)，搜索的数据库，以及数据库中包含所鉴定的序列的同种型的数量。(b)和(c)分别以表格形式和图形形式描绘ms-ms数据。发明详述本发明部分基于开发的灵敏分析方法，其用于测量和分析(profile)组合物(例如提取物或治疗性组合物)中存在的花生过敏原，以及用于确定包含花生过敏原的配制组合物的释放谱，例如体外释放谱。该方法包括检测样品中一种或多种过敏原的一种或多种同种型中存在的肽。在花生过敏原的多种同种型中发现的肽的鉴定提供了关于样品的定性和定量信息，其可以是批次间一致性的指标，并且可以提供存储在基质(substrate)例如纳米粒子之上或之中的抗原的释放谱。该方法特别适用于分析含有非常低量花生过敏原的组合物中的过敏原含量。如本文所用，术语“花生”，“落花生”和“落花生(arachishypogea)”可互换使用，并且是指属于豆科(leguminosae)和papillionacea亚科的豆科植物。已经鉴定了超过17种不同的花生过敏原。花生蛋白过敏原包括arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9、arah10、arah11、arah12、arah13、arah14、arah15、arah16和arah17。示例性过敏原的cdna序列的genbank登录号分别包括l34402.1(arah1)、ay007229.1(arah2.0101)、ay158467.1(arah2.0201)、af093541.1(arah3.0101)、af086821.1(arah3.0201)、af059616(arah5)、af092846.1(arah6)、af091737.1(arah7)、eu046325.1(arah7.0201)、ay328088.1(arah8.0101)、ef436550.1(arah8.0201)、eu159429.1(arah9.0101)和eu161278.1(arah9.0201)、ay722694.2(arah10.0101)、ay722695.1(arah10.0201)、dq097716.1(arah11)、ey396089.1(arah12)、ey396019.1(arah13)、aak13449(arah14.0101)、aak13450(arah14.0102)、aat11925(arah14.0103)、aau21501(arah15.0101)(参见，例如，leon等，thepeanutallergyepidemic:allergenmolecularcharacterizationandprospectsforspecifictherapy.expertrev.mol.med.vol.9,issue1,january2007；还参见arkwright等，igesensitizationtothenonspecificlipid-transferproteinarah9andpeanut-associatedbronchospasm,biomedresearchinternational,vol.2013,articleid746507；参见url地址allergen.org/search.php？allergensource＝arachis+hypogaea)。在一示例性实施方案中，样品中过敏原消化产物的特征通过如下获得，消化样品中存在的花生过敏原以产生过敏原消化产物，将过敏原消化产物片段化以产生肽片段，并检测和鉴定肽片段以获得过敏原消化产物的特征。如本文所用，“过敏原消化产物”是指存在于消化的提取物或样品中的花生过敏原，例如，使用酶(例如，胰蛋白酶，内蛋白酶lys-c，内蛋白酶arg-c等)消化，以产生小于完整过敏原的产物。术语“过敏原消化产物”还指如果花生过敏原被酶消化时将产生的肽的氨基酸序列。如本文所用，“过敏原”是指除了抗体的其他同型之外还引发ige的产生的抗原(例如，花生肽抗原)亚组。