一种亚微米尺度原位表征土壤微团聚体的方法与流程

本发明是一种亚微米尺度原位表征土壤微团聚体的方法，属于土壤肥力提升和土壤有机质累积领域。

背景技术：

土壤微团聚体是土壤中的原始机械成分经凝聚，粘着，胶结形成的小于0.25mm的结构单位，是土壤各有机无机组份最活跃的部分，同时也是土壤各种物理生物化学反应过程的重要载体，因此是研究土壤肥力提升和土壤有机质累积的重要指标。土壤微团聚体由于颗粒小，无机和有机元素胶着，传统的化学提取，质谱分析等方法不可避免地会对土壤微团聚体的组成和结构造成扰动和破坏，并且缺乏原位同步可视化研究土壤微团聚体无机有机元素的能力。随着同步辐射红外光谱技术和二次纳米离子探针的发展与应用，传统的低辐射载玻片无法实现两种方法同时观察同一区域，因此如何同步应用两种方法，实现在亚微米尺度原位同时研究土壤微团聚体无机有机官能团，元素结合位点，空间分布等重要信息成为该领域亟需解决的关键技术。

技术实现要素：

发明目的：本发明的目的是提供一种无需添加化学试剂，破坏性小，操作简单的土壤微团聚体的原位表征方法，可实现亚微米尺度原位同步表征同一感兴趣区域，从而分别得到土壤微团聚体无机有机官能团，元素结合位点，空间分布等数据。

技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种亚微米尺度原位表征土壤微团聚体方法，包括以下步骤：

步骤1：采集土壤样本，自然风干；

步骤2：将步骤1采集的土壤样本进行土壤微团聚体的提取，将提取出的土壤微团聚体用超纯水包埋方法进行低温冷冻切片；

步骤3：将步骤2的土壤微团聚体切片样品放置在氮化硅薄膜窗口上，用碳胶把氮化硅窗口固定，采用扫描电子显微镜表征、同步辐射红外显微成像技术和纳米二次离子探针技术依次对上述土壤微团聚体切片样品进行分析。

进一步地，所述步骤1中自然风干的具体操作步骤是：

取回的土壤样品沿自然结构轻轻剥成10mm-12mm直径的小土块，置于阴凉通风且无阳光直射的房间内自然风干。

进一步地，所述步骤2中土壤微团聚体的提取的具体操作方法：

称取过2mm筛的风干土样10g，倒入250ml振荡瓶中，加超纯水150ml，静置浸泡24h。将盛有样品的振荡瓶在往返式震荡机上振荡2h，振荡频率为170次/min。在1000ml沉降筒上放一个实验用大漏斗，将0.25mm孔径洗筛置于漏斗上，用超纯水将震荡后的土液通过筛孔洗入沉降筒中，取10ml沉降筒中的微团聚体液体放在离心管中。

进一步地，所述步骤2中超纯水包埋方法进行低温冷冻切片的具体操作：

在-20℃的低温条件下进行包埋，然后进行低温冷冻切片，切片厚度为2-6µm。

进一步地，所述步骤3中所用的氮化硅薄膜窗口：产品型号4122SN，支持膜厚度100nm，窗格规格0.5*0.5mm²。

进一步地，所述步骤4具体包括：

4.1扫描电子显微镜表征：将氮化硅窗口放在扫描电子显微镜载物台上，选择边缘清晰的土壤微团聚体颗粒确定为感兴趣区域，保存相关数据，用于下一步实验。仪器参数设置如下：放大倍数：1000倍；加速电压：20KV；分辨率：低真空模式4.0nm。

4.2同步辐射红外显微成像技术：通过上海同步辐射光源BL01B线站进行同步辐射红外显微成像试验，然后对感兴趣区域进行光谱和成像采集，光谱和成像采集过程是通过线站同步辐射红外显微成像自带的OMNIC 9.0软件设定参数，并对数据进行获取和保存，OMNIC 9.0软件参数设置如下：波长范围：4000-400 cm^-1；狭缝大小：10µm；步长：5×5µm²；分辨率：2 cm^-1；扫描次数：128。

4.3纳米二次离子探针质谱技术：纳米二次离子探针质谱仪（型号NanoSIMS 50型）进行元素分析。然后通过离子团形式¹²C^-、¹²C ¹⁴N^-测定有机元素碳，氮，通过离子团形式⁵⁶Fe¹⁶O^-、²⁷Al¹⁶O^-测定无机元素铁、铝；通过ImageJ软件分析得到土壤微团聚体中有机无机元素的原位分布图以及相互结合位点；纳米二次离子探针质谱仪器参数设置如下：铯离子源16 keV，束离子束斑100-200nm，扫描透射厚度为15 nm，扫图状态下，停留时间是1 毫秒/像素。

有益效果：

1.采用本发明方法探究土壤微团聚体，具有破坏性小，无需添加其他化学物质，操作简单，图谱结合，数据真实准确的优点；

2.采用本发明方法探究土壤微团聚体，扫描电镜表征清晰，同步辐射光源空间分辨率高，二次纳米离子探针可视化程度高，创新应用氮化硅窗口作为载体，实现三种表征方法同时观察同一感兴趣区域；

3.采用本发明方法探究土壤微团聚体，具有能够在亚微米尺度原位同时实现观察无机有机官能团，元素结合位点，空间分布等，更好地探索和认识土壤肥力提升和土壤有机质累积机制。

附图说明

图1为发明方法的流程图。

图2为本发明的土壤微团聚体的扫描电镜和同步辐射红外显微光谱图。

通过扫描电镜首先确定感兴趣区域，白色标尺是20微米，整个感兴趣区域大小为120×90µm²（图2D）；

同步辐射红外显微光谱图依次为高岭石类粘土矿物，伊利石类粘土矿物，亲水性脂肪族碳，芳香类碳，硅氧矿物（含Si-O-Si键）以及非晶形硅氧化合物的分布和强度情况（图 2 中A,B,C,E,F,G所示），图2 H为吸收谱颜色强度刻度尺(a.u.)。

