一种基于iTRAQ标记测定烟碱诱导细胞差异表达蛋白质的方法与流程

本发明涉及生物检测
技术领域：
，更具体而言，本发明涉及烟碱暴露神经细胞中差异表达蛋白质的测定方法。
背景技术：
：烟碱是奖励习惯性抽烟的主要成分，是导致吸烟成瘾的主要原因。吸烟时，烟碱随烟气经口腔到达肺部后，被肺泡中的毛细血管吸收，由肺部静脉循环经心脏进入体循环动脉系统，在吸烟后约10-20秒进入大脑，与烟碱乙酰胆碱受体(nachr)结合，使受体的离子通道打开，钙离子和钾离子等进入神经元，诱导一系列生物过程的改变而导致成瘾。蛋白质是生命活动的体现者，研究表明反复接触成瘾药物包括烟碱、吗啡、大麻等可以引起大脑特定区域蛋白质表达水平的改变，这种表达的改变不仅参与单个神经元和相关神经回路的调节，还可能对成瘾相关的异常行为产生影响。因此，识别参与形成和维持药物依赖的蛋白是理解药物成瘾潜在分子机制的关键。目前关于蛋白质表达的测定方法报道很多。蛋白质组学技术能够动态监测蛋白质的变化，是鉴定烟碱诱导蛋白质表达的主要方法。相对和绝对定量同位素标记(itraq)是由absciex公司研发的一种体外同种同位素标记的相对与绝对定量技术。该技术利用多种同位素试剂标记蛋白多肽n末端或赖氨酸侧链基团，经高精度质谱仪串联分析，可同时比较多种样品的蛋白表达量，是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术。但是，尚未见到将该技术用于烟碱作用细胞的差异蛋白质组学研究的报道。技术实现要素：针对上述技术问题，本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种通量高、重复性好的烟碱作用细胞的差异蛋白质组学研究方法。本发明的目的通过以下技术方案实现。本发明提供一种基于itraq标记测定烟碱诱导细胞差异表达蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤：1)样品前处理：将细胞分成实验组和对照组，分别在含或不含烟碱的细胞培养基中培养，然后提取细胞全蛋白；2)蛋白质酶解：分别对步骤1)得到的实验组和对照组的细胞全蛋白依次进行还原和烷基化处理，然后在适合酶解的条件下加入胰蛋白酶，收集酶解得到的肽段；3)itraq标记：采用不同分子量的itraq试剂标记步骤2)得到的实验组的肽段和对照组的肽段，将经标记的两组肽段混合，除盐，冻干；4)nano-lc-q-tof测定：将步骤3)得到的肽段混合物上样到nano-lc-q-tof中，进行液相色谱-质谱分析；5)差异蛋白筛选：将步骤4)得到的数据导入mascot软件对uniprot-human数据库进行搜库，筛选差异表达蛋白质。在本发明提供的方法中，在所述步骤1)中，所述细胞优选为神经细胞，更优选为神经母瘤细胞；优选地，烟碱在细胞培养基中的浓度为1mol/l；优选地，所述步骤1)包括以下步骤：细胞随机分为实验组和对照组两组，在37℃和5％co2下，实验组在含有1mmol/l烟碱的培养基中、对照组在不含烟碱相同的培养基中培养1小时，然后收集细胞，提取细胞全蛋白，其中所述培养基为含有10％血清和1％双抗的dmem培养基。在本发明提供的方法中，优选地，在所述步骤2)中，采用还原剂进行细胞全蛋白的还原处理，所述还原剂为10mmdtt、8m尿素、0.1mtris-hcl，ph8.5；优选地，采用烷基化剂进行细胞全蛋白的烷基化处理，所述烷基化剂为50mmiaa、8m尿素、0.1mtris-hcl，ph8.5；优选地，所述还原和烷基化处理包括：向细胞全蛋白溶液中加入4倍体积所述还原剂，在37℃下孵育1小时，然后在避光条件下加入与还原剂相同体积的所述烷基化试剂，在室温下放置20分钟。