专利名称：：一种小分子肽及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及有机化学领域，具体涉及一种肽，特别是含5-ll个氨基酸的肽。
背景技术：
：肺癌在我国城市恶心肿瘤的发病中已居于首位，且其发病率仍呈明显上升趋势。由于肺癌常常发生胸膜转移引起胸水，因此胸水脱落细胞检查是一种常用的诊断方法，具体方法如下①临床新鲜抽取的不同原发病患者的胸水50ml，离心1000转/分钟X5分钟，留取离心细胞lml;②用吸管吸取约滴在玻璃片上，用另一个玻璃片进行刮片；③凉干后，75%酒精+甲醛固定10分钟；④苏木素染色1分钟；⑤伊红染色1分钟；⑥树胶封片。但是该方法不敏感，在大量胸水中查找癌细胞，犹如大海捞针，而且胸水中细胞成分杂，有间皮细胞、巨噬细胞等，加上癌细胞不典型，影响了该方法的确诊率。本发明人长期致力于肺癌的治疗和诊断工作，曾利用"一个珠子一个化合物"的组合化学肽库筛选得到一个可特异性识别非小细胞肺癌细胞(A549)的小分子肽cNGQGEQc，并发现该肽中，对特异性粘附A549作出主要贡献的结构是-NGXG-以及六肽长度。但是A549仅是肺癌细胞中的一种，该小分子肽能否与肺癌患者胸水中癌细胞发生特异性结合，尚不清楚。
发明内容本发明要解决的技术问题是提高胸水脱落细胞检査法诊断肺癌的确诊率。本发明解决上述技术问题的技术方案是一种小分子肽，该小分子肽的氨基酸序列为cdGIGPQc(SEQNO.l);其中，c表示D型半胱氨酸，d表示D型天冬氨酸，G表示L型甘氨酸，I表示L型异亮氨酸，P表示L型脯氨酸，Q表示L型谷氨酸。本发明小分子肽可用常规的固相合成法(LamKS，SalmonSE，HershEM，HrubyVJ，KazmierskiWM，KnappRJ.A^w"1991，15《82)制备，具体方法如下取表面具有NH2活性基团的树脂珠子，先用二甲基酰胺洗涤，然后浸泡在二甲基酰胺中使所述珠子充分肿胀，接着按照所述小分子肽的氨基酸序列依次将相应的氨基酸偶联到所述珠子上并形成肽链，最后将珠子上连接的肽洗脱即可。本发明小分子肽能与肺癌细胞特异性结合，将其连接在固相中可用于分离胸水中的肺癌细胞，有助于提高胸水脱落细胞检查法诊断非小细胞肺癌的确诊率。本发明小分子肽用于分离胸水中的非小细胞肺癌细胞的方法是将本发明小分子肽固定在载体上，然后与胸水脱落细胞在DMEM培养液中共培养12小时后收集所述的载体，再用3DMEM培养液洗涤后用胰蛋白酶分离粘附在所述小分子肽上的细胞，即可。所述的载体应是易于分离且性质稳定的固体物质，如树脂珠子。树脂珠子具有性质稳定和表面可修饰的特点，是一种非常合适的小分子肽载体；此外，树脂珠子还具有可磁化的特点，很容易利用其磁性将非小细胞肺癌细胞从胸水脱落细胞中分离出来。为了更好地实施上述方法，本发明还提供一种用于分离非小细胞肺癌细胞的树脂珠子，该树脂珠子由表面具有NH2活性基团的树脂珠子与本发明小分了肽通过-CO-NH-连接构成。本发明所述树脂珠子可采用固相合成法，按照本发明小分子肽的序列依次将相应氨基酸偶联到树脂珠子上即可。用本发明所述树脂珠子分离胸水中非小细胞肺癌细胞的方法是将本发明所述树脂珠子与胸水脱落细胞在函EM培养液中共培养12小时，然后收集所述的树脂珠子，先用DMEM培养液洗涤，再用胰蛋白酶消化分离得到非小细胞肺癌细胞。本发明磁性树脂珠子上具有对非小细胞肺癌细胞具有很高特异性的小分子肽，用于辅助胸水脱落细胞检査法诊断非小细胞肺癌，可将确诊率提高至13.51%。图1是SSCP-PCR扩增产物的电泳图，其中泳道M是marker,1是AGT突变的肺癌细胞株的PCR产物，2是GGT突变的肺癌细胞株的PCR产物，3是AGT和GGT突变的肺癌细胞株的PCR产物，4是A549标准细胞株的PCR产物，5是受检细胞的PCR产物。