图3为本发明的土壤微团聚体的纳米二次离子质谱图（具体为图2-D中扫描电镜照片方框部分），分别原位同步表征了¹²C^-，²⁷Al¹⁶O^-，⁵⁶Fe¹⁶O^-和¹²C ¹⁴N^-离子团的空间分布情况（图3中A,B,C,D所示）。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了一种亚微米尺度原位表征土壤微团聚体方法。下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例：

发明中所使用的仪器以及测试方法：

土壤微团聚体的提取过程中所用的往返式震荡机（型号HZ-9311K，中国）需要保持170rpm匀速振荡。

用超纯水包埋方法进行低温冷冻切片中所用的低温冷冻切片机（型号Leica CM1950，德国）。氮化硅薄膜窗口（型号4122SN，美国），支持膜厚度，100nm，窗格规格，0.5*0.5mm²。

同步辐射红外显微成像技术数据的采集于上海同步辐射光源BL01B线站。

纳米二次离子探针质谱仪（型号Cameca NanoSIMS 50型，法国）。

一种亚微米尺度原位表征土壤微团聚体的方法，包括以下步骤：

（1）采集土壤样本，自然风干。本实施例中土样取自中国农科院湖南省祁阳红壤长期定位试验站，采回的土壤样品沿自然结构轻轻剥成10mm-12mm直径的小土块，置于阴凉通风且无阳光直射的房间内自然风干；

（2）进行土壤微团聚体的提取，将提取出的土壤微团聚体用超纯水包埋进行低温冷冻切片。首先，称取过2mm筛的风干土样10g，倒入250ml振荡瓶中，加超纯水150ml，静置浸泡24h。将盛有样品的振荡瓶在往返式震荡机上振荡2h，振荡频率为170次/min。在1000ml沉降筒上放一个实验用大漏斗，将0.25mm孔径洗筛置于漏斗上，用超纯水将震荡后的土液通过筛孔洗入沉降筒中。取10ml沉降筒中的微团聚体液体放在离心管中，用于下一步实验。

（3）用超纯水包埋方法进行土壤微团聚体低温冷冻切片，然后将切片放在氮化硅薄膜窗口上。首先用超纯水将土壤微团聚体在低温-20℃的条件下进行冷冻包埋；然后用冷冻切片机进行低温冷冻切片，厚度6µm，并将切好的样品放置在氮化硅薄膜窗口上，然后用碳胶把氮化硅窗口固定。

（4）采用扫描电子显微镜表征、同步辐射红外显微成像技术和纳米二次离子探针质谱技术依次对步骤（3）的土壤微团聚体切片样品进行分析。

首先进行扫描电子显微镜表征。将氮化硅窗口放在扫描电子显微镜载物台上，选择合适区域，确定为感兴趣区域，大小为120×90 µm²，保存相关数据，用于下一步实验。仪器参数设置如下：放大倍数：1000倍；加速电压：20KV；分辨率：低真空模式4.0nm。

然后通过上海同步辐射光源BL01B线站进行同步辐射红外显微成像试验，然后对感兴趣区域进行光谱和成像采集，光谱和成像采集过程是通过线站同步辐射红外显微成像自带的OMNIC 9.0软件设定参数，并对数据进行获取和保存，OMNIC 9.0软件参数设置如下：波长范围：4000-400 cm^-1；狭缝大小：10µm；步长：5×5µm²；分辨率：2 cm^-1；扫描次数：128。

最后纳米二次离子探针质谱仪（型号NanoSIMS 50型）进行元素分析。然后通过离子团形式¹²C^-、¹²C ¹⁴N^-测定有机元素碳，氮，通过离子团形式⁵⁶Fe¹⁶O^-、²⁷Al¹⁶O^-测定无机元素铁、铝；通过ImageJ软件分析得到土壤微团聚体中有机无机元素的原位分布图以及相互结合位点；纳米二次离子探针质谱仪器参数设置如下：铯离子源16 keV，束离子束斑100-200nm，扫描透射厚度为15 nm，扫图状态下，停留时间是1 毫秒/像素。

（5）土壤微团聚体有机无机元素分布的规律

图2中扫描电镜的图确定土壤微团聚体感兴趣区域，观察到表面呈簇类聚状分布；通过软件Omnic 9.0数据分析同步红外图谱，结果显示该土壤微团聚体中含有高岭石类粘土矿物(3695cm^-1)，伊利石类粘土矿物(3619cm^-1)，亲水性脂肪族碳(2922cm^-1)，芳香类碳(1613cm^-1)，硅氧矿物(含Si-O-Si键, 1100cm^-1)以及非晶形硅氧化合物(含Si-OH键，985cm^-1)等官能团物质。同时该数据可以看出该土壤微团聚体中各官能团物质空间分布呈现很高的异质性，不同的官能团的强度不同，其中非晶形硅氧化合物强度最强；

图3纳米二次离子探针质谱仪原位同步表征了图2中感兴趣区域方框标识部分，图片数据显示²⁷Al¹⁶O^-和⁵⁶Fe¹⁶O^-离子团可以提供相关结合位点用来固存¹²C^-和¹²C ¹⁴N^-等有机元素，说明含有²⁷Al¹⁶O^-和⁵⁶Fe¹⁶O^-的无机矿物具有一定储存有机物的能力，证明土壤微团聚体在土壤体系中对有机碳的固存和有机质提升具有重要作用。

虽然本发明已以较佳实施例如上，然其并非用以限定本发明。本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。因此，本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。