一种利用内壳鉴定柔鱼类日龄的方法与流程

本发明涉及水产学领域，涉及一种内壳生长纹的观测方法，具体地说，是一种利用内壳鉴定柔鱼类日龄的方法。

背景技术：

柔鱼类为软体动物门、头足纲、枪型目，柔鱼科种类的总称，寿命在1岁左右，它们是重要的海洋经济种类，广泛分布于世界各大洋和南、北极等海域。日龄鉴定作为柔鱼类渔业生物学和生态学的重点内容，一直以来受到国内外学者广泛关注。耳石、角质颚等被认为是用来鉴定柔鱼类日龄的可靠材料，过去也有研究尝试利用内壳表面的生长纹来鉴定柔鱼类的日龄，但是因其早期的生长纹判读困难而无法用于日龄鉴定。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种利用内壳鉴定柔鱼类日龄的方法，主要步骤为提取、清洗、脱水、干燥、剪裁、树脂包埋、切割、固定、打磨、抛光、图片制作和生长纹计数等过程；对内壳茎部的横截面进行打磨，即由内壳的远端和近端分别向茎部中部研磨成薄片；制作好的切片用ccd拍照，以保证今后随时可以读取生长纹；生长纹由内壳背侧核心处向腹侧边缘计数。

本方法利用形态稳定、容易提取、研磨方便的内壳来鉴定柔鱼类的日龄，包括柔鱼类内壳切片的制作步骤和内壳生长纹的观察与计数步骤，通过读取内壳横截面的生长纹数目来鉴定柔鱼类的日龄，为直接鉴定柔鱼类的日龄提供了一个新方法。

为了实现上述目的，本发明的第一方面，提供一种利用内壳鉴定柔鱼类日龄的方法，包括以下步骤：

a、剪裁：取出内壳，截取内壳茎部；

b、包埋：按1:1～1:1.5的体积比将压克力粉和液体固化剂配置成的冷埋树脂溶液，倒入模具中，使溶液包裹整个茎部，并充满模具，然后放置室温避光处待其硬化；

c、切割：将包埋硬化后的树脂沿内壳的横截面切割成树脂薄片；

d、固定：将步骤c得到的树脂薄片近端朝下，固定在载玻片上；

e、打磨：将固定在载玻片上的树脂薄片远端打磨，先粗磨再细磨至中部；

f、抛光：将经打磨的内壳树脂薄片抛光研磨面，除去油质和杂质，完成所述树脂薄片一面的研磨；

g、将步骤f抛光好的树脂薄片连同载玻片放在加热台上加热直至树脂软化，取下树脂薄片，干燥后，将树脂薄片翻面，固定在载玻片上，然后由远端向中部先粗磨再细磨直至横截面的生长纹清晰可见，最后再抛光得到内壳切片；

h、生长纹观察：由内壳背侧核心处向腹侧边缘计数生长纹的数目。

优选的，步骤a中的裁剪要将内壳柄部和尾椎部剪除，只留下茎部。

优选的，步骤d中也可将内壳远端朝下粘于载玻片上，然后由内壳近端向中部打磨、抛光和实施后续步骤。

优选的，步骤a中剪裁之前对内壳进行预处理，包括如下步骤：

a、提取：用解剖刀、剪刀小心提取柔鱼内壳，防止内壳断裂、破碎；

b、清洗：用清水将内壳表面清洗干净；

c、脱水：清洗后的内壳放入无水酒精中脱水30天；

d、干燥：将经步骤c处理的内壳放入通风橱中让其自然干燥1周左右。

优选的，步骤h中的生长纹计数步骤为：

i、图片制作：将制作好切片置于载玻片上，用胶头滴管滴上清水；在连接有ccd的显微镜200×倍下对内壳的生长纹进行拍照，用图像处理软件对所拍的图片分别进行拼图处理；

ii、生长纹计数：对200×倍下采集的图像由内壳背侧核心处向腹侧边缘计数生长纹数目，计数过程中选择轮间距较宽的地方进行计数。

本发明的第二方面，提供一种柔鱼类内壳切片的制作方法，包括如下步骤：

a、剪裁：取出内壳，截取内壳茎部；

b、包埋：按1:1～1:1.5的体积比将压克力粉和液体固化剂配置成的冷埋树脂溶液，倒入模具中，使溶液包裹整个茎部，并充满模具，然后放置室温避光处待其硬化；

c、切割：将包埋硬化后的树脂沿内壳的横截面切割成树脂薄片；

d、固定：将步骤c得到的树脂薄片近端朝下，固定在载玻片上；

e、打磨：将固定在载玻片上的树脂薄片近端打磨，先粗磨再细磨至中部；

f、抛光：将经打磨的内壳树脂薄片抛光研磨面，除去油质和杂质，完成所述树脂薄片一面的研磨；

g、将步骤f抛光好的树脂薄片连同载玻片放在加热台上加热直至树脂软化，取下树脂薄片，干燥后，将树脂薄片翻面，固定在载玻片上，然后由远端向中部先粗磨再细磨直至横截面的生长纹清晰可见，最后再抛光得到内壳切片。

