一种采用偏振光显微镜观察胶原纤维的染色方法与流程

本发明涉及组织染色处理技术领域，更具体地，涉及一种采用偏振光显微镜观察胶原纤维的染色方法。

背景技术：

胶原纤维广泛分布于各个脏器内，是含量最多的一种纤维，现有技术中已知的胶原纤维有四种类型（i、ii、iii、iv），这四种类型的胶原纤维对于研究病变的发生机理和演变有一定的意义，虽然免疫组织化学染色和分子病理学技术发展迅速，但特殊染色方法在病理学诊断中的应用仍无法替代；目前常用的胶原纤维特殊染色方法包括masson染色、vangieson染色、he染色、苦味酸-天狼星红染色方法等，在光镜下，用masson染色、vangieson染色不能分辨不同类型的胶原纤维，难以在组织切片上完成对各型胶原纤维的分布、结构及含量的观察和检测；且这类染色的步骤繁琐，不易操作；应用苦味酸-天狼星红染色方法并结合偏光显微镜观察胶原纤维，可提高分辨率；结合图像分析技术，可以对不同类型的胶原纤维进行定位和定量分析，即可分析胶原纤维的类型、分布、排列及含量，便于判断组织纤维化的程度，这种方法较普通光镜观察具有不可比拟的优势。

现有技术中利用常规的苦味酸-天狼星红染色，在偏振光镜下，胶原纤维着色较弱，效果不佳，且切片染色后常用乙醇脱水，容易使得黄色衬染背景减弱，导致胶原纤维结构不清晰，影响观察这对组织的正确观察和病变分析。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种偏振光显微镜观察胶原纤维的染色方法。

本发明的第二个目的是提供上述方法在以非疾病诊断目的的判断组织纤维化程度中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种采用偏振光显微镜观察胶原纤维的染色方法，包括以下步骤：

s1.苦味酸-天狼星红染色：将70℃～90℃下的饱和苦味酸-天狼星红染液滴加入经脱蜡至水处理过的组织切片上进行染色；

s2.酸洗：用浓度为1～10%w/v的弱酸溶液浸洗组织切片；

s3.水浸洗，烘干，固定即可。

s1中70℃～90℃下的饱和苦味酸-天狼星红染液是指70～90℃下在苦味酸-天狼星红水溶液中，苦味酸的溶解度达最大且不再发生改变。

室温下饱和的苦味酸溶液的制备：2.46g苦味酸溶于200ml蒸馏水中，加热助溶，冷却至室温后，溶液底部有结晶析出，取上层清液备用，即得室温下饱和的苦味酸溶液。

本发明所述70℃～90℃下饱和苦味酸-天狼星红染液的制备：取0.1g苦味酸加入至1ml天狼星红染液中，70℃～90℃水浴后，染液底部有不溶粉末，取上层溶液备用，即得70℃～90℃下饱和苦味酸-天狼星红染液。

现有技术已知：苦味酸的溶解度随着温度的升高而不断增加，苦味酸在不同温度的水中溶解度数据见表1。

本发明选择使用70℃～90℃下饱和的苦味酸-天狼星红染液，加热后的苦味酸对组织的渗透作用加强，使得衬染背景更加鲜艳，加热后的天狼星红染液对胶原纤维的吸附也更牢，着色清晰；另外，苦味酸在70℃～90℃的苦味酸-天狼星红染液中处于饱和状态，选择将70℃～90℃的苦味酸-天狼星红染液滴加入组织切片上，由于组织切片处于常温，这样，进入组织切片的苦味酸-天狼星红染液温度逐渐降低，使得苦味酸从组织切片内的苦味酸-天狼星红染液中逐渐析出，且存在于组织切片内形成苦味酸结晶，待染色结束后，弱酸溶液溶解析出的苦味酸结晶，且不容易洗掉黄色衬染背景，从而保证胶原纤维着色佳，黄色衬染背景明显，胶原纤维清晰。

前期研究表明70℃以下水浴后的苦味酸-天狼星红染液对肝组织染色效果不佳，70℃以上水浴染液对肝组织染色效果较好，且苦味酸在70℃水浴后的苦味酸-天狼星红染液中的浓度是组织切片出现苦味酸晶体析出的临界点，故苦味酸-天狼星红染液的温度最好控制在70℃～90℃，避免过高温水浴染液造成大量苦味酸晶体析出而增加后面晶体洗脱步骤时间。

本发明所述染色观察方法中，还可以同时使用苏木素对胶原纤维的细胞核进行染色，由于苏木素染色液中含有乙醇，乙醇的使用会减弱黄色衬染背景，因此，需要在进行苦味酸-天狼星红染色前，先进行苏木素染色；因此，本发明上述染色方法中，s1中，在采用饱和苦味酸-天狼星红染液对组织切片上进行染色之前，先采用苏木素对组织切片进行染色。