术语“过敏原”、“天然过敏原”和“野生型过敏原”可互换使用。如本文所用，“抗原”是指在动物中引发抗体应答(即体液应答)和/或与t细胞的抗原特异性反应(即，细胞反应)产生的分子(例如，花生肽)。适合于消化花生过敏原以产生过敏原消化产物的酶，特别是蛋白酶的非限定性实例包括，但不限于胰蛋白酶、内蛋白酶glu-c、内蛋白酶asp-n、胰凝乳蛋白酶、内蛋白酶lys-c和内蛋白酶arg-c、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶k、菠萝蛋白酶、巯基特异性蛋白酶(无花果蛋白酶)等。如本文所用，“肽片段”或“气相肽片段”是指过敏原的小于完整的天然过敏原的任何部分或局部(portion)，其通过不利用酶的片段化方法产生。通常，在气相中例如在质谱仪步骤中引入片段化条件。在某些示例性实施方案中，肽片段长度小于50个氨基酸，例如，长度为约2至约50个氨基酸，长度为约6至约30个氨基酸，或者长度为约15至约20个氨基酸或这些范围内的任何值或子范围。在某些示例性实施方案中，肽片段长度为约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48或约49个氨基酸。在某些示例性实施方案中，通过片段化过敏原消化产物，然后使用分离过程和肽鉴定方法产生肽片段，所述肽鉴定方法例如液相色谱-串联质谱(lc-ms-ms)，纳米-lc-ms-ms，高效液相色谱-串联ms(hplc-ms-ms)，nanohplc-ms-ms，超高性能串联ms(uplc-ms-ms)，nanouplc-ms-ms和超高性能串联ms(uhplc-ms-ms)，nanouhplc-ms-ms等。根据某些示例性实施方案，本文描述的方法还包括使用质量分析器对过敏原消化产物和/或肽片段进行质量分析。质量分析仪通常包括三重四极杆质量分析仪。根据其他实施例，质量分析仪可包括选自下组的质量分析仪：(i)三重四极杆质谱仪，(ii)轨道阱，例如傅里叶变换轨道阱，例如orbitrapelitetm(thermoscientific)；(iii)傅立叶变换(“ft”)质量分析仪；(ii)傅立叶变换离子回旋共振(“fticr”)质量分析仪；(iii)飞行时间(“tof”)质量分析仪；(iv)正交加速飞行时间(“oatof”)质量分析仪；(v)轴向加速飞行时间质量分析仪；(vi)磁扇区质谱仪；(vii)paul或3d四极杆质量分析仪；(viii)2d或线性四极杆质量分析仪；(ix)penning阱质量分析仪；(x)离子阱质量分析仪；和(xiii)静电傅里叶变换质谱仪。在某些示例性实施方案中，本文所述的方法利用分离方法，例如色谱，例如液相色谱。根据一个实施方案，通过以下方式对过敏原消化产物进行片段化和/或检测和鉴定肽片段：(i)高效液相色谱(“hplc”)，(ii)阴离子交换，(iii)阴离子交换色谱；(iv)阳离子交换；(v)阳离子交换色谱；(vi)离子对反相色谱；(vii)色谱；(viii)单向电泳；(ix)多维电泳；(x)尺寸排阻；(xi)亲和力；(xii)反相色谱；(xiii)毛细管电泳色谱(“cec”)；(xiv)电泳；(xv)离子迁移率分离；(xvi)场不对称离子迁移分离或光谱法(“faims”)；(xvii)毛细管电泳；和(xviii)超临界流体色谱。根据某些示例性实施方案，该方法还包括在待分析的样品中电离过敏原消化产物和/或肽片段。离子源可包括连续离子源。根据一个实施方案，离子源可以选自下组：(i)电喷雾离子化(“esi”)离子源；(ii)基质辅助激光解吸电离(“maldi”)离子源；(iii)硅上的解吸电离(desorptionionizationonsilicon)(“dios”)离子源；和(iv)解吸电喷雾电离(“desi”)离子源。本文描述的花生过敏原特征通常通过测量由肽前体离子、一种或多种片段离子和保留时间组成的多反应监测(mrm)转变(transition)来确定。