苏木素‑伊红一步染色法的制作方法

本发明涉及苏木素-伊红染色液及其染色方法，属于病理常规制片常规染色试剂及试剂的使用方法。

背景技术：

苏木素-伊红染色（简称HE染色）是病理学常规制片中最基本、最重要的染色方法，临床应用广泛。苏木素为碱性染料，能将细胞核染成蓝色；伊红为酸性染料，能将细胞质染成红色。在病理诊断、教学和科研工作中，常用HE染色对正常组织和病变组织进行形态结构观察。对于确定或鉴别病变组织、细胞中出现的某些异常物质与特殊成分，需要采用特殊染色方法、酶组织化学方法或免疫组织化学方法，这些也是在观察HE染色组织切片的基础上进行的。质量好的HE染色切片是病理医生得以做出正确诊断的关键，临床上大多数病理结果误诊误判是由于切片染色质量差造成的。

染色是生物标本制作中最重要的环节之一。将生物组织浸入染色剂内，使组织细胞的某一部分染上与其他部分不同的颜色或深度不同的颜色，产生不同的折射率，以便显微镜观察。染色后用某些特定的溶液将组织过多结合的染色剂脱去，这个过程称为分化作用，所用的溶液称为分化液。在常规HE染色中，常用1%盐酸乙醇作为分化液，酸能破坏苏木素的醌型结构，使组织与色素分离而退色。经苏木素染色后，必须用1%盐酸乙醇分化，使细胞核过多结合的苏木素染料和细胞质吸附的苏木素染料脱去，再进行伊红染色，才能保证细胞核与细胞质染色层次分明、具有对比感。苏木素在酸性条件下处于红色离子状态，呈红色；在碱性条件下处于蓝色离子状态，呈蓝色。经盐酸乙醇分化后结合苏木素染料的细胞核呈红色，需立即用水除去组织切片上的酸而中止分化，再用弱碱性液使苏木素染上的细胞核恢复蓝色，这个过程称为返蓝作用或蓝化作用。

目前常规HE染色采用的是苏木素和伊红分开染色的方法，不仅操作复杂、耗费时间长，而且需经历返蓝、分化等步骤，导致细胞核和细胞质的染色深浅程度不易掌握。例如，苏木素染液染色时间过长、分化时间过短，可导致细胞核过染，核膜、核仁等不清晰；冲洗不充分可使细胞质含有大量的苏木素染色液，导致细胞核与细胞质染色比例失调；苏木素染液染色后返蓝不足，或者切片在苏木素染色液中停留时间太短，或者分化时间过长，可导致细胞核染色不清晰；返蓝液残留过多可导致伊红拒染，使得伊红染色太淡或染色不均匀；伊红染色时间过长可导致细胞核与细胞质染色缺乏对比。

体内各种细胞，虽然大小不一、形态各异，功能也不相同，但它们的基本结构是相同的。细胞是由细胞核、细胞质和细胞膜组成。细胞核内染色质的主要成分是DNA，在DNA双螺旋结构中，两条核苷酸链上的磷酸基向外，使DNA双螺旋的外侧带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木素碱性染料以离子键或氢键结合而被染色。细胞质的主要化学成分是蛋白质，我们知道蛋白质在溶液中有两性电离现象。每一种蛋白质都存在一个pH值，可使其表面净电荷为零，该pH值即为蛋白质的等电点。当pH>等电点时，该蛋白质带负电荷；反之pH<等电点时，该蛋白质带正电荷；当pH=等电点时，该蛋白质不带电荷。由于细胞质的等电点为4.7~5.0，而胞质环境pH值为6.7~6.8，大于等电点的pH值，因此细胞质蛋白质表现为带负电荷，就可能被携带正电荷的苏木素碱性染料染色，从而造成细胞核与细胞质染色难以区分的现象。

技术实现要素：

本发明是在常规HE染色方法基础上进行改进，实现细胞核和细胞质染色一步完成，不仅能简化操作步骤、缩短操作时间，而且能解决常规HE染色中存在的细胞核和细胞质染色深浅程度不易掌握的问题。

苏木素-伊红一步法染色液是本发明的根本和核心，其特征在于：主要由苏木素（0.5~10%）、媒染剂（1~5%）、促染剂（0.1~1%）、伊红Y（0.5~10%）、防腐剂（0.01~0.1%）、氧化剂（1~2%）、蒸馏水等成份组成，可实现一步完成细胞质和细胞核的染色，染色均匀清晰、层次感强，染色质量得到保证，为临床实现快速、准确病理诊断提供了有利条件。

