免疫色谱法检查装置的试样添加部的形成方法及免疫色谱法检查装置与流程

本发明涉及免疫色谱法检查装置的试样添加部的形成方法、及具有通过该方法形成的试样添加部的免疫色谱法检查装置。

背景技术

近年来，开发出简易检查试剂、试剂盒，其在短时间中进行病毒、细菌等的病原体感染的有无、妊娠的有无等各种检查。病原体构成成分、人绒毛膜促性腺激素等是检测或定量的对象。简易检查试剂中的多数具有无需特别的设备、操作也简单和便宜的特征，例如，用于妊娠诊断的简易检查试剂在一般的药店有售。另外，与其它检查试剂不同，检查病原体的感染的简易检查试剂除了大医院、医疗检查中心以外也广泛用于一般的医院、诊所。这些设施常常是患者最初拜访的医疗机构，如果当场对于从患者采取的样本判明感染的有无，则能够在早期施加治疗措施，因此，简易检查试剂在医疗中的重要性日益增加。

现在，作为简易检查方法，利用抗原抗体反应的免疫测定法、特别是免疫色谱法是一般已知的。对于免疫色谱法，在膜上形成与被检测物特异性结合的捕获体(捕获物质)、以及与被检测物特异性结合的标记体的复合体，对标记进行检测/定量，从而进行被检测物的检测（测定或定量）。免疫色谱法的测定装置简单，另外在成本方面也是优异的，因此广泛用于检测多种多样的被检测物。

在免疫色谱法的一个方式中，在具备将与被检测物特异性结合的抗体作为捕获物质固定在硝化纤维素等膜条(membranestrip)上的检测部、及含有与被检测物特异性结合的标记体的标记体部的检查装置中，滴加含有被检测物的样本试样，被检测物-标记体的复合体边形成边展开且在检测部捕获该复合体，从而对标记进行检测或定量（例如，专利文献1及专利文献2）。

近年来，开发了通过在免疫色谱法检查装置的试样添加部使试剂预先浸渍，在试样添加部上预处理样本试样的技术。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：特开2008-268043号公报

专利文献2：特开2008-203135号公报。

发明概述

发明要解决的课题

但是，在试样添加部浸渍的试剂由于干燥不均匀（ムラ）等原因在试样添加部内产生浓度差。其结果是，在试样添加部添加样本试样时，有时浸渍的试剂与样本不良好地混合，样本试样不在膜上流畅地展开。存在下列问题：样本试样不在膜上快速展开从而测定速度变慢，样本试样在膜上滞留从而背景变高。

因此，本发明的目的是提供免疫色谱法检查装置及其试样添加部的形成方法，所述装置改善前述问题、并且可比以前的测定方法更迅速且高灵敏度地检测被检测物的存在或定量被检测物。

用于解决课题的手段

本发明人进行深入研究，结果发现，在应用硝化纤维素膜等多孔性基材的免疫色谱法中，通过应用具备试样添加部中浸渍的试剂的复原性被改良的试样添加部的检查装置，可迅速且高灵敏度地测定，从而完成本发明。

也即，本发明提供下列。

(1)免疫色谱法检查装置的试样添加部的形成方法，其包括向试样添加部施加在正常状态为白色粉末状的表面活性剂并使其干燥。

(2)(1)记载的方法，其中前述表面活性剂是分子量为200～900的阴离子性、非离子性或两性表面活性剂。

(3)(1)记载的方法，其中前述表面活性剂是选自脱氧胆酸及其盐和胆酸及其盐的至少一种。

(4)(3)记载的方法，其中前述表面活性剂是脱氧胆酸钠。

(5)免疫色谱法检查装置，其包含通过(1)～(4)中任一项记载的方法形成的试样添加部。

发明的效果

通过应用具备应用本发明的方法形成的试样添加部的检查装置，样本试样与在试样添加部浸渍的试剂良好地混合，样本试样在膜上快速展开，因此可以背景低、假阳性少、迅速且高灵敏度地测定。

附图简述

[图1]本发明的一个实施方式的检查装置的顶视图和截面图。

[图2]显示下述实施例及比较例中得到的，取决于试样添加部中表面活性剂的有无、红色色素的展开性的差异的图。

[图3]显示下述实施例及比较例中得到的，取决于试样添加部中表面活性剂的有无、试样添加部的红色色素的色残余的差异的图。

[图4]显示下述实施例及比较例中得到的，取决于试样添加部中表面活性剂的有无、免疫测定结果的再现性的差异的图。

用于实施发明的方式

本发明中的试样添加部是免疫色谱法检查装置中添加样本试样的部位。试样添加部是通过将垫放置在构成装置本体的硝化纤维素膜等多孔性基材上而形成的，所述垫由具有吸水性的材质例如海绵、玻璃纤维等无纺布等的多孔性基材组成。在应用垫的情况下，可以将该垫称为试样添加垫。另外，可不使试样添加部为垫状，将构成装置本体的硝化纤维素膜等多孔性基材的一部分区域作为试样添加部。优选试样添加部设置在试验片上的一端。