例如，在三重四极杆仪器上进行该测量。也可以通过完整肽的保留时间和准确高分辨率质谱分析的组合来获得特征。这些定量方法通常需要标记的内标和外部合成肽校准曲线。在一个实施方案中，通过纳米-lc/ms/ms(nlc-ms-ms)分析获得特征，其中尽可能多的肽被片段化并通过数据库分析和nlc/ms/ms数据集鉴定，所述数据集由保留时间和质量/电荷值和强度组成，对其进行测量和比较以确定全局蛋白质组的变化。在某些示例性实施方案中，使用内标，所述内标包括来自蛋白质过敏原的两种或多种过敏原消化产物的组合，如来自arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9、arah10、arah11、arah12、arah13、arah14、arah15、arah16和arah17中的一种或多种。内标通常具有已知的肽序列并以已知量提供。在一些实施方案中，内标包括来自花生过敏原的arah1、arah2和arah6的过敏原消化产物的组合。在其他实施方案中，使用内标，所述内标包括来自arah1，arah2，arah3和arah6的过敏原消化产物的组合。在某些示例性实施方案中，样品可包括一种或多种内标，所述内标包含表19-23中列出的过敏原消化产物中的一种或任何组合。在一些实施方案中，标准品被标记，例如用一种或多种重同位素标记，例如13c或15n。在某些实施方案中，选择用于表征组合物的过敏原消化产物独特地代表花生过敏原或花生过敏原同种型家族，并且存在于其所衍生自的过敏原的大多数或所有同种型中，使其能够用于特异性定量感兴趣的过敏原，例如花生过敏原。因此，在某些示例性实施方案中，生成过敏原消化产物的特征。如本文所用，“特征”或“过敏特征”是指存在特定组合和量的特定花生过敏原消化产物(例如，arah1、arah2、arah6和/或arah3过敏原消化产物)。在某些示例性实施方案中，特征包括5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23，24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多不同的过敏原消化产物，每种不同的产物具有独特的序列。用于花生过敏原特征的肽的选择可以基于同种型的鉴定，所述同种型包括通过消化和片段化步骤鉴定的肽。各种序列数据库可用于鉴定花生过敏原同种型的序列，包括uniprot(在线为uniprot.org，并且其包括swiss-prot和trembl数据库)，allergennomenclature(过敏原命名)上的数据库(在线为allergen.org)，genbank(在线为ncbi.nlm.nih.gov)，genecards(在线为genecards.org)，ensembl(在线为ensemble.org)等。任何序列比对算法可用于鉴定同种型，所述同种型包括在消化和片段化包含花生过敏原的样品后鉴定的肽。示例性的序列比对算法包括blast(在线为blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)，clustalomega(在线为ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo)等。花生过敏原分析方法可用于各种目的。例如，本文描述的方法可用于在含花生的组合物中进行批次间重现性评估。本文所述的方法还可用于测量花生过敏原从容器或基质的表面或内部的释放或泄漏，例如来自珠或颗粒(例如，纳米颗粒或微粒)，胶囊，膜或条带(例如，用于组合物的舌下施用)，或凝胶(例如水凝胶)。在一些实施方案中，肽特征包括包含一个或多个免疫原性表位或一种或多种花生过敏原的一个或多个免疫显性表位的肽。包含免疫原性表位或免疫显性表位的肽特征可以为包含花生过敏原的组合物的免疫原性提供标准。