一种植物茎秆中木质素单体的测定方法与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体是一种植物茎秆中木质素单体的测定方法。
背景技术：
：木质素是植物体中仅次于纤维素的酚类聚合体，是细胞壁的重要组成部分，填充于纤维素框架中增强植物体的机械强度，增强其抗性。研究表明，木质素的存在提髙了小麦、水稻、油菜、玉米、荞麦等重要粮食作物的茎秆抗倒伏能力。木质素主要由香豆醇、芥子醇和松柏醇三种单体通过聚合形成的对-羟基苯基木质素(h木质素)、紫丁香基木质素(s木质素)和愈创木基木质素(g木质素)三种木质素组成。因此，为了深入研究植物茎秆中h、g、s木质素单体形成机理，需要建立一种准确的方法来测定植物茎杆中木质素单体的含量。中国专利cn104535678a公开了一种梨果皮中木质素单体含量的测定方法，从而快速准确的测定了梨果皮中木质素单体的含量。植物茎秆中木质素含量与作物的倒伏密切相关，木质素含量的多少决定作物的抗倒伏能力强弱，而木质素则由h、g和s木质素单体组成，测定木质素含量必须测定这三种单体的含量，目前关于植物茎秆中木质素单体含量的测定方法未见报道。技术实现要素：本发明是提供一种植物茎秆中木质素单体的测定方法。为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案。一种植物茎秆中木质素单体的测定方法，包括以下步骤：1)植物茎秆收获后在65-70℃的烘箱中完全烘干，用小型粉碎机粉碎后过60-80目筛；2)取0.07-0.10g样品置于5ml离心管中，加1.5-2.0ml80％乙醇，充分涡旋5-10min，10,000-12,000rpm离心8-10min，倒掉上清液，此步骤重复3次；3)加入1.5-2.0ml氯仿/甲醇为2:1的混合液，充分涡旋3-5min，10,000-12,000rpm离心8-10min，倒掉上清液；4)加入500-600ml丙酮，在30-35℃的氮吹仪上吹干；5)加入1.5-2.0mlph5.0的0.1mol/l的醋酸钠缓冲液，盖上盖子后，置于80-85℃的水浴锅中热击30-40min；6)置于-4-0℃的冰浴中冷却5-10min；7)加入35-40μl0.01％nan3，35-40μl淀粉酶，3-4μl支链淀粉酶，盖上盖子充分涡旋3-5min后，置于37℃的摇床上12-16h；8)100℃热击10min,终止消化，10,000-12,000rpm离心8-10min，倒掉上清液；9)加入500-600ml丙酮，在30-35℃的氮吹仪上吹干备用；10)称取上述吹干备用的样品5-8mg，置于密封性好的玻璃管中，加入1ml2.5％bf3,10％etsh，87.5％二氧六环混合液，轻轻摇晃，给玻璃管中充满氮气置换掉管中全部的空气后立马盖上盖子；11)在100℃条件下加热4h，每隔1h轻轻摇晃1次；12)置于冰上冷却5-8min，终止反应；13)加入0.4mol/lnahco30.3-0.4ml调节上层液相的ph为3-4；14)加入2ml超纯水、0.2ml二十四烷及0.8ml乙酸乙酯，静置10-15min；15)快速吸取上层的有机相300-400μl转移至新的离心管中，确保没有带入水；16)置于30-35℃的氮吹仪上吹干，将吹干的物质重新溶于200-300μl丙酮中；17)置于30-35℃的氮吹仪上吹干，将吹干的物质重新溶于400-500μl乙酸乙酯中，用0.22μm有机滤膜过滤；18)吸取过滤后的溶液100-200μl，向里面加入20-40μl吡啶，100-200μln,o-双三甲基硅基乙酰胺，在25-30℃室温下静置2-3h后，取2-3μl进行气相色谱-质谱联用仪分析；19)根据分子离子峰来定性，其中质荷比239为h木质素单体，质荷比269为g木质素单体,质荷比299为s木质素单体，根据内标二十四烷的浓度、内标峰面积，样品浓度、样品峰面积，从而计算出样品中三种木质素单体的含量。上述步骤4)，步骤9)，步骤16)，步骤10)，步骤17)需要在通风橱内进行。上述步骤10)中2.5％bf3,10％etsh，87.5％二氧六环混合液要现配现用。上述步骤14)中二十四烷的浓度为0.5mg/ml，用乙酸乙酯溶解。