一种用于TNF‑α检测的半定量核酸适配体试纸条及其制备方法与流程

本发明属于检测试剂技术领域，涉及一种用于tnf-α检测的半定量核酸适配体试纸条及其制备方法。

背景技术：

阿尔兹海默症(alzheimer’sdisease，ad)是一种危害性高、医疗护理成本巨大、尚无根治方法的神经退行性疾病，随着我国社会老龄化过程，患者人数逐年增加。而ad早期诊断一直是国际性的难题。

目前，已有的临床检测ad手段主要为：依靠认知能力测试结合核磁共振扫描判断ad病理发展，鉴定结果可靠度高，但对ad的早期诊治敏感性不佳(患者没有明显症状或具有轻微的认知功能的减退)，此外，检测样本为脑脊液，取样时常采用脊椎穿刺等手段，时常伴有副作用，而且不能以一定的时间间隔进行多次取样，给疾病的追踪性检测与治疗效果的监测带来困难；在临床ad标志物，特别是ad早期标志物方面，尚无公认的简便、可靠的临床检测指标或标准，亟待攻关解决。

体液标志物作为一种敏感性佳、特异性高、易于使用的指示剂，可真实反应ad的病理进程。肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor-α，tnf-α)是一种主要由巨噬细胞和单核细胞产生的炎症因子，参与机体的炎症反应。脑内慢性炎症反应是ad的重要病理特征之一。

技术实现要素：

本发明解决的问题在于提供一种用于tnf-α检测的半定量核酸适配体试纸条及其制备方法，该试纸条利用核酸适配体和纳米金交联复合物进行检测，其检测简便、灵敏、快速，可用于老年痴呆的早期筛查。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种用于tnf-α检测的半定量核酸适配体试纸条，包括两端分别设有样品垫和吸水垫的底板，底板的中部设置有硝酸纤维素膜检测层；硝酸纤维素膜检测层上靠近吸水垫的一端设有检测线，检测线包被有特异性结合生物素的链霉亲和素；在硝酸纤维素膜检测层和样品垫之间设置有结合垫，结合垫上掺有适配体纳米金复合物；样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接；

所述的适配体纳米金复合物是不能通过硝酸纤维素膜检测层的核酸-适配体-纳米金网格状复合物，其中核酸连接在纳米金颗粒上并杂交形成双链，适配体能够与tnf-α特异性识别，在识别后打开双链，使核酸-适配体-纳米金网格状复合物分解；纳米金颗粒上还连接有末端设有生物素的单链核酸，其在适配体纳米金复合物分解后能通过硝酸纤维素膜检测层，并泳动到检测线处。

所述的适配体纳米金复合物，是aunps-dna1颗粒和aunps-dna2，3颗粒通过dna1、dna2与linker通过dna杂交后形成的核酸-适配体-纳米金网格状复合物；

所述的aunps-dna1颗粒是巯基化的dna1连接于纳米金颗粒上，aunps-dna2，3颗粒是巯基化的dna2、dna3分别连接于纳米金颗粒上；

所述的linker含有与tnf-α特异性结合的适配体序列，且linker的两端分别与dna1、dna2相互补；dna1、dna2和linker可杂交形成双链；dna3的末端设有生物素，其序列不能与dna1、dna2相杂交。

所述的dna1的核苷酸序列为：tcacttcgctgaaaaaaa-(ch3)3-sh；

所述的dna2的核苷酸序列为：sh-(ch3)6-ctgtattgtcgc；

所述的linker的核苷酸序列为：tcctccatccgcgagtgggcgacaatactgtcagcgttcact；其中适配体序列为tggtcctaggcgcagagcgcatgta。

当样品垫存在tnf-α时，tnf-α特异性结合适配体纳米金复合物，使连接构成适配体纳米金复合物的linker从其上分离，分离后的带有生物素的颗粒通过硝酸纤维素膜，与检测线上的链霉亲和素结合，从而显示出红色，tnf-α浓度越大，则红色越明显。