具体实施例方式1、利用固相合成方法制备本发明所述的树脂珠子(1)称取lg表面具有NH2活性基团的树脂珠子，用二甲基酰胺洗涤3次，然后在二甲基酰胺浸泡至珠子充分肿胀；(2)加入半胱氨酸和N，N'-二异丙基碳二亚胺，室温下反应2小时后，用DMF洗涤珠子5次，接着加入20%的哌啶，在室温下反应5min，再加入20%的DMF,反应15min，完全脱去Fmoc保护基；(3)按步骤(2)方法依次偶联天冬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺和半胱氨酸；(4)将连接完最后一个氨基酸的珠子经25%的三氟乙酸洗涤一次，蒸馏水洗涤3次，即得本发明所述的树脂珠子。2、本发明小分子肽的获得将上述方法获得的本发明所述的树脂珠子用蒸馏水洗涤，即可获得本发明小分子肽。3、用肺癌细胞A549验证珠子上小分子肽的生物活性4①抽取正常健康人血3ml，加入约1000个肺癌细胞A549，充分混合；②吸取100^1(约7500个)本发明珠子，PBS液洗涤1次，75%酒精洗涤2次，培养液DMEM洗涤1次，分别加入盛有2mlDMEM培养液的6孔培养板内；同时设无小分子肽的珠子作为对照。③吸取①中准备的细胞300pl(约100个肺癌细胞)，加入②中6孔培养板，培养箱(37GC,5%C02)中培养12h;将上述6孔培养板中珠子，集中到25ml的离心管中，收集珠子，胰蛋白酶分离粘附珠子上细胞，HE染色细胞，显微镜下显示细胞核大，染色深，符合肺癌细胞A549形态。单链构像多态性-多聚酶链反应(SSCP-PCR)技术分析珠子上粘附细胞k-ras基因突变A.采用以下两对引物扩增K-ras基因第12外显子首次PCR的引物为Pl:5'-GGCCTGCTGAAAATGACTGA-3、，P2:5'-GCACCAGTAATATGCATA-3';PCR反应体系反应液体积50nl，其中4XdNTP2pl，Taq酶l.OU，10Xbuffer2^1，引物各5Opmol/L，模板DNA(珠子上粘附细胞中提取的DNA)2^1;PCR反应条件95。Clmin55。Clmin>30个循环，72°Clmin72。C延伸10min。第二次PCR的引物P3:5'-GACTGAATATAAACTTGTGGT-3'，P3:5、-TGTTGGATCAT-ATTCGTC-3、；PCR反应体系取首次PCR反应产物lpl作为模板，其余试剂和反应液体积同上；PCR反应条件95°Clmin、55°Clmin、30个循环，72°Clmin72°C延伸10min。用2°/。的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。B.根据琼脂糖凝胶电泳检测结果，取lnl第二次PCR反应产物，加适当的蒸馏水与等体积的加样缓冲液(100%甲酰胺，0.05°/。二甲苯青，0.05%溴酚兰)混合，以已知AGT和GGT突变的肺癌细胞株及正常肺组织的扩增产物作为对照。90'C变性5min，立即置冰浴。聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压200V，常温下3h。采用银染试剂盒银染10。/。乙醇+冰乙酸+FEC固定20min，银染色10-20min，10。/。乙酸终止固定10min，冲水晾干封膜。结果如图l所示，待测标本珠子上粘附细胞出现k-ms基因突变，与对照A549细胞和标准对照一致，提示珠子上粘附的细胞为A549细胞，表明载有小分子肽的树脂珠子有粘附肺癌细胞的生物活性。4、树脂珠子上小分子肽的特异性粘附非小细胞肺癌细胞的验证(1)实验材料A549(肺腺癌)、Calu-l(肺鳞癌)、H178(肺腺鳞癌)、DMS53(小细胞肺癌)、HBE(永生化支气管上皮细胞)、MCF-7(乳腺癌)、PC3(前列腺癌)、SKOV-3(卵巢癌)、HT-29(结肠癌)、HepG2(肝癌)、HL-60(白血病)、Jurkat(淋巴瘤)、Raji(淋巴瘤)和Hs68(纤维母细胞)。(2)实验方法将上述不同种类的细胞株分别与小分子肽cdGIGPQc珠子混合，置于37'C和5%C02的培养箱中培养48小时，显微镜下随机计数100个珠子，计算每种细胞与小分子肽的结合百分率，以此评价小分子肽与细胞粘附结合的特异性。