本发明s2所述弱酸选自可以溶解苦味酸，且不容易洗掉黄色衬染背景的弱酸即可，优选地，s2所述弱酸选自乙酸或者柠檬酸，弱酸溶液的浓度控制在1～10%w/v，从而保证能够洗掉组织切片内的苦味酸结晶，同时避免过高浓度的弱酸溶液减弱天狼星红对组织切片的染色。

优选地，当组织切片内出现少量苦味酸结晶时，s2所述弱酸溶液的浸洗频率为：浸洗1～2次，每次20～30s；当组织切片内出现大量结晶时，弱酸溶液的浸洗次数以使组织切片内的苦味酸结晶消失为准。

本发明所述方法染色后的胶原纤维清晰，且在偏振光显微镜下能够分析胶原纤维的类型、分布、排列及含量，便于判断组织纤维化的程度，因此，本发明还保护所述染色观察方法在不是以疾病诊断作为目的的判断组织纤维化程度中的应用，如实验室制备胶原纤维观察样本等。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种采用偏振光显微镜观察胶原纤维的染色方法，是先用在70℃～90℃的饱和苦味酸-天狼星红染液进行染色，然后用弱酸溶液浸洗组织切片，最后按常规对组织切片进行浸洗，烘干，固定即可；加热后的苦味酸对组织的渗透作用加强，使得衬染背景更加鲜艳，加热后的天狼星红染液对胶原纤维的吸附也更牢，着色清晰；弱酸溶液可以洗掉组织切片内析出的苦味酸结晶，且不容易洗掉黄色衬染背景，从而保证胶原纤维着色佳，黄色衬染背景明显，胶原纤维清晰。

利用本发明所述染色方法重复性好，胶原纤维着色明显，纤维结构清晰，是介于淡黄色和淡绿色之间的双折光性纤细条形和星点状的类荧光物质；该方法有利于对不同类型的胶原纤维进行定位和定量分析，便于判断组织纤维化程度。

附图说明

图1为滴加70℃和90℃的饱和苦味酸-天狼星红染液在组织切片上，苦味酸的结晶析出情况。

图2为42天正常小鼠肝脏切片和42天肝硬化小鼠肝脏切片经实施例3所述染色方法染色后在不同显微镜下的观察图像；图2e为42天正常小鼠肝脏切片的普通光镜下图像（40倍）；图2g为42天肝硬化小鼠肝脏切片的普通光镜下图像（40倍）；图2f为42天正常小鼠肝脏切片的偏振光显微镜下图像；图2h为42天肝硬化小鼠肝脏切片的偏振光显微镜下图像。

图3为70℃水浴的饱和苦味酸-天狼星红染液染色后的组织切片的普通光镜图（40倍）。

图4为42天正常小鼠肝脏切片和42天肝硬化小鼠肝脏切片经常规苦味酸-天狼星红染色后在不同显微镜下的观察图像；其中，图4a为42天正常小鼠肝脏切片的普通光镜下图像（40倍）；图4c为42天肝硬化小鼠肝脏切片的普通光镜下图像（40倍）；图4b为42天正常小鼠肝脏切片的偏振光显微镜下图像；图4d为42天肝硬化小鼠肝脏切片的偏振光显微镜下图像。

图5为滴加30℃和50℃的饱和苦味酸-天狼星红染液在组织切片上，苦味酸的结晶析出情况。

图6为30℃水浴的饱和苦味酸-天狼星红染液染色后的组织切片的普通光镜图（40倍）。

图7为50℃水浴的饱和苦味酸-天狼星红染液染色后的组织切片的普通光镜图（40倍）。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段（实施例中用到的偏振光显微镜为德国徕卡dmi8+dfc7000t显微镜）。

实施例1

组织来源于42天正常与慢性纤维化小鼠肝脏，经10%甲醛固定。

苦味酸-天狼星红染液：0.1g苦味酸加入1ml天狼星红染液中，90℃水浴后，染液底部有不溶粉末，取上层溶液备用。

染色方法：（1）将组织固定于10%甲醛溶液，病理常规脱水透明、浸蜡包埋；（2）石蜡切片厚4μm，常规脱蜡至水得组织切片；（3）在组织切片上滴加90℃水浴的苦味酸-天狼猩红染液染30min；（4）滴加1%w/v乙酸水溶液浸洗2次，每次30s；（5）流水稍微浸洗，去除组织切片表面染色液；（6）温箱烘干，中性树脂封片固定；（7）在普通光镜与偏振光显微镜下观察。