所述的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫在相搭接时相互重叠1～3mm。

所述的用于tnf-α检测的半定量核酸适配体试纸条的制备方法，包括以下操作：

1)利用柠檬酸钠还原法制备出粒径13～20nm的纳米金颗粒；

2)巯基化的dna1与纳米金经盐老化方法连接形成aunps-dna1颗粒；

巯基化的dna2、dna3与纳米金经盐老化方法连接形成aunps-dna2，3颗粒；

3)将aunps-dna1颗粒、aunps-dna2，3颗粒和linker在缓冲溶液中杂交形成蓝色的适配体纳米金交联复合物；将得到的适配体纳米金交联复合物离心，去除上清，沉淀重悬；

所述的linker含有与tnf-α特异性结合的适配体序列，且linker的两端分别与dna1、dna2相互补；dna1、dna2和linker可杂交形成双链；dna3的末端设有生物素，其序列不能与dna1、dna2相杂交；

4)将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴组装到底板上，相邻粘贴物之间的重叠部分为1～3毫米；

5)将核酸-适配体-纳米金网格状复合物重悬液加于结合垫上，烘干；

6)在硝酸纤维素膜的检测线位置加链霉亲和素溶液，烘干后完成tnf-α检测的半定量核酸适配体试纸条的制备。

所述纳米金的制备为：将氯金酸边搅拌边加热至沸腾，然后加入柠檬酸三钠水溶液，溶液由蓝转为红色后持续加热2～8min，冷却后得到纳米金溶液，其中纳米金粒径为10～20nm。

所述dna1、dna2在与纳米金结合前，先将其溶于灭菌超纯水中；dna1、dna2的浓度为0.1～1mm；所述的linker的浓度为10～100μm；杂交条件为室温反应1小时，4℃过夜；

所述的dna1的核苷酸序列为：tcacttcgctgaaaaaaa-(ch3)3-sh；

所述的dna2的核苷酸序列为：sh-(ch3)6-ctgtattgtcgc；

所述的linker的核苷酸序列为：tcctccatccgcgagtgggcgacaatactgtcagcgttcact。

在缓冲液中孵育时，aunps-dna1颗粒、aunps-dna2，3颗粒和linker的摩尔比为1～10∶1～0∶1～10；

所述的重悬液含有质量浓度3～5％的蔗糖、100～300mmnacl和10～30mmtris-acetate；重悬液的ph为7～8。

所述的样品垫在检测时加入溶解状态的tnf-α；

适配体纳米金复合物的重悬液加入量为5～10μl，37℃过夜烘干；

所述检测线位置的链霉亲和素浓度为0.1～10mg/ml；

所述试纸条的宽度为2～5mm。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

体液标志物作为一种敏感性佳、特异性高、易于使用的指示剂，可真实反应ad的病理进程。肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor-α，tnf-α)是一种主要由巨噬细胞和单核细胞产生的炎症因子，参与机体的炎症反应。脑内慢性炎症反应是ad的重要病理特征之一。试纸条检测是一种相对简便、快速的检测方法，现在尚没有适用于ad检测的试纸条检测的相关报道。

本发明提供的用于tnf-α检测的半定量核酸适配体试纸条及其制备方法，基于靶标特异性，优选出核酸适配体，核酸适配体无需标记，只需要通过检测线的颜色变化即可进行tnf-α的检测。

本发明提供的用于tnf-α检测的半定量核酸适配体试纸条及其制备方法，dna1，dna2和linker是互补的单链核酸，在一定条件下，这三条单链可以杂交形成双链；而dna3一端带有生物素，可与链霉亲和素特异性结合；linker中的一段序列为tnf-α的适配体，可与tnf-α特异性结合。巯基连接的aunps-dna1和aunps-dna2，3通过linker可以杂交形成一个大的网状结构，使纳米金发生沉聚，溶液会由红色变为蓝紫色，蓝紫色的适配体纳米金复合物不能通过硝酸纤维素膜，停留在结合垫上，检测线为无色，而当tnf-α存在时，可以和linker进行结合，使适配体纳米金复合物分离，形成初始的aunps-dna1和aunps-dna2，3，其中aunps-dna2，3可通过硝酸纤维素膜，与检测线上的链霉亲和素结合，使检测线显示红色，根据红色的深浅程度，可以判断tnf-α的浓度高低。