在本发明提供的方法中，优选地，在所述步骤2)中，所述胰蛋白酶酶解包括：按细胞全蛋白和酶的质量比为20:1的比例向经过还原和烷基化处理的细胞全蛋白中加入胰蛋白酶；优选地，所述胰蛋白酶酶解包括：按细胞全蛋白和酶的质量比为20:1的比例向经过还原和烷基化处理的细胞全蛋白中加入胰蛋白酶，在37℃下孵育16小时，收集分子量小于10kd的肽段。优选地，所述步骤2)包括以下步骤：2-1)取100μg细胞全蛋白用细胞裂解液配制成30μl体积的细胞全蛋白溶液，加入现配4倍体积的还原剂，在37℃下孵育1小时，然后在避光条件下加入与还原剂相同体积的烷基化试剂，在室温下放置20分钟；2-2)将经还原和烷基化处理的蛋白溶液移入10kd的超滤管中，在4℃下12000×g离心40分钟，然后向超滤管中加入150μl0.3mteab，在4℃下12000×g离心40分钟，再重复teab离心3次，以去除未反应的液体；2-3)按细胞全蛋白和酶的质量比为20:1的比例向超滤管中加入胰蛋白酶，在37℃下孵育16小时，然后在4℃下12000×g离心10分钟，再向超滤管中加入100μl0.2mteab，在4℃下12000×g离心20分钟，再重复teab离心2次；2-4)收集超滤管管底的肽段，冷冻干燥后，加入100μl0.2mteab使其复溶，充分混匀。在本发明提供的方法中，优选地，在所述步骤3)中，所述itraq试剂为114、115、116和1174标试剂。优选地，所述步骤3)包括：将不同itraq试剂溶解于100μl乙醇中，然后与步骤2)得到的实验组的肽段和对照组的肽段在室温下反应2小时，然后加入200μl水终止反应30分钟，将经标记的两组肽段混合，然后经sep-parkc18柱除盐，冻干。在本发明提供的方法中，优选地，在所述步骤4)中，所述液相色谱中，trap柱为acclaminpepmap(100μm*2cm，c18，5μm)，分析柱为acclaminpepmaprplc(75μm*50cm，c18，2μm)；优选地，所述液相色谱包括以下条件：柱温55℃；流动相a：0.1％甲酸水溶液，b：0.1％甲酸乙腈溶液，流动相梯度如下所示，流速0.4μl/min：流动相梯度优选地，所述液相色谱包括：将步骤3)得到的肽段混合物溶解于100μl0.1％的甲酸水溶液中，以2μl的进样量进行色谱150分钟。在本发明提供的方法中，优选地，在所述步骤4)中，所述质谱包括以下条件：captivespray离子源，全扫正离子扫描模式，capillary电压1600v；质谱全扫描质量范围50～2200m/z，二级质谱全扫描质量范围50～2200m/z，循环时间3s；ms/mshigh：16，能量范围：85％-100％。在本发明提供的方法中，优选地，在所述步骤5)中，搜库的条件包括：参数：最大漏切位点数2；半胱氨酸脲甲基化固定修饰、蛋氨酸可变氧化修饰、n端乙酰化可变修饰；定量：itraq4标；肽端允许误差：20ppm；ms/ms允许误差：0.1da；显著阈值：p＜0.05。在本发明提供的方法中，优选地，在所述步骤5)中，筛选差异表达蛋白质的过程包括：首先根据至少有一个唯一肽段，且得分≥25筛选出可信蛋白，然后根据至少有两个定量肽段、|比值|≥1.5倍且单样本t检验p<0.05筛选出差异表达蛋白质。具体地，本发明技术方案的
发明内容如下。