如在本文中使用，“样品”是指含有花生过敏原的任何组合物。示例性样品包括但不限于含花生的提取物，含花生的粉末，包含一种或多种花生过敏原的分析样品、药物组合物(例如，治疗性疫苗)、溶出或释放介质等。在典型的实施方案中，样品会是水性的。用于本发明特征性的过敏原分析方法的样品可以是花生提取物，例如由全烤花生或生花生(wholeroastedorrawpeanuts)或由花生粉制成的提取物。该提取物可用于药物组合物中，例如用于治疗或预防花生过敏。所述提取物可以用在用于口服免疫疗法(oit)或舌下免疫疗法(slit)的组合物中，或用在用于纳米颗粒组合物的组合物中，与或不与佐剂一起。通过评估花生提取物的花生过敏原特征，可以监测批次间的一致性。花生过敏原特征也可用作推断提取物的免疫原性的因素，因为预期具有相似特征的提取物具有相似的免疫原性。在一些实施方案中，组合物中花生过敏原的量非常低。例如，特定花生过敏原(例如，arah1、arah2、arah3和/或arah6)的量可以低于约2μg/ml、低于约1.5μg/ml、低于约1μg/ml或低于约0.5μg/ml，例如约0.2μg/ml。花生蛋白提取物可以通过本领域已知的方法制备，包括脱脂和/或过滤方法，以产生花生过敏原制剂。用于本文所述过敏原分析方法的样品可以是治疗性组合物，例如用于口服，舌下，粘膜，皮内，皮下，静脉内，肌肉内，肠胃外或通过吸入施用的液体制剂。在一些实施方案中，治疗性组合物会是膜或条带的形式。在通过本文所述的过敏原分析方法分析之前，样品可包括溶解在缓冲液中的一片膜。在其他实施方案中，样品会包括基质，例如纳米颗粒，胶囊，膜或片剂，或凝胶，例如水凝胶。本文所述的过敏原分析方法可用于测定花生过敏原从基质中的释放，比如，例如，从纳米颗粒或胶囊，或从膜或水凝胶中的释放。释放可以来自基质例如颗粒的内部，或来自基质的外部(例如，表面)。在一个实施方案中，通过进行花生过敏原的完全释放，然后对控制释放进行测定，例如在一段时间内或在不同的培养物中或溶液条件下(例如，在不同的温度，ph或类似)，由此来测定释放谱。控制释放测定中释放的过敏原的量通常报告为与在完全释放条件下释放的过敏原的量相比的分数或百分比。在某些示例性实施方案中，在特定时间点获得的两个或更多个特征可用于确定含有基质的样品(例如，水性样品，例如，溶出或释放介质)中花生过敏原的体外释放谱。可以在数小时、数天或数周的时间内确定体外释放曲线。在某些示例性实施方案中，释放谱在约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或约24小时的一段时间内获得。在某些示例性实施方案中，释放谱在约1、2、3、4、5、6或约7天的一段时间内获得。在某些示例性实施方案中，释放谱在约一周、约两周、约三周、约四周、约五周、约六周、约七周或约八周的一段时间内获得。在某些示例性实施方案中，在特定的一段时间内获得2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个特征。例如，花生过敏原的释放爆发(burst)可以在最初24小时内以均匀间隔的时间点进行评估，并有足够的数据来确定爆发动力学，然后从样本中释放剩余量的相同过敏原，以帮助评估整体产品组合物表现。释放谱可包括从基质释放的过敏原类型和/或释放的过敏原的相对量。在一个实施方案中，本文所述的方法通过检测在测定开始附近的溶出或释放介质中的肽的爆发，指示过敏原从基质(例如纳米颗粒)表面的释放。如果过敏原存在于基质内部，则随着时间的推移对过敏原的检测将根据释放速率更加平缓。同时存在于基质表面上并包封在基质内的过敏原可以通过在测定开始附近的溶出或释放介质中的肽检测的初始爆发来鉴定，因为来自表面的抗原从基质释放，接下来随着过敏原从基质内部释放(例如，泄漏)，溶出或释放介质中的肽检测更加渐进的增加。如本文所用，“溶出介质”和“释放介质”是指用于提供体外药物释放信息的组合物。