本发明方法的选择性和特异性好，这是由核酸适配体本身的特点和结构决定的，在筛选适配体的过程中加入tnf-α，用selex筛选方法，选出能与tnf-α特异性结合而不与其他物质发生特异性反应的核酸适配体；

本发明可用于老年痴呆的早期筛查，方法操作简便，核酸适配体无需标记，无需使用大型的仪器设备，具有检测速度快、灵敏度高等优点；克服了适配体需要标记而导致成本提高和电化学操作相对复杂的不足，降低了检测成本。

附图说明

图1为本发明的试纸条的结构示意图，其中1为pvc底板，2为样品垫，3为结合垫，4为硝酸纤维素膜检测层，5为吸水垫，6为检测线；

图2为检测结果示意图，无tnf-α存在时，蓝色的交联复合物不能通过硝酸纤维素膜，检测线为无色；有tnf-α存在时，交联复合物分离，形成初始的aunps-dna1和aunps-dna2，3，aunps-dna2，3可以通过硝酸纤维素膜，检测线为红色。

图3为检测试纸条结果图，左边为无tnf-α存在时，蓝紫色的交联复合物不能通过硝酸纤维素膜，少量未交联的通过硝酸纤维素膜，检测线红色较浅；有tnf-α存在时，检测线红色变深。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明提供的用于tnf-α检测的半定量核酸适配体试纸条，包括两端分别设有样品垫2和吸水垫5的底板1，底板1的中部设置有硝酸纤维素膜检测层4；硝酸纤维素膜检测层4上靠近吸水垫5的一端设有检测线6，检测线6包被有特异性结合生物素的链霉亲和素；在硝酸纤维素膜检测层4和样品垫2之间设置有结合垫3，结合垫3上掺有适配体纳米金复合物；样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5依次搭接；

所述的适配体纳米金复合物是不能通过硝酸纤维素膜检测层的核酸-适配体-纳米金网格状复合物，其中核酸连接在纳米金颗粒上并杂交形成双链，适配体能够与tnf-α特异性识别，在识别后打开双链，使核酸-适配体-纳米金网格状复合物分解；纳米金颗粒上还连接有末端设有生物素的单链核酸，其在适配体纳米金复合物分解后能通过硝酸纤维素膜检测层，并泳动到检测线处。

具体的，所述的适配体纳米金复合物，是aunps-dna1颗粒和aunps-dna2，3颗粒通过dna1、dna2与linker通过dna杂交后形成的核酸-适配体-纳米金网格状复合物；

所述的aunps-dna1颗粒是巯基化的dna1连接于纳米金颗粒上，aunps-dna2，3颗粒是巯基化的dna2、dna3分别连接于纳米金颗粒上；

所述的linker含有与tnf-α特异性结合的适配体序列，且linker的两端分别与dna1、dna2相互补；dna1、dna2和linker可杂交形成双链；dna3的末端设有生物素，其序列不能与dna1、dna2相杂交。

本发明提供的一种用于tnf-α检测的半定量核酸适配体试纸条，，利用核酸适配体和纳米金交联复合物比色检测tnf-α，基于核酸适配体和纳米金交联复合物来进行的，下面分别对其进行说明。

关于核酸适配体：

适配体是在体外通过selex过程人工筛选出来的一类和靶分子有着高度的特异性亲和能力的短链寡核苷酸序列，就像抗原-抗体结合一样，靶分子可以和它对应的适配体特异性地结合。

selex技术即指数富集的配基系统进化技术(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，selex)，利用分子生物学的技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，将寡核苷酸文库和靶分子相互作用，保留结合的寡核苷酸配基，经反复扩增、筛选数个循环，即可使与该靶分子特异性结合的寡核苷酸序列得到富集，利用该技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出特异性与靶物质高度亲和的适配体。

dna1和dna2首先需与linker的对应区域互补，并通过linker连接后形成线性分子；同时，dna1、dna2自身以及之间不形成稳定的互补结构；linker设计时除考虑与dna1和dna2互补外，还考虑互补序列自身结构对适配体构象的影响，避免独自形成发夹结构等，影响对靶分子的识别。