优选的，步骤a中剪裁之前对内壳进行预处理，包括如下步骤：

a、提取：用解剖刀、剪刀小心提取柔鱼内壳，防止内壳断裂、破碎；

b、清洗：用清水将内壳表面清洗干净；

c、脱水：清洗后的内壳放入无水酒精中脱水30天；

d、干燥：将经步骤c处理的内壳放入通风橱中让其自然干燥1周左右。

更优选的，上述的柔鱼类内壳切片的制作方法，包括如下步骤：

(1)提取：用解剖刀、剪刀小心提取柔鱼内壳，防止内壳断裂、破碎；

(2)清洗：用清水将内壳表面清洗干净；

(3)脱水：清洗后的内壳放入无水酒精中脱水30天；

(4)干燥：将经步骤(3)处理的内壳放入通风橱中让其自然干燥1周左右。

(5)裁剪：取出干燥后的内壳，剪除柄部和尾椎部，留下茎部备用；

(6)包埋：按1:1～1:1.5的体积比将压克力粉和液体固化剂配置成的冷埋树脂溶液，倒入模具中，使溶液包裹整个茎部，并充满模具，然后放置室温避光处待其硬化；

(7)切割：将包埋硬化后的树脂沿内壳的横截面切割成2-3mm树脂薄片，并使研磨面平行于内壳的切割面；

(8)固定：将所述树脂薄片(内壳近端朝下)用强力速粘胶粘在载玻片上；

(9)打磨：将固定在载玻片上的树脂薄片(内壳远端)打磨，研磨过程中，先后以240、600、1200、2500水磨砂纸研磨至中部；

(10)抛光：以0.05μm氧化铝剂加水在绒布抛光研磨面，除去水磨砂纸造成的表面划痕以及多余的杂质，如此完成内壳远端的研磨；

(11)将以上抛光好的树脂薄片连同载玻片放在加热台上加热直至树脂软化，取下树脂薄片，干燥后，将树脂薄片翻面，固定在载玻片上，然后由内壳进端向中部重复上述的研磨和抛光过程直至横截面的生长纹清晰可见，研磨过程要不断在光学显微镜下观察研磨程度，以免研磨过度。

本发明的第三方面，提供一种柔鱼类内壳生长纹的观察与计数方法，包括如下步骤：

i、图片制作：将上述步骤中制作的内壳切片置于载玻片上，用胶头滴管滴上清水；在连接有ccd的显微镜200×倍下对内壳的生长纹进行拍照，用图像处理软件对所拍的图片分别进行拼图处理；

ii、生长纹计数：对200×倍下采集的图像由内壳背侧核心处向腹侧边缘计数生长纹数目，计数过程中选择轮间距较宽的地方进行计数。

本发明优点在于：

1、本发明提供的利用内壳鉴定柔鱼类日龄的方法，内壳容易提取、研磨方便，信息储存稳定，内壳鉴定柔鱼类日龄直接、可靠、准确。

2、本发明方法选取内壳茎部用于切片制作，提高了生长纹的可读性以及计数的准确性；本发明方法中内壳的研磨采用冷埋树脂包埋，然后再切割研磨，避免在内壳研磨过程中研磨平面的偏移，增加了切片制作的成功率和生长纹的可读性。

3、本发明方法在生长纹计数上，采用拍照系统大大方便了生长纹计数的方便性；制作好的切片用ccd拍照，以保证今后随时可以读取生长纹。

4、本发明解决了内壳不易直接研磨(包埋后增加了研磨接触面、降低了研磨平面偏移概率)，研磨易脱落(干燥后的内壳经树脂包埋后不易脱落)以及生长纹不易观察和计数(内壳茎部横截面生长纹比其他部位的易于观察和计数)的问题，提供一种能够快速准确研磨至最佳平面，保证较高的制片成功率，同时准确的判读生长纹数目的方法。

附图说明

图1.柔鱼类内壳形态、方位及横截面示意图。

图2.柔鱼类内壳生长纹计数方向。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1：利用内壳鉴定柔鱼类日龄的方法