可对试样添加部预先施加抗原抗体反应所必需的试剂。例如，也可以样本试样中的非特异性成分不涉及抗原抗体反应的方式施加表面活性剂、在测定血液样本时施加溶血剂。免疫色谱法常常在使样本试样预先浮遊于浮遊液中之后添加于试样添加部，在该情况下，样本试样被稀释从而被检测物也被同时稀释，妨碍了检测灵敏度。因此，也可以预先施加作为样本浮遊液的成分的缓冲剂、表面活性剂、各种蛋白、盐类、糖类。

对于本发明的方法，向试样添加部施加在正常状态为白色粉末状的表面活性剂是必要的。本发明人等进行深入研究，结果发现，通过这一点，在免疫色谱法中，样本试样在膜上快速展开，可以高灵敏度地检测被检测物，从而完成本发明。此外，“在正常状态为白色粉末状”意味着，该表面活性剂在常温（25℃）、常压(1atm)下单独存在的情况下是白色粉末状。在应用作为除此之外的表面活性剂的液状、糊状或蜡状的表面活性剂的情况下，干燥不充分，且试样添加部的稳定性存在问题，试样添加时的迅速浸透效果不充分，不适于本发明。表面活性剂通常溶解于水性介质并施加于多孔性基材，因此优选水溶性优异的物质。另外，在白色粉末状的表面活性剂中，在水溶性、稳定性优异和获得本发明的效果方面，优选分子量200～900的表面活性剂。

作为这种在正常状态为白色粉末状、水溶性优异的表面活性剂，列举以下物质。这些表面活性剂可以单独应用，也可以组合两种以上应用。

胆酸钠、

脱氧胆酸钠、

月桂基硫酸钠、

蔗糖单胆酸酯(スクロースモノコレート)、

β-d-吡喃果糖基-α-d-吡喃葡萄糖苷单十二酸酯、

β-d-吡喃果糖基-α-d-吡喃葡萄糖苷单癸酸酯、

正辛酰基-n-甲基葡糖酰胺(n-オクタノイル-n-メチルグルカミド)、

正壬酰基-n-甲基葡糖酰胺、

正癸酰基-n-甲基葡糖酰胺、

正辛基-β-d-硫代吡喃葡萄糖苷、

正辛基-β-d-吡喃麦芽糖苷、

正辛基-β-d-吡喃葡萄糖苷、

正壬基-β-d-硫代吡喃麦芽糖苷、

正十二烷基-β-d-吡喃麦芽糖苷、

正癸基-β-d-吡喃麦芽糖苷、

n,n-双(3-d-葡糖酰胺丙基)胆酰胺(n,n-ビス(3-d-グルコンアミドプロピル)コラミド)、

n,n-双(3-d-葡糖酰胺丙基)脱氧胆酰胺、

3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸(3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホン酸)、

3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-2-羟基丙磺酸、

zwittergent3-10detergent(商品名)，カルビオケム制、

zwittergent3-12detergent(商品名)，カルビオケム制、

zwittergent3-14detergent(商品名)，カルビオケム制。

在这些表面活性剂中，优选选自作为阴离子性的脱氧胆酸及其盐和胆酸及其盐的至少一种，特别地，胆酸钠、脱氧胆酸钠的水溶性良好、便宜，因此是更优选的。

作为向试样添加部施加上述表面活性剂的方法，优选通过浸渍、滴加等添加表面活性剂的溶液的方法，所述表面活性剂的溶液优选以水或水系缓冲液为溶剂的水溶液。在这种情况下，表面活性剂溶液中的表面活性剂的浓度通常是0.005质量％～5质量％、优选0.05质量％～2质量％。另外，表面活性剂向试样添加部的添加量通常是0.0013mg～10mg左右，优选0.005mg～4mg左右。