而dna3的末端设有生物素，其序列只要不与dna1、dna2相杂交即可，其序列非特异性。

具体的设计结果如表1所示，其中序列1为tnf-α适配体序列，序列2为dna1序列，序列3为dna2序列，序列4为linker序列。

序列表1

具体的，本发明所提供的dna1、dna2、linker均由上海生工生物工程有限公司合成。

当样品垫2存在tnf-α时，tnf-α特异性结合适配体纳米金复合物，使连接构成适配体纳米金复合物的linker从其上分离，分离后的带有生物素的颗粒通过硝酸纤维素膜，与检测线上的链霉亲和素结合，从而显示出红色，tnf-α浓度越大，则红色越明显。

具体的，所述的样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4、吸水垫5在相搭接时相互重叠1～3mm。

下面给出用于tnf-α检测的半定量核酸适配体试纸条的制备方法，包括以下操作：

1)利用柠檬酸钠还原法制备出粒径13～20nm的纳米金颗粒；

2)巯基化的dna1与纳米金经盐老化方法连接形成aunps-dna1颗粒；

巯基化的dna2、dna3与纳米金经盐老化方法连接形成aunps-dna2，3颗粒；

3)将aunps-dna1颗粒、aunps-dna2，3颗粒和linker在缓冲溶液中杂交形成蓝色的适配体纳米金交联复合物；将得到的适配体纳米金交联复合物离心，去除上清，沉淀重悬；

所述的linker含有与tnf-α特异性结合的适配体序列，且linker的两端分别与dna1、dna2相互补；dna1、dna2和linker可杂交形成双链；dna3的末端设有生物素，其序列不能与dna1、dna2相杂交；

4)将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴组装到底板上，相邻粘贴物之间的重叠部分为1～3毫米；

5)将核酸-适配体-纳米金网格状复合物重悬液加于结合垫上，烘干；

6)在硝酸纤维素膜的检测线位置加链霉亲和素溶液，烘干后完成tnf-α检测的半定量核酸适配体试纸条的制备。

具体的，所述纳米金的制备为：将氯金酸边搅拌边加热至沸腾，然后加入柠檬酸三钠水溶液，溶液由蓝转为红色后持续加热2～8min，冷却后得到纳米金溶液，其中纳米金粒径为10～20nm。

所述dna1、dna2在与纳米金结合前，先将其溶于灭菌超纯水中；dna1、dna2的浓度为0.1～1mm；所述的linker的浓度为10～100μm；杂交条件为室温反应1小时，4℃过夜；

在缓冲液中孵育时，aunps-dna1颗粒、aunps-dna2，3颗粒和linker的摩尔比为1～10：1～0：1～10；

所述的重悬液含有质量浓度3～5％的蔗糖、100～300mmnacl和10～30mmtris-acetate；重悬液的ph为7～8。

所述的样品垫2)在检测时加入溶解状态的tnf-α；

适配体纳米金复合物的重悬液加入量为5～10μl，37℃过夜烘干；

所述检测线位置的链霉亲和素浓度为0.1～10mg/ml；

所述试纸条的宽度为2～5mm。

本发明的技术方案是基于以下原理实现的：dna1，dna2和linker是互补的单链核酸，在一定条件下，这三条单链可以杂交形成双链；而dna3一端带有生物素，可与链霉亲和素特异性结合；linker中的一段序列为tnf-α的适配体，可与tnf-α特异性结合。巯基连接的aunps-dna1和aunps-dna2，3通过linker可以杂交形成一个大的网状结构，使纳米金发生沉聚，溶液会由红色变为蓝紫色，蓝紫色的适配体纳米金复合物不能通过硝酸纤维素膜，停留在结合垫上，检测线为无色，而当tnf-α存在时，可以和linker进行结合，使适配体纳米金复合物分离，形成初始的aunps-dna1和aunps-dna2，3，其中aunps-dna2，3可通过硝酸纤维素膜，与检测线上的链霉亲和素结合，使检测线显示红色，根据红色的深浅程度，可以判断tnf-α的浓度高低。下面给出具体的实施例。