一种烟碱诱导蛋白质差异表达的测定方法，包括以下内容：a、溶液的配制(1)牛血清白蛋白标准溶液的配制：2g/ml牛血清白蛋白溶液，pbs依次稀释为1.5、1.0、0.75、0.5、0.25、0.125、0.025、0g/ml；(2)缓冲液1(8m尿素，0.1mtris-hcl(ph8.5))：准确称取尿素24.024g和tris0.6057g，双蒸水定容到50ml；(3)缓冲液2(8m尿素；0.1mtris-hcl(ph8.0))：准确称取尿素24.024g和tris0.6057g，双蒸水定容到50ml；(4)还原剂(缓冲液1+10mmdtt)：准确称取尿素24.024g，tris0.6057g和dtt0.0771g，双蒸水定容到50ml，ph调至8.5；(5)烷基化试剂(缓冲液1+50mmiaa)：准确称取尿素24.024g，tris0.6057g和iaa0.4624g，双蒸水定容到50ml，ph调至8.5(配制和保存均需避光)；(6)teab1(0.3mol/l)：准确量取15ml1mteab，加入色谱水定容至50ml；(7)teab2(0.2mol/l)：准确量取10ml1mteab，加入色谱水定容至50ml；酶解液：取胰蛋白酶20μg，teab1溶解。(8)凝胶制备：30％丙烯酰胺储存液：准确称取29.2g丙烯酰胺和0.8g双丙烯酰胺，双蒸水定容到100ml，0.45μm滤膜过滤保存；10％过硫酸铵：准确称取0.5g过硫酸铵定容至5ml；分离胶和浓缩胶配制如表1。将混匀的分离胶灌入胶板中至上边缘约1cm处，趁未凝时覆盖一层水，确保凝胶均匀及凝胶上表面平直，待分离胶凝固后，将水吸干加入浓缩胶，迅速插上梳子，待浓缩胶凝固后。表1分离浓缩胶b、样品前处理蛋白质样品的抽提：细胞接种后，使用含有10％血清和1％双抗的dmem培养基在37℃、5％co2培养箱中培养，当融合度达到80％时，随机分为实验组和对照组两组各3瓶，分别在有和无烟碱的培养基中培养后，酶解、消化收集，pbs清洗后加入蛋白质抽提液和蛋白酶抑制剂，充分震荡(以上操作在冰上进行)，4℃放置20min，离心(12000×g，4℃)20min，取上清。bca法测定样品蛋白质的浓度：在96孔板的每孔中分别加入25μl不同浓度的蛋白溶液标准品和25μl待测样品蛋白质，再加入200μlbca染色液，混匀，孵育30min在波长为565nm下进行检测蛋白质的吸光度。利用测得已知蛋白质的吸光度绘制标准曲线，并计算样品浓度。蛋白质质量和样品平行性的检测：蛋白样品与上样缓冲液(4*)按体积3:1比例混合(4*缓冲液的使用)，沸水浴加热7min，使蛋白完全变性，取一定量的蛋白样品上样到凝胶电泳上，待蛋白质质量和各样本之间的平行性良好时，进行蛋白质的酶解。蛋白质酶解：取100μg细胞全蛋白，加入现配4倍体积的还原剂，37℃孵育1h；避光条件下加入烷基化试剂，室温放置20min；将蛋白溶液移入10kd的超滤管中，离心40min(12000×g，4℃)，将未反应的液体全部离心；向每个超滤管中加入150μl0.3mteab，离心40min(12000×g，4℃)，将未反应的液体全部离心下去，重复三次；然后按20:1比例加入胰蛋白酶37℃孵育16h；将酶切好的样品离心10min(12000×g，4℃)，加100μl0.2mteab，离心20min(12000×g，4℃)，重复上述步骤2次；酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底；冷冻干燥后，向其中加入100μl0.2mteab使其复溶，充分混匀。itraq标记：向4管itraq试剂(分子量分别为114、115、116和117)中加入100μl乙醇，分别对实验组和对照组蛋白酶解肽段进行标记；室温反应2h后，加200μl色谱水终止反应30min；混合后经sep-parkc18柱除盐，冻干。c、nano-lc-q-tof测定(1)nano-lc-q-tof条件色谱条件：trap柱acclaminpepmap(100μm*2cm，c18，5μm)，分析柱acclaminpepmaprplc(75μm*50cm，c18，2μm)，柱温55℃；流动相a：0.1％甲酸水溶液，b：0.1％甲酸乙腈溶液，流动相梯度如表2所示，流速：0.4μl/min，进样量2μl。