溶出或释放介质可用于例如样品的质量控制测试，以测定样品中过敏原的释放和/或稳定性。在选择合适的溶出或释放介质时，确定过敏原的分析目标谱(例如，延迟释放，恒定释放，延长释放等)和/或过敏原溶解度曲线是有用的。有关溶出介质选择的综述，参见martin和gray(2011年夏季)journalofvalidationtechnology。如本文所用，“释放速率”是指包埋的花生过敏原物质在体外释放试验中从组合物流出并流入周围介质的速率。在一个示例性实施方案中，首先通过将组合物置于合适的体外释放介质中来制备组合物用于释放测试。这通常通过在离心后更换缓冲液以沉淀基质(例如，合成纳米载体)，并使用温和条件重构基质来进行。在某些实施方案中，通过将样品置于37℃的适当温度控制装置中开始测定。通常在不同时间点取出样品。如本文所用，“释放谱”是指随着时间的推移从基质或容器释放的蛋白质和/或肽例如花生过敏原的类型，并且还可以包括基质或容器之中或之上的每个特定蛋白质、肽和/或过敏原释放的速率。“表现出ph敏感型解离”是指两个实体(例如花生过敏原和基质例如载体分子)之间的偶联由于将所述两个实体暴露于环境ph的变化而被显著减少或消除。在某些实施方案中，相关的ph敏感型解离可以满足本文提供的任何关系或其组合。在某些示例性实施方案中，药物组合物包含纳米载体和/或微载体，例如合成纳米载体和/或合成微载体。如本文所用，“合成纳米载体”或“合成微载体”是指具有至少一个尺寸小于或等于5微米的维度的离散物体。在一些实施方案中，在一个或多个要比较的组合物中在一种或多种花生过敏原之间，例如在跨越不同时间点的一段时间内来自组合物的取样中，或在不同时间和/或通过不同方法制备的不同批次之间比较质量平衡。比较数据可以表示为相对定量，并且通常表示为分数或百分比。含有花生过敏原的药物组合物通常可以与载体、赋形剂和提供合适的转移、递送、耐受等的其他试剂一起配制。示例性制剂包括例如粉末，糊剂，软膏，凝胶(jellies)，蜡，油，脂质，含有脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(例如lipofectintm)，无水吸收膏，水包油和油包水乳剂，乳剂carbowax(各种分子量的聚乙二醇)，半固体凝胶和含有carbowax的半固体混合物。另见powell等人的“compendiumofexcipientsforparenteralformulations”pda(1998)j.pharmsci.technol.52:238-311。“药学上可接受的赋形剂”是指添加到组合物(例如治疗性组合物)中以进一步促进组合物的施用的药理学上无活性的物质。药学上可接受的赋形剂包括但不限于碳酸钙，磷酸钙，各种稀释剂，各种糖和淀粉类型，纤维素衍生物，明胶，植物油，聚乙二醇等。“剂量形式”是指适于向受试者施用的介质、载体、载剂或装置中的药物(例如，一种或多种花生过敏原)。“有效量”是指对某种目的有效的量。例如，当有效量用于治疗目的时，有效量是治疗、减轻、改善、缓解本文提供的疾病、病症和/或状况例如花生过敏的一种或多种症状或特征、延迟其发作、抑制其进展、降低其严重性和/或降低其发生率的量。“受试者”是指动物，包括哺乳动物例如人和非人灵长类动物；禽类；驯养家畜或农场动物例如猫，狗，绵羊，山羊，牛，马和猪；实验室动物例如小鼠，大鼠和豚鼠；鱼；等等。如本文所用，“疫苗”是指改善对特定疾病或病症的免疫应答的物质组合物。疫苗通常含有刺激受试者免疫系统将特定抗原(例如，花生抗原)识别为外来物并将其从受试者体内消除的因子。疫苗还建立免疫“记忆”，如果受试者再次受到攻击，抗原将被快速识别并对其作出反应。疫苗可以是预防性的(例如以防止未来任何病原体感染)或治疗性(例如针对花生抗原的疫苗用于治疗花生过敏)。“施用”或“给药”是指以药理学上有用的方式向受试者提供药物。