参见图2，无tnf-α存在时，蓝色的交联复合物不能通过硝酸纤维素膜，检测线为无色；有tnf-α存在时，交联复合物分离，形成初始的aunps-dna1和aunps-dna2，3，aunps-dna2，3可以通过硝酸纤维素膜，检测线为红色。

实施例1

一种检测tnf-α的金标试纸条，包括底板，底板上依次相连的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜以及吸水纸，在结合垫上有适配体纳米金复合物；所述硝酸纤维素膜上靠近吸水纸一端设有检测线，检测线为链霉亲和素，可特异性结合生物素。

tnf-α可以特异性结合其适配体，使linker从交联复合物上分离，分离后的颗粒可以通过硝酸纤维素膜和检测线上的链霉亲和素结合，从而显示出红色，tnf-α浓度越大，则红色越明显，检测过程无需复杂的仪器和专业的操作人员，显色迅速，在室温下就可以进行，具有良好的灵敏性和特异性。

实施例2

用于tnf-α检测的半定量核酸适配体试纸条的制备方法，包括以下操作：

步骤一、纳米金溶液的制备：采用柠檬酸三钠还原法制备纳米金溶液；具体的，所述纳米金粒径为10～20nm，浓度为5～10nm。

]步骤二、巯基化的dna和纳米金连接：末端巯基修饰的dna和纳米金采用盐老化方法来进行连接；其中，dna浓度为10～100μm。纳米金溶液在使用前先用0.22μm的滤膜过滤

步骤三、适配体胶体金交联复合物的形成：上一步骤中形成的颗粒和linker在一定的条件下进行杂交，形成适配体胶体金交联复合物，此时溶液会由红色变为蓝紫色；其中，杂交条件为室温反应1小时，4℃过夜。所形成的适配体纳米金复合物可用紫外可见分光光度计进行表征。

步骤四、适配体胶体金交联复合物离心，用buffer重悬；反应条件为室温、避光反应1小时。离心条件为11600g，15min。重悬buffer为3～5％蔗糖、100～300mmnacl、25～100mmtris-hcl。重悬buffer的ph为7～8.5。

将适量tnf-α溶解于200μl灭菌超纯水中，得到0.25mg/ml母液以便供检测使用；

步骤五、试纸条的组装：将样品垫(玻璃纤维膜)、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸按照一定规格依次粘贴在pvc底板上，制定检测线和金标垫；试纸条的宽度为3毫米。金标垫的制定是在结合垫上，用移液枪加5～10μl适配体纳米金蓝色交联复合物，37℃过夜烘干备用。

步骤六、tnf-α的检测：将样品垫浸入不同浓度的tnf-α溶液(将不同量的tnf-α母液溶于水中。)，迅速拿出，孵育，同时以加入水的处理为对照溶液；水平静置，观察检测线处的颜色变化，同时拍照进行分析。孵育条件为室温，30分钟。

具体的，检测线的制定是在硝酸纤维素膜上靠近吸水纸的一端，用3μl链霉亲和素溶液划一条检测线，37℃过夜烘干备用。链霉亲和素的浓度为0.1～10mg/ml。

参见图3所示的检测试纸条结果图，左边为无tnf-α存在时，蓝紫色的交联复合物不能通过硝酸纤维素膜，少量未交联的通过硝酸纤维素膜，检测线红色较浅；有tnf-α存在时，检测线红色变深。

以上给出的实施例是实现本发明较优的例子，本发明不限于上述实施例。本领域的技术人员根据本发明技术方案的技术特征所做出的任何非本质的添加、替换，均属于本发明的保护范围。