表2流动相梯度时间(min)05120125135135.1150流动相b(％)5530808055质谱条件：质谱配有captivespray离子源，全扫正离子扫描模式，capillary电压1600v；质谱全扫描质量范围50～2200m/z，二级质谱全扫描质量范围50～2200m/z，循环时间3s；ms/mshigh：16，能量范围：85％-100％。(2)差异蛋白的测定将酶解标记的肽段样品复溶于100μl0.1％甲酸水溶液中，进样量为2μl上样到nano-lc-q-tof进行测定。d、差异蛋白进行筛选分析差异蛋白将测得数据导入mascot数据进行分析，使用mascot软件(version2.4.1)搜索引擎对uniprot-human数据库搜库。搜库参数：最大漏切位点数2；半胱氨酸脲甲基化固定修饰、蛋氨酸可变氧化修饰、n端乙酰化可变修饰；定量：itraq4标；肽端允许误差：20ppm；ms/ms允许误差：0.1da，显著阈值：p＜0.05。由于体系偏差的存在，为减少假阳性的结果，首先根据至少有一个唯一肽段，且得分≥25筛选出可信蛋白，然后根据至少有两个定量肽段、|比值|≥1.5倍且单样本t检验p<0.05筛选出差异蛋白。本发明的发明人基于itraq技术结合纳升液相色谱三重四级杆飞行时间质谱(nano-lc-q-tof)，开发了测定烟碱诱导神经细胞蛋白质的差异表达的方法，该方法通过优化前处理及检测条件，建立了神经细胞蛋白质的提取与酶解、itraq标记、检测烟碱诱导神经细胞蛋白的差异表达测定。实验证明，本方法的记效率为96.7％，标记效率良好。对照组两次重复标记定量蛋白比值95％的置信区间分布在(1.091，1.147)；实验组两次重复标记定量蛋白比值95％的置信区间分布在(1.099，1.142)，表明重复性好，实验结果可靠。采用本发明的方法，发现参与mapk级联生物过程和蛋白酶体信号通路的蛋白酶体蛋白可能在烟碱成瘾中发挥重要作用，达到了了解烟碱诱导神经细胞的差异表达蛋白质及差异蛋白质参与的生物过程的目的。附图说明以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：图1示出了根据实施例1烟碱诱导shsy-5y细胞的蛋白质差异表达的分析流程。图2示出了根据实施例1液相色谱不同分离时间色谱图。图3示出了根据实施例1不同能量范围蛋白质的鉴定。具体实施方式以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。实施例1为考察烟碱暴露细胞蛋白质的差异表达，培养1mol/mol烟碱暴露1h的神经母瘤细胞，经神经蛋白裂解液提取蛋白，对提取的蛋白的浓度、质量及样品的平行性进行测定，经超滤酶解，用itraq标记混合，通过sep-parkc18柱除盐，上样到nano-lc-q-tof，进行分析鉴定。流程图见图1。1.仪器、试剂和材料shsy-5y细胞：美国actt细胞库；dmem培养基和青链霉素：美国hyclone公司；优级胎牛血清：美国gibco公司；bca试剂盒，pbs，二硫苏糖醇(dtt)，碘乙酰胺(iaa)，丙烯酰胺，n-n-交叉丙烯酰胺，尿素和溴化四乙铵(teab)：美国sigma公司；乙腈(can)、尿素、甲醇、甲酸(fa)，质谱级胰酶和n-per神经蛋白提取液：promega公司；itraq试剂盒：美国absciex公司；三(羟甲基)氨基甲烷(trishcl)，过硫酸铵，十二烷基硫酸钠(sds)，上样缓冲液，甘氨酸，凝胶快速蓝染试剂wb，sds，和ripa裂解液：中国碧云天公司；nano-lc(thermo)-q-tof：德国bruker；多功能酶标仪：美国moleculardevices；真空冷冻干燥机：德国christ；imagescanner扫描仪：gehealthcare。2.