认为含有表面活性剂的效果是由于，将前述浮遊液施加于多孔性基材并干燥时，随着水分子的蒸发，表面活性剂作为微细结晶状态存在于试样添加部，从而样本试样无不均匀地浸透试样添加部，从而在膜上快速展开。另外，在预先向试样添加部施加抗原抗体反应所必需的试剂时，通过显著地防止抗原抗体反应所必需的试剂的干燥时的浓度不均匀、自身凝集，样本试样与抗原抗体反应所必需的试剂无不均匀地混合，从而在膜上快速展开，并且也没有自身凝集产生的背景和假阳性，能够大大提高s/n比。另外，表面活性剂在正常状态为粉末状因而可以在干燥状态保持，保存稳定性良好，也容易处理。进一步地，其为白色因而不至于妨碍通过目测判定检查结果。

应用本发明的免疫色谱法试验装置检测的被检测物、样本试样没有限制。例如，对于样本试样，可以应用咽或鼻拭子、鼻抽吸物、咽或鼻洗涤液、唾液、血清、血浆、全血、便悬浮液、尿、培养液以及用缓冲液稀释它们而成的物质、不稀释原样应用。被检测物也没有任何限定，可以是待检测的所有物质。作为具体例子，可列举流感病毒、腺病毒、rs病毒、hav、hbs、hiv、诺如病毒等病毒抗原，mrsa、a组链球菌、b组链球菌、军团菌属菌等细菌抗原，细菌等产生的毒素，支原体，沙眼衣原体，人绒毛膜促性腺激素等激素，ｃ反应蛋白、肌红蛋白、心肌肌钙蛋白、各种肿瘤标志物、农药、环境激素等抗原，进一步地，可列举针对上述细菌、病毒等的抗体。

本发明也提供包含如上述形成的样本添加部位的免疫色谱法检查装置。除了向试样添加部施加在正常状态为白色粉末状的表面活性剂这一点，检查装置的构成本身例如专利文献1及专利文献2中记载的那样可为公知的。本发明的免疫色谱法检查装置的具体例子的模式图示于图1，但本发明的检查装置不限于此。

图1的上部是顶视图，下部是截面图。对于图示的具体例子，在塑料板（6）上分别层压形成2个检测部（3）的硝化纤维素膜（1）、由滤纸形成的吸收垫部（5）、通过上述方法形成的标记体部（2）、及由玻璃纤维过滤器形成的试样添加部（4）。而且，如图所示，吸收垫部（5）的一个端部区域与硝化纤维素膜（1）的一个端部区域、硝化纤维素膜（1）的另一个端部区域与标记体部（2）的一个端部区域、标记体部（2）的另一个端部区域与试样添加部（4）的一个端部区域分别重叠，通过这一点，形成连续的横向流动的流路。

然后，对应用该检查装置的免疫测定法进行说明。首先，配制使样本在样本浮遊/提取用缓冲液中浮遊/提取的样本试样。在检查装置的试样添加部（4）滴加前述样本试样，所述检查装置为，在塑料板（6）上层压的硝化纤维素膜（1）上，具备包含用着色乳胶粒子标记与被检测物发生抗原抗体反应的抗体的、通过上述方法形成的稳定化干燥标记体垫的标记体部（2），进一步具备将与被检测物发生抗原抗体反应的抗体作为捕获物质线状固定的检测部（3）。包含被检测物的样本试样边在水平方向上在膜上移动边展开标记体，因此如果存在被检测物，则形成被检测物-标记体的复合体，进一步到达检测部（3）时在其线上形成捕获抗体-被检测物-标记体的复合体，通过该复合体中的着色乳胶粒子，检测复合体的存在，从而判定样本中被检测物的有无。此外，检测部（3）是线状固定抗体或其抗原结合片段的区域，其可与被检测物质发生抗原抗体反应、且与着色乳胶粒子上的抗体或其抗原结合片段同时结合被检测物。不涉及反应的其它成分等在吸收垫部（5）吸收。此外，对于图1所示的例子，有两个检测部（3），这是例如下述实施例记载的那样、为了分别捕获甲型流感病毒和乙型流感病毒这样的2种被检测物。通过设置多个这样的检测部（3），可同时免疫测定多种被检测物。

通过应用本发明的检查装置，可以迅速且简便地测定被检测物，所述检查装置应用乳胶粒子作为稳定化干燥标记体，所述乳胶粒子结合与被检测物发生抗原抗体反应的抗体或其抗原结合片段。