实施例2

组织来源于42天正常与慢性纤维化小鼠肝脏，经10%甲醛固定。

苦味酸-天狼星红染液：0.1g苦味酸加入1ml天狼星红染液中，90℃水浴后，染液底部有不溶粉末，取上层溶液备用。

染色方法：（1）将组织固定于10%甲醛溶液，病理常规脱水透明、浸蜡包埋；（2）石蜡切片厚4μm，常规脱蜡至水得组织切片；（3）在组织切片上滴加70℃水浴的苦味酸-天狼猩红染液染30min；（4）滴加1%w/v乙酸水溶液浸洗2次，每次30s；（5）流水稍微浸洗，去除组织切片表面染色液；（6）温箱烘干，中性树脂封片固定；（7）在普通光镜与偏振光显微镜下观察。

实施例3

组织来源于42天正常与慢性纤维化小鼠肝脏，经10%甲醛固定。

苦味酸-天狼星红染液：0.1g苦味酸加入1ml天狼星红染液中，90℃水浴后，染液底部有不溶粉末，取上层溶液备用。

染色方法：（1）将组织固定于10%甲醛溶液，病理常规脱水透明、浸蜡包埋；（2）石蜡切片厚4μm，常规脱蜡至水得组织切片；（3）苏木素染液染6min，流水稍微冲洗组织切片；（4）在组织切片上滴加90℃水浴的苦味酸-天狼猩红染液染30min；（5）滴加1%w/v乙酸水溶液浸洗2次，每次30s；（6）流水稍微浸洗，去除组织切片表面染色液；（7）温箱烘干，中性树脂封片固定。

染色后将组织切片分别在普通光镜与偏振光显微镜下观察，90℃水浴的饱和苦味酸-天狼星红染液滴入组织切片上后，组织切片内有较多晶体吸出（图1），普通光学显微镜结果如图2：胶原纤维着色清晰，黄色衬染背景明显（图2e和图2g），胶原纤维折光性强，线条清晰，结构明显（图2f和图2h）。

实施例4

组织来源于42天正常与慢性纤维化小鼠肝脏，经10%甲醛固定。

苦味酸-天狼星红染液：0.1g苦味酸加入1ml天狼星红染液中，70℃水浴后，染液底部有不溶粉末，取上层溶液备用。

染色方法：（1）将组织固定于10%甲醛溶液，病理常规脱水透明、浸蜡包埋；（2）石蜡切片厚4μm，常规脱蜡至水得组织切片；（3）苏木素染液染6min，流水稍微冲洗组织切片；（4）在组织切片上滴加70℃水浴的苦味酸-天狼猩红染液染30min；（5）滴加1%w/v乙酸水溶液浸洗2次，每次30s；（6）流水稍微浸洗，去除组织切片表面染色液；（7）温箱烘干，中性树脂封片固定。

染色后将组织切片分别在普通光镜观察，同样表现为胶原纤维着色清晰，黄色衬染背景明显（图3）。

实施例5

实验方法同实施例3，唯一不同的是：本实施例在步骤（5）浸洗时用的是10%w/v乙酸溶液。

实施例6

实验方法同实施例3，唯一不同的是，本实施例在步骤（5）浸洗时用的是1%w/v柠檬酸溶液。

实施例7

实验方法同实施例3，唯一不同的是：本实施例在步骤（5）浸洗时用的是10%w/v柠檬酸溶液。

对比例1

组织来源于42天正常与慢性纤维化小鼠肝脏，经10%甲醛固定。

常规苦味酸-天狼星红染液：0.1g苦味酸加入1ml天狼星红染液中，加热助溶，冷却至室温后取上清液备用。

常规苦味酸-天狼星红染色：（1）将组织固定于10%甲醛溶液，病理常规脱水透明、浸蜡包埋；（2）石蜡切片厚4μm，常规脱蜡至水得组织切片；（3）常规苦味酸-天狼星红染液染组织切片60min，（4）流水稍微浸洗，去除组织切片表面染色液；（5）苏木素染液复染6min，（6）流水冲洗10min，（7）温箱烘干，中性树脂封片固定。

将染色后的组织切片分别置于普通光镜和偏振光镜下观察，结果如图4：胶原纤维着色不清晰，衬染背景不明显（图4a和图4c），且偏振光镜下胶原纤维结构模糊不清（图4b和图4d）。

对比例2

实验方法同实施例3，唯一不同的是：本对比例是在步骤（4）中滴加30℃水浴的饱和苦味酸-天狼星红染液，结果表明：组织切片内没有苦味酸结晶析出，且胶原纤维着色较弱（如图5和图6）。

对比例3

实验方法同实施例3，唯一不同的是：本对比例是在步骤（4）中滴加50℃的饱和苦味酸-天狼星红染液，结果表明：组织切片内没有苦味酸结晶析出，且胶原纤维着色较弱（如图5和图7）。