上述步骤18)中气相色谱-质谱联用仪分析的条件为：载气流速1ml/min，进样口温度250-260℃，柱子升温程序：初始温度130℃保持3min，以3℃/min升温至250℃，保留5min，质谱条件：ei离子源，离子源温度200℃，电子能量70ev，接口温度250℃，溶剂延迟30min。与现有技术相比，本发明具有以下的优点：本发明提供的详细的处理方法，可以准确的测定植物茎秆中h、g、s木质素单体的含量，从而为深入研究植物茎秆中h、g、s木质素单体形成机理提供理论依据。附图说明图1是油菜茎秆中木质素单体的定性鉴定图；图2是小麦茎秆中木质素单体的定性鉴定图；图3是荞麦茎秆中木质素单体的定性鉴定图。具体实施方式下面结合实施例进一步对本发明的技术方案作详细的阐述，但并不是限制本发明。实施例11仪器：安捷伦5975cgc-ms仪器，色谱柱：安捷伦hp-5ms型的石英毛细管色谱柱，30mm×0.25mm×0.25μm。2样品：油菜茎秆。3方法：1)油菜茎秆收获后在65℃的烘箱中完全烘干，用小型粉碎机粉碎后过60目筛；2)取0.07g样品置于5ml离心管中，加1.5ml80％乙醇，充分涡旋5min，10,000rpm离心8min，倒掉上清液，此步骤重复3次；3)加入1.5ml氯仿/甲醇为2:1的混合液，充分涡旋3min，10,000-12,000rpm离心8min，倒掉上清液；4)加入500ml丙酮，在30℃的氮吹仪上吹干；5)加入1.5mlph5.0的0.1mol/l的醋酸钠缓冲液，盖上盖子后，置于80℃的水浴锅中热击30min；6)置于-4℃的冰浴中冷却5min；7)加入35μl0.01％nan3，35μl淀粉酶，3μl支链淀粉酶，盖上盖子充分涡旋3min后，置于37℃的摇床上12h；8)100℃热击10min,终止消化，10,000rpm离心8min，倒掉上清液；9)加入500ml丙酮，在30℃的氮吹仪上吹干备用；10)称取上述吹干备用的样品5mg，置于密封性好的玻璃管中，加入1ml2.5％bf3,10％etsh，87.5％二氧六环混合液，轻轻摇晃，给玻璃管中充满氮气置换掉管中全部的空气后立马盖上盖子；11)在100℃条件下加热4h，每隔1h轻轻摇晃1次；12)置于冰上冷却5min，终止反应；13)加入0.4mol/lnahco30.3ml调节上层液相的ph为3；14)加入2ml超纯水、0.2ml二十四烷及0.8ml乙酸乙酯，静置10min；15)快速吸取上层的有机相300μl转移至新的离心管中，确保没有带入水；16)置于30℃的氮吹仪上吹干，将吹干的物质重新溶于200μl丙酮中；17)置于30℃的氮吹仪上吹干，将吹干的物质重新溶于400μl乙酸乙酯中，用0.22μm有机滤膜过滤；18)吸取过滤后的溶液100μl，向里面加入20μl吡啶，100μln,o-双三甲基硅基乙酰胺，在25℃室温下静置2h后，取2μl进行气相色谱-质谱联用仪分析；19)根据分子离子峰来定性，其中质荷比239为h木质素单体，质荷比269为g木质素单体,质荷比299为s木质素单体，根据内标二十四烷的浓度、内标峰面积，样品浓度、样品峰面积，从而计算出样品中三种木质素单体的含量。实施例21仪器：安捷伦5975cgc-ms仪器，色谱柱：安捷伦hp-5ms型的石英毛细管色谱柱，30mm×0.25mm×0.25μm。2样品：小麦茎秆。3方法：1)小麦茎秆收获后在70℃的烘箱中完全烘干，用小型粉碎机粉碎后过80目筛；2)取0.10g样品置于5ml离心管中，加2.0ml80％乙醇，充分涡旋5-10min，12,000rpm离心10min，倒掉上清液，此步骤重复3次；3)加入2.0ml氯仿/甲醇为2:1的混合液，充分涡旋5min，12,000rpm离心10min，倒掉上清液；4)加入600ml丙酮，在35℃的氮吹仪上吹干；5)加入2.0mlph5.0的0.1mol/l的醋酸钠缓冲液，盖上盖子后，置于85℃的水浴锅中热击40min；6)置于-4-0℃的冰浴中冷却10min；7)加入40μl0.01％nan3，40μl淀粉酶，4μl支链淀粉酶，盖上盖子充分涡旋5min后，置于37℃的摇床上16h；8)100℃热击10min,终止消化，12,000rpm离心10min，倒掉上清液；9)加入600ml丙酮，在35℃的氮吹仪