如本文所用，“表位”是指包含约6至15个氨基酸的氨基酸基序的结合位点，当与主要组织相容性复合物(mhc)一起通过apc呈递时可被免疫球蛋白(例如，ige、igg等)结合或被t细胞受体识别。线性表位是其中在简单线性序列的背景下识别氨基酸的表位。构象表位是其中在特定三维结构的背景下识别氨基酸的表位。通过本发明特征的方法鉴定的花生过敏原特征可包含一个或多个花生表位。免疫原性表位可在体内引起免疫应答，例如过敏反应。如本文所用，“免疫显性表位”是指在大部分致敏群体中抗体结合的表位，或抗体效价高的地方的表位，其为相对于与相同抗原中存在的其他表位的抗体反应的百分比或效价。在一个实施方案中，免疫显性表位在敏感群体的超过50％中被抗体结合，更优选超过敏感群体的60％，70％，80％，90％，95％或99％。通过本发明表征的方法鉴定的花生过敏原特征通常包含一个或多个花生免疫显性表位。对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本文公开的实施方案的范围的情况下，可以使用合适的等同物进行本文所述方法的其他合适的修改和改编形式。现在已经详细描述了某些实施方案，通过参考以下实施例将更清楚地理解这些实施方案，所述实施例仅出于说明的目的而包括在此，而不是限制性的。实施例1花生过敏原特征下面描述用于相对定量四种花生过敏原arah1、arah2、arah3和arah6的方法的开发和最初的初步验证。该方法利用与串联质谱联用的液相色谱，并且基于对来自这些蛋白质中的每一种的代表性胰蛋白酶肽的测量。在每种情况下选择肽以包括大多数报道的过敏原蛋白同种型。分析方法取决于复杂蛋白质混合物中目标蛋白质的消化重现性和消化效率。并非所有蛋白水解肽都是用于定量的良好候选者，而良好的电离效率和一致的胰蛋白酶切割以及具有翻译后修饰的肽的低概率是选择过程的重要方面，例如来自复杂消化中的其他肽的干扰和其他矩阵效应(matrixeffect)等问题更难以预测。一旦选择，就获得一系列重同位素标记的肽和所选肽的非标记合成形式，并分别用作内标和缓冲校准曲线。将由轻度焙烤的花生粉(goldenpeanutandtreenuts,alpharetta,ga)制备的花生提取物用胰蛋白酶一式四份消化，然后将标准品加入到消化的样品中。该标准品含有两种arah1肽、两种arah2肽、两种arah3肽和两种arah6肽。内标中的肽用13c和15n中的一种或两种标记。内标的序列在下表1和2中提供。表1.用于内标的未标记的合成“轻”肽肽序列肽化学式dlafpgsgeqvekara_l1-1c60h93n15o22gtgnlelvavrara_l1-2c48h85n15o16gagssqhqerara_l2-1c40h65n17o17qqeqqfkara_l2-2c40h62n12o14rpfysnapqeifiqqgrara_l3-1c93h139n27o26ahvqvvdsngnrara_l3-2c52h86n20o19imgeqeqydsydirara_l6-1c74h111n19o28s1qmvqqfkara_l6-2c40h65n11o11s1表2.用于内标的标记的合成“重”肽k*和r*是重同位素标记的氨基酸，其中碳-12已被碳-13取代，且氮-14被氮-15取代，得到13c615n2用于赖氨酸，13c615n4用于精氨酸值得注意的是，可以选择另外的肽，并且蛋白质的特定特征使得难以实现所有肽的所有期望特征。例如，用于arah6的两种肽含有甲硫氨酸，这是不理想的但很难避免，因为arah6含有异常高含量的含硫氨基酸。类似地，arah3含有已被发现的稳定的n-末端“遗漏的”切割位点。通常，彼此非常接近的胰蛋白酶切割位点会导致其中一个位点的优先切割，而不是两个。内标用于定量消化产物。产生合成的未标记特征肽的缓冲液校准曲线，其中将重同位素标记的内标添加到花生提取物消化物和校准曲线中。使用内标和校准曲线进行相对定量以确定花生提取物消化物中特征肽的相对量。