实施例

以下，基于实施例及比较例更具体地说明本发明。但本发明不限于下述实施例。

通过免疫色谱法检测流感病毒抗原

1．抗流感病毒单克隆抗体的制备

（1）抗甲型流感病毒np抗体

用甲型流感病毒抗原免疫balb/c小鼠，从饲养一定时期的小鼠摘取脾脏，通过kohler等人的方法（kohleretal.,nature,vol,256,p495-497(1975)）与小鼠骨髓瘤细胞（p3×63）融合。得到的融合细胞（杂交瘤）在37℃温育保持，边通过应用固定甲型流感病毒np抗原的板的elisa确认上清的抗体活性，边进行细胞的纯化（单克隆化）。取得的2株该细胞分别腹腔施用于降植烷处理的balb/c小鼠，约2周后，采取含抗体的腹水。通过应用蛋白a柱的亲和色谱，从得到的腹水纯化各igg，得到2种纯化抗甲型流感病毒np抗体。

（2）抗乙型流感病毒np抗体

应用乙型流感病毒抗原，用与（1）同样的方法，得到2种纯化抗乙型流感病毒np抗体。

2．标记体垫的制备

使用纯化抗甲型流感病毒np抗体及纯化抗乙型流感病毒np抗体中的分别各1种。使抗甲型流感病毒抗体与蓝色乳胶粒子共价结合，在浮遊液中悬浮，并进行超声处理，制备充分分散浮遊的抗甲型乳胶浮遊液。另外，同样地制备使抗乙型流感病毒抗体共价结合的抗乙型乳胶浮遊液。混合抗甲型乳胶浮遊液与抗乙型乳胶浮遊液，涂布于大小为20cm×1cm的玻璃纤维，在暖风下良好地干燥，制备形成了干燥混合物的标记体垫。

3．试样添加垫的制备

使用大小为2.0cm×20cm的玻璃纤维。

4．检查装置的制备

检查装置应用与图1所示物质同样构成的物质。将硝化纤维素膜裁剪为2cm×20cm大小并用带有粘合剂的塑料板作为背衬，在距下端0.6cm与1.0cm的位置涂布各20cm的成为约1mm宽的量的抗甲型流感病毒抗体（与上述不同的抗体）液、和抗乙型流感病毒抗体（与上述不同的抗体）液，在暖风下良好干燥并使抗体固定（检测部）。然后，将3cm×20cm大小的滤纸与硝化纤维素膜的上端重叠5mm，设置吸收垫部。进一步地，将标记体垫与硝化纤维素膜的下端重叠2mm，设置标记体部，进一步地，在相应于距标记体垫的上端7mm的位置重叠试样添加垫，设置试样添加部。然后，用切割工具裁剪为5mm宽的短条，制备一体化检查装置。

5．试验

实施例1及比较例1

首先，在如上述制备的检查装置的试样添加部浸渍样本展开成分（100mmtris-hcl（ph8.0），1%tween20，0.5%bsa）以及食用红色色素（浓度0.1%）（比较例1）。另外，在试样添加部浸渍其中进一步包含0.2质量%的脱氧胆酸钠(doc)的溶液（实施例1）。在试样添加部滴加作为试样的生理盐水，观察试样滴加后即刻的食用色素的释放的状态、和试验结束后的试样添加部的状态。其结果是，对于试验后即刻的色素的释放，具有含脱氧胆酸钠的试样添加部的检查装置的释放量明显多（图2）。另外，在试验结束后的试样添加部中，对于含有脱氧胆酸钠的样品，色素的色残余也少（图3）。根据以上推断，通过样本添加部中含有脱氧胆酸钠，改善样本展开成分的释放，与其相应，也改善食用色素的释放。此外，由于图是黑白的，差异可能难以知晓，但若是彩色照片，则用肉眼能够清楚地理解图2及图3中实施例1与比较例1的差异。

实施例2及比较例2

除了在试样添加部浸渍的溶液不含红色食用色素之外，与实施例1及比较例1同样地，制备具有包含上述样本展开成分与脱氧胆酸钠的试样添加部的检查装置（实施例2）、和具有仅包含样本展开成分的试样添加部的检查装置（比较例2）。对于这些的每一个，使用流感病毒乙型抗原并进行免疫色谱试验，用免疫色谱读取器（浜松フォトニクス社制）测定信号强度的变异（ばらつき）（各n=10）。

结果示于图4。如图4所示，在具有包含脱氧胆酸钠的试样添加部的检查装置（实施例2）中，信号强度的变异明显减少（图4．具有脱氧胆酸钠：cv＝7.48%，没有脱氧胆酸钠：cv=15.02%）。根据以上认为，通过应用含有脱氧胆酸钠的试样添加部，改善了样本展开成分从试样添加部的释放，且获得稳定的试验结果。