上吹干备用；10)称取上述吹干备用的样品8mg，置于密封性好的玻璃管中，加入1ml2.5％bf3,10％etsh，87.5％二氧六环混合液，轻轻摇晃，给玻璃管中充满氮气置换掉管中全部的空气后立马盖上盖子；11)在100℃条件下加热4h，每隔1h轻轻摇晃1次；12)置于冰上冷却8min，终止反应；13)加入0.4mol/lnahco30.4ml调节上层液相的ph为4；14)加入2ml超纯水、0.2ml二十四烷及0.8ml乙酸乙酯，静置15min；15)快速吸取上层的有机相300400μl转移至新的离心管中，确保没有带入水；16)置于35℃的氮吹仪上吹干，将吹干的物质重新溶于300μl丙酮中；17)置于35℃的氮吹仪上吹干，将吹干的物质重新溶于500μl乙酸乙酯中，用0.22μm有机滤膜过滤；18)吸取过滤后的溶液200μl，向里面加入40μl吡啶，200μln,o-双三甲基硅基乙酰胺，在30℃室温下静置3h后，取2μl进行气相色谱-质谱联用仪分析；19)根据分子离子峰来定性，其中质荷比239为h木质素单体，质荷比269为g木质素单体,质荷比299为s木质素单体，根据内标二十四烷的浓度、内标峰面积，样品浓度、样品峰面积，从而计算出样品中三种木质素单体的含量。实施例31仪器：安捷伦5975cgc-ms仪器，色谱柱：安捷伦hp-5ms型的石英毛细管色谱柱，30mm×0.25mm×0.25μm。2样品：荞麦茎秆。3方法：1)小麦茎秆收获后在65℃的烘箱中完全烘干，用小型粉碎机粉碎后过60目筛；2)取0.07g样品置于5ml离心管中，加1.5ml80％乙醇，充分涡旋10min，10,000rpm离心10min，倒掉上清液，此步骤重复3次；3)加入1.5ml氯仿/甲醇为2:1的混合液，充分涡旋5min，10,000rpm离心10min，倒掉上清液；4)加入500ml丙酮，在30℃的氮吹仪上吹干；5)加入1.5mlph5.0的0.1mol/l的醋酸钠缓冲液，盖上盖子后，置于80℃的水浴锅中热击30min；6)置于-4℃的冰浴中冷却5min；7)加入35μl0.01％nan3，35μl淀粉酶，3μl支链淀粉酶，盖上盖子充分涡旋3min后，置于37℃的摇床上12h；8)100℃热击10min,终止消化，10,000rpm离心10min，倒掉上清液；9)加入500ml丙酮，在30℃的氮吹仪上吹干备用；10)称取上述吹干备用的样品5mg，置于密封性好的玻璃管中，加入1ml2.5％bf3,10％etsh，87.5％二氧六环混合液，轻轻摇晃，给玻璃管中充满氮气置换掉管中全部的空气后立马盖上盖子；11)在100℃条件下加热4h，每隔1h轻轻摇晃1次；12)置于冰上冷却5min，终止反应；13)加入0.4mol/lnahco30.3ml调节上层液相的ph为3；14)加入2ml超纯水、0.2ml二十四烷及0.8ml乙酸乙酯，静置15min；15)快速吸取上层的有机相300μl转移至新的离心管中，确保没有带入水；16)置于30℃的氮吹仪上吹干，将吹干的物质重新溶于200μl丙酮中；17)置于30℃的氮吹仪上吹干，将吹干的物质重新溶于500μl乙酸乙酯中，用0.22μm有机滤膜过滤；18)吸取过滤后的溶液100μl，向里面加入20μl吡啶，100μln,o-双三甲基硅基乙酰胺，在25℃室温下静置2h后，取2μl进行气相色谱-质谱联用仪分析；19)根据分子离子峰来定性，其中质荷比239为h木质素单体，质荷比269为g木质素单体,质荷比299为s木质素单体，根据内标二十四烷的浓度、内标峰面积，样品浓度、样品峰面积，从而计算出样品中三种木质素单体的含量。对油菜、小麦、荞麦衍生的h、g和s木质素单体可依据其分子离子峰做定性鉴定，结果见图1，2，3，从图1，2，3中可见，三种类型的木质素单体均能有效的被分离鉴定；对测定的油菜、小麦、荞麦的h、g和s木质素单体含量分析结果见表1，由表1可知油菜和荞麦的h木质素单体含量极少，小麦的h木质素单体含量较高。表1不同作物3种木质素单体的含量作物种类h-木质素(μmol/g)g-木质素(μmol/g)s-木质素(μmol/g)油菜0.56289.14377.03小麦32.12106.44117.79荞麦0.84176.88219.65当前第1页12