通过nanohplc-ms-ms气相片段化(orbitrapelitetm,thermoscientific)分析含有消化的测试过敏原和标准品的样品。使用top-15方法，对一个样品(总共四个样品)进行三次分析，并对其余三个样品进行一次分析，以生成总共六个数据文件。通过proteomediscoverertm软件(thermoscientific)分析这些数据文件。应用top-15方法鉴定最丰富的蛋白质确保了在整个数据集中以一致的方式鉴定高电离化和片段化效率的肽。使用uniprot.org上的uniprot序列数据库确定所得片段的身份。从花生粉样品中检测到全部已知花生过敏原中的90％以上，包括arah1、arah2、arah3、arah5、arah6、arah7、arah8、arah10、arah11、arah14、arah15和arah凝集素。对已鉴定的过敏原的调查在下表3-18中说明。arah1、arah2、arah3和arah6代表主要花生过敏原。表3.花生粉中检测到的arah1同种型表4.花生粉中检测的arah2同种型表5.花生粉中检测的arah3同种型表6.花生粉中检测的arah5同种型表7.花生粉中检测的arah6同种型表8.花生粉中检测的arah7同种型表9.花生粉中检测的arah8同种型表10.花生粉中检测的arah9同种型表11.花生粉中检测的arah10同种型表12.花生粉中检测的arah11同种型表13.花生粉中检测的arah12同种型表14.花生粉中检测的arah13同种型表15.花生粉中检测的arah14同种型表16.花生粉中检测的arah15同种型表17.花生粉中鉴定的arah凝集素同种型表18.花生粉中鉴定的arah假设性同种型鉴定主要过敏原的肽以形成肽的集合，将其用作组合物中花生过敏原含量的指示剂(例如，“花生肽特征”)。理想的肽特征使用代表完全切割的真胰蛋白酶消化产物的肽(可能的例外是含有连续精氨酸和/或赖氨酸残基的肽)，其中一个或另一个切割位点通常优先被切割。选择的肽通常还具有序列保守性，其假发现率(fdr)小于1％，并且在多种同种型间具有序列保守性。此外，所选择的肽通常不具有或具有最少的翻译后修饰，包括氧化和糖基化，并且基于串联质谱(ms-ms)的手动测定(curation)具有高检测质量。同种型由遗传变异表示，包括由截短或缺失的序列产生的肽。通过ms-ms鉴定的高质量肽的实例是图1a至1c中所示的arah1肽。例如，通过比较uniprot数据库记录中的序列变异确定了arah1k异质性。由uniprot参考号p43238鉴定的示例性arah1过敏原消化产物示于表19中。还比较了来自其他uniprotarah1记录的序列(参见表20)。选择优选的arah1过敏原消化产物，其基于如下各项在花生过敏原特征中是有用的：1)优先为零遗漏的胰蛋白酶切割位点；2)存在于所有序列中，假发现率(fdr)小于1％；3)没有或具有最少的翻译后修饰位点；4)通过串联质谱(ms-ms)数据的手动测定确定的高质量片段；5)通过blast搜索指示该序列在花生蛋白质组内是独特的；和6)序列存在最大数量的同种型。所得到的过敏原消化产物的最初列表被确定为分析花生粉提取物中花生抗原的最有用的候选者，如表20-23所示，分别代表来自arah1、arah2、arah3和arah6的花生过敏原。表19.来自uniprotref.p43238的arah1过敏原消化产物表20.制备的花生提取物中鉴定的arah1序列表21.制备的花生提取物中鉴定的arah2序列表22.制备的花生提取物中鉴定的arah3序列表23.制备的花生提取物中鉴定的arah6序列等同内容在不脱离本发明的精神或基本特征的情况下，本公开可以以其他特定形式实施。因此，前述实施例在所有方面都应被视为说明性的而非限制本公开。因此，本公开的范围由所附权利要求而不是由前面的描述表明，因此，在权利要求的等同内容的含义和范围内的所有变化都意图包含在本文中。当前第1页12