染色前后切片用特定pH值缓冲液冲洗是本发明实施成功的关键。特定pH值缓冲液的配制，其特征在于：由弱酸及其盐的混合溶液或弱碱及其盐的混合溶液配置的pH为3.6~4.7之间的缓冲液。因为细胞核和细胞质等电点的不同，细胞核约为3.3~3.6，细胞质约为4.7~5.0，我们将染色环境pH值调整到大于细胞核等电点而小于细胞质等电点的范围，即在3.6~4.7之间，这时恰好细胞核带负电荷与碱性染料结合，而细胞质带正电荷与酸性染料结合，从而使一步法染色液中所含的苏木素只染细胞核、伊红只染细胞质，而且细胞核和细胞质的染色能明显区分开，达到既能成功染色又可简化染色步骤的目的。

本发明可实现苏木素染色和伊红染色一步完成，省略了分化、返蓝等容易导致染色失败的步骤，其特征在于：苏木素-伊红一步染色法的操作步骤，包括：

（1）病理切片在染色前行常规脱蜡等处理，之后用特定pH值缓冲液冲洗；

（2）病理切片用苏木素-伊红一步法染色液进行染色；

（3）染色后病理切片用特定pH值缓冲液冲洗，再进行常规脱水、透明、封片等操作；（4）染色结果判断：细胞核呈蓝色，细胞质呈红色。

本发明适用于常规福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的染色，也可用于冰冻组织切片或培养细胞的染色。采用本发明处理的组织切片，细胞核呈蓝色，细胞质呈红色，二者形成鲜明对比，易于观察分析。本发明已做过人体淋巴结、子宫、胃粘膜、大肠、甲状腺等部位的病理组织切片染色，达到了标准的HE染色效果。本发明染色效果良好、结果稳定，是一种值得推广的新型HE染色方法。

本发明主要用于医院病理科、检验科及科研实验室，主要成份均为无生物活性的化学试剂，稳定性较好，可存放于室温条件。本发明适用于所有的人体和动物组织细胞制片的染色以及各级医院推广使用，为临床实现快速、准确病理诊断提供了有利条件。

附图说明

图1为常规HE染色效果图（甲状腺）。

图2为本发明的染色效果图（甲状腺）。

图3为常规HE染色效果图（子宫壁）。

图4为本发明的染色效果图（子宫壁）。

具体实施方式

现以常规福尔马林固定、石蜡包埋病理组织切片为例，将常规HE染色和本发明的操作步骤介绍如下。

常规HE染色法的操作步骤。

1、切片脱蜡至水。

①二甲苯作用2次，每次5～10min。

②无水乙醇作用2次，每次3～5min。

③95%的乙醇3～5min。

④90%的乙醇3～5min。

⑤80%的乙醇3～5min。

⑥自来水或蒸馏水冲洗1～3min。

2.、HE染色。

①改良Lillie-Mayer苏木素染色液染色1～5min。

②自来水或蒸馏水冲洗10～30s。

③1%盐酸乙醇分化2～5s。

④自来水或蒸馏水冲洗10～30s。

⑤弱碱性水(如0.2%氨水或1%碳酸锂)返蓝30～60s。

⑥自来水或蒸馏水冲洗10～30s。

⑦伊红染色液染色1～3min。

⑧自来水或蒸馏水冲洗30～60s。

3、脱水、透明、封片。

①80%乙醇10～20s。

②90%乙醇10～20s。

③95%乙醇作用2次，每次1～2min。

④无水乙醇作用2次，每次2～3min。

⑤二甲苯透明3次，每次2～3min。

⑥中性树脂封片。

4、染色结果：细胞核呈蓝色；细胞质、肌纤维、胶原纤维、甲状腺胶质等呈深浅不一的红色；角蛋白、红细胞等呈明亮的橙红色。

苏木素-伊红一步染色法的操作步骤。

1、切片脱蜡至水。

①二甲苯作用2次，每次5～10min。

②无水乙醇作用2次，每次3～5min。

③95%的乙醇3～5min。

④90%的乙醇3～5min。

⑤80%的乙醇3～5min。

⑥特定pH值缓冲液冲洗30～60s。

2、苏木素-伊红一步法染色（省略了分化、返蓝以及中间多次冲洗步骤）。

①苏木素-伊红一步法染色液染色1～5min。

②特定pH值缓冲液冲洗30～60s。

3、脱水、透明、封片（具体步骤同常规HE染色）。

4、染色结果同常规HE染色。

以上所述仅为本发明的优选实施方式。本技术领域的普通技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明原理的前提下，本发明还可作出若干变化和改进，这些变化和改进也应视为本发明的保护范围。