操作步骤如下：

1、提取：用解剖刀、剪刀小心提取柔鱼内壳，防止内壳断裂、破碎；

2、清洗：取出后的内壳用清水清洗其表面的粘液及其它有机物；

3、脱水：清洗后的内壳放入无水酒精中脱水30天；

4、干燥：将脱水后的内壳放入通风橱中让其自然干燥1周左右。

5、裁剪：取出彻底干燥后的内壳(图1)，用手术剪刀将柄部和尾椎部剪除，保留茎部；

6、包埋：按1:1～1:1.5的体积比将压克力粉和液体固化剂(粘度为60mpas，采购于深圳市三昊仪器设备有限公司)配置成的冷埋树脂溶液，倒入模具中，使溶液包裹整个内壳茎部，并充满模具，然后放置室温避光处待其硬化；

7、切割：将包埋硬化后的树脂沿内壳的横截面切割成2-3mm树脂薄片，并使研磨面平行于内壳的切割面；

8、固定：将将所述树脂薄片(内壳近端朝下)用强力速粘胶粘在载玻片上；

9、打磨：将固定在载玻片上的树脂薄片(内壳远端)打磨，研磨过程中，先后以240、600、1200、2500水磨砂纸研磨至中部；

10、抛光：以0.05μm氧化铝剂加水在绒布抛光研磨面，除去水磨砂纸造成的表面划痕以及多余的杂质，如此完成内壳远端的研磨；

11、将以上抛光好的树脂薄片连同载玻片放在加热台上加热直至树脂软化，取下树脂薄片，干燥后，将树脂薄片翻面，固定在载玻片上，然后由内壳进端向中部重复上述的研磨和抛光过程直至横截面的生长纹清晰可见，研磨过程要不断在光学显微镜下观察研磨程度，以免研磨过度；

12、将打磨好的内壳切片放入纸袋中保存，并做好标记；

13、图片制作：将制作好切片置于载玻片上，用胶头滴管滴上一滴清水(增加观察的清晰度)；在连接有ccd(ccd图像传感器)的olympus的显微镜200×倍下对内壳的生长纹进行拍照；用photoshop7.0图像处理软件，对所拍的图片分别进行拼图处理；

14、生长纹计数：对200×倍下采集的图像由内壳背侧核心处向腹侧边缘计数生长纹数目(图2)，计数过程中选择轮间距较宽的地方进行计数(图2)。

实施例2：一种柔鱼类内壳切片的制作方法

操作步骤如下：

(1)裁剪：取出彻底干燥后的内壳(图1)，用手术剪刀将柄部和尾椎部剪除，保留茎部；

(2)包埋：按1:1～1:1.5的体积比将压克力粉和液体固化剂(粘度为60mpas，采购于深圳市三昊仪器设备有限公司)配置成的冷埋树脂溶液，倒入模具中，使溶液包裹整个内壳茎部，并充满模具，然后放置室温避光处待其硬化；

(3)切割：将包埋硬化后的树脂沿内壳的横截面切割成2-3mm树脂薄片，并使研磨面平行于内壳的切割面；

(4)固定：将将所述树脂薄片(内壳近端朝下)用强力速粘胶粘在载玻片上；

(5)打磨：将固定在载玻片上的树脂薄片(内壳远端)打磨，研磨过程中，先后以240、600、1200、2500水磨砂纸研磨至中部；也可将内壳远端朝下粘于载玻片上，然后由内壳远端向中部打磨、抛光和实施后续步骤；

(6)抛光：以0.05μm氧化铝剂加水在绒布抛光研磨面，除去水磨砂纸造成的表面划痕以及多余的杂质，如此完成内壳远端的研磨；

(7)将以上抛光好的树脂薄片连同载玻片放在加热台上加热直至树脂软化，取下树脂薄片，干燥后，将树脂薄片翻面，固定在载玻片上，然后由内壳进端向中部重复上述的研磨和抛光过程直至横截面的生长纹清晰可见，研磨过程要不断在光学显微镜下观察研磨程度，以免研磨过度；

在步骤(1)剪裁之前要对内壳进行预处理，包括如下步骤：

a、提取：用解剖刀、剪刀小心提取柔鱼内壳，防止内壳断裂、破碎；

b、清洗：用清水将内壳表面清洗干净；

c、脱水：清洗后的内壳放入无水酒精中脱水30天；

d、干燥：将经步骤c处理的内壳放入通风橱中让其自然干燥1周左右。

实施例3：一种柔鱼类内壳生长纹的观察与计数方法

操作步骤如下：

(1)图片制作：将制作好切片置于载玻片上，用胶头滴管滴上一滴清水(增加观察的清晰度)；在连接有ccd(ccd图像传感器)的olympus的显微镜200×倍下对内壳的生长纹进行拍照；用photoshop7.0图像处理软件，对所拍的图片分别进行拼图处理；

(2)生长纹计数：对200×倍下采集的图像由内壳背侧核心处向腹侧边缘计数生长纹数目(图2)，计数过程中选择轮间距较宽的地方进行计数(图2)。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。