样品处理细胞接种后，在37℃、5％co2条件下培养，使用含有10％血清和1％双抗的dmem培养基，当细胞的融合度达到80％时随机分为两组实验组和对照组两组各3瓶，实验组在含有1mmol/l烟碱的培养基中，对照组在不含烟碱相同的培养基中培养1h后，酶解消化收集细胞，使用磷酸缓冲盐溶液(pbs)清洗后加入蛋白提取液，bca法蛋白定量。分别取100μg细胞全蛋白每组做2次重复实验，定容到30ul；加4倍体积(10mmdtt、8m尿素、0.1mtris-hcl(ph8.5))的还原剂，37℃水浴1h；加入与还原剂等体积的烷基化试剂(50mmiaa、8m尿素、0.1mtris-hcl(ph8.5))室温避光20min；将蛋白溶液移入10kd的超滤管中4℃，12000g，40min，将未反应液体全部离心；向每个超滤管中加入150μl的0.3mteab，4℃，12000g，40min，将未反应的液体全部离心下去，重复三次；然后按20:1比例加入胰蛋白酶37℃酶解16h；将酶切好的样品室温下离心12000g，离心10min，加100ul的0.2mteab，室温12000g离心20min，重复上述步骤2次；酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底；冷冻干燥后，向其中加入100ul0.2mteab使其复溶，充分混匀。向4管对应itraq(分子量分别为114、115、116和117的标签)中加入100ul乙醇，115、116标记对照组，114、117标记实验组；室温反应2h，加200ul色谱水终止反应30min；混合后经sep-parkc18柱除盐，冻干。将冻干后的样品用0.1％甲酸水溶液复溶，上nano-lc-q-tof中分离鉴定。色谱条件：trap柱acclaminpepmap(100μm*2cm，c18，5μm)，分析柱acclaminpepmaprplc(75μm*50cm，c18,2μm)，柱温55℃；流动相a：0.1％甲酸水溶液，b：0.1％甲酸乙腈溶液，流速：0.4μl/min，进样量2μl，在不同的分离时间及梯度下，由分离色谱图(如图2)可知在150min下可以实现更好的分离，流动相梯度如表3所示。表3流动相梯度时间(min)05120125135135.1150流动相b(％)5530808055质谱条件：质谱配有captivespray离子源，全扫正离子扫描模式，capillary电压1600v；质谱全扫描质量范围50～2200m/z，二级质谱全扫描质量范围50～2200m/z,cycletime3s；ms/mshigh：16。对碰撞能量进行优化，可知(图3)能量范围：85％-100％，信号相应较强。3.差异蛋白分析使用mascot(version2.4.1)搜索引擎对uniprot-human数据库搜库，图3是对质谱条件碰撞能量范围的优化，示出了不同能量范围蛋白质的鉴定。在烟碱暴露组和实验组中结果共鉴定到1316种蛋白质，其中1273种蛋白有定量信息，itraq标记效率为96.7％，表明标记效率良好。对照组两次重复标记定量蛋白比值95％的置信区间分布在(1.091，1.147)；实验组两次重复标记定量蛋白比值95％的置信区间分布在(1.099，1.142)，表明重复性好，实验结果可靠。由于体系偏差的存在，为减少假阳性的结果，至少选择有两个定量肽段、|比值|≥1.5倍且单样本t检验p<0.05的蛋白为差异蛋白，最终，共筛选出132种差异蛋白，其中蛋白酶体家族，核糖体蛋白家族，真核翻译起始因子，氨酰-trna合成酶和乙醛脱氢酶18家族a1(如表4)位于差异蛋白网络互作中心，可能在烟碱成瘾中发挥发挥重要作用。表4差异蛋白网络互作中心蛋白以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。当前第1页12