(3)结果如表1所示，本发明小分子肽与非小细胞肺癌细胞的阳性结合率明显高于其他癌细胞，尤其是与A549和Calu-l的结合率更高达95%以上，可见，本发明小分子肽可特异性结合非小细胞肺癌细胞。6表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>5、本发明小分子肽在分离患者胸水中非小细胞肺癌细胞的应用(1)实验方法对临床已确诊的肺癌病例、间皮瘤、胃癌、结肠癌、乳腺癌、肺炎和胸膜结核患者的胸水进行常规细胞学诊断和用本发明树脂珠子联合常规细胞学诊断，同时设常规细胞学诊断对照。其中，常规细胞学诊断和用本发明树脂珠子联合常规细胞学诊断方法如下①临床新鲜抽取的不同原发病患者的胸水50ml，1000转/分钟离心5分钟，在细胞培养室操净台中弃取上清液，留取离心细胞lml;②吸取200^1本发明树脂珠子，PBS液洗涤1次，75%酒精洗涤2次，培养液DMEM洗涤1次，加入600pl培养液DMEM，分别加入6孔培养板内，每孔再加入2mlDMEM;(D在6孔培养板内，每孔加入100pl步骤①中准备的细胞，轻轻摇动6孔板，使细胞和珠子混合，然后将培养板放入37t，5e/。C02的培养箱中培养12h;④将上述6孔培养板中珠子，集中到25ml的离心管中，收集树脂珠子，胰蛋白酶分离粘附树脂珠子上细胞，取5pl细胞进行涂片，苏木素染色lmin，伊红染色lmin，显微镜下观察细胞形态，并通过免疫组织化学染色(抗人CEA单克隆抗体)观察。(2)实验结果结果如表1所示，对37例肺癌病例的胸水进行了常规细胞学诊断和用本发明树脂珠子联合常规细胞学诊断，常规细胞学方法仅诊断出一例阳性，阳性检出率为2.70%，而用本发明树脂珠子联合常规细胞学方法检出了5例阳性，阳性检出率达到13.51%,阳性率提高了10.81%,可见用本发明树脂珠子辅助常规细胞学方法诊断可明显提高肺癌的确诊率。另外，从对其他疾病引起的胸水的检测结果来看，用本发明树脂珠子联合常规细胞学方法均没有出现假阳性的结果，可见本发明树脂珠子对肺癌细胞的特异性粘附能力很高。表2临床诊断例数常规细胞学+-阳性率珠子++细胞学诊断阳性率肺癌37362.70%53213.51%间皮瘤3120371607结肠癌21102乳腺癌31203肺炎30303胸膜结核908098序列表<110>南方医科大学<120>—种小分子肽及其应用<160〉5<170>PatentInversion3.3<210>1<211>8<212〉PRT<213>人工序列<400>1CysAspGlylieGlyProGinCys15<210〉2<211>20<212〉DNA<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>权利要求1、一种小分子肽，该小分子肽的氨基酸序列为cdGIGPQc；其中，c表示D型半胱氨酸，d表示D型天冬氨酸，G表示L型甘氨酸，I表示L型异亮氨酸，P表示L型脯氨酸，Q表示L型谷氨酸。2、权利要求1所述的小分子肽在分离非小细胞肺癌细胞中的应用。3、一种用于分离非小细胞肺癌细胞的树脂珠子，该树脂珠子由表面具有NH2活性基团的树脂珠子与权利要求1所述的小分子肽通过-CO-NH-连接构成。全文摘要本发明提供了一种小分子肽，其氨基酸序列为cdGIGPQc(SEQNO.1)，可采用固相合成法制备得到。该小分子肽对非小细胞肺癌细胞具有特异性粘附作用，可用于分离非小细胞肺癌细胞。本发明还提供一种树脂珠子，该树脂珠子由表面具有NH<sub>2</sub>活性基团的树脂珠子与本发明小分子肽通过-CO-NH-连接构成，对非小细胞肺癌细胞具有很高的特异性，用于辅助胸水脱落细胞检查法诊断非小细胞肺癌，可将确诊率提高至13.51％。文档编号C07K7/06GK101486754SQ200910037239公开日2009年7月22日申请日期2009年2月18日优先权日2009年2月18日发明者帆张,蔡颖谦,颖郭,郭琳琅申请人:南方医科大学