一种基于距离变化信号输出的可卡因便携检测装置及方法与流程

本发明涉及一种针对可卡因的即时定量便携检测新装置，属于可视化定量分析方法
技术领域：
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背景技术：
：核酸适体是能够与特定靶标进行特异性结合的寡核苷酸序列，是一种新型的分析、诊断分子。自出现以来，核酸适体便得到了越来越广泛的应用。相比于传统蛋白单克隆抗体，核酸适体具有易合成、更稳定、易修饰、亲和力强等优点(1、GoldL.，PoliskyB.，UhlenbeckO.，et.al.，Diversityofoligonucleotidefunctions,AnnualReviewofBiochemistry[J].1995,64.763-797；2、Van-ThuanNguyen，YoungSeopKwon，ManBockGu，Aptamer-basedenvironmentalbiosensorsforsmallmoleculecontaminants[J].2017,45:15–23；3、TarunKumarSharma，JohnG.Bruno，AbhijeetDhiman，ABCsofDNAaptamerandrelatedassaydevelopment[J].2017,35:275-301.)。基于这些优点，近数十年已经发展了纵多利用核酸适体构建的的生物传感器，用于多种小分子、蛋白或金属离子的定性或定量检测(4、S.Tombelli,M.Minunni,M.Mascini，Analyticalapplicationsofaptamers[J].2005,20:2424-2434.)。DNA水凝胶(DNAHydrogel)就是利用核酸适体的特异性实现对特定靶标的智能响应。水凝胶是以水为分散介质的凝胶，是在具有网状交联结构的水溶性高分子中引入一部分疏水基团和亲水残基，亲水残基与水分子结合，将水分子连接在网状内部，而疏水残基遇水膨胀的交联聚合物，是一种高分子网络体系，性质柔软，能保持一定的形状，能吸收大量的水。DNA水凝胶是由两条分别带有链A序列和链B序列的聚合物链通过一条与链A和链B皆能部分互补的Linker链进行交联后形成的胶状固体，当加入与Linker核酸适体特异性结合的靶标后，竞争夺取Linker，使胶状水凝胶瓦解，释放出包埋在水凝胶中的信号分子或信号启动物质，实现信号放大及输出(5、LiuJ，LiuH，KangH，et.al.，Aptamer-incorporatedhydrogelsforvisualdetection，controlleddrugrelease,andtargetedcancertherapy[J].AnalBioanalChem.2012,402:187–194；6、ZhiZhu，CuichenWu，HaipengLiu，et.al.，AnAptamerCross-LinkedHydrogelasaColorimetricPlatformforVisualDetection[J].Angew.Chem.Int.Ed.2010,49,1052-1056.)。即时诊断是一门实验医疗学科，近年来也日渐成熟成为一项重要的诊断技术。所谓即时诊断(PointofCareTest，POCT)，是指在能够在病人身旁快速获得诊断结果(7、PeterB.Luppa，CarolinMuller，AliceSchlichtiger，Point-of-caretesting(POCT):Currenttechniquesandfutureperspectives[J].TrendsinAnalyticalChemistry,2011,30:887-898.)。该技术方便、快捷，无需昂贵的实验仪器、设备、专业人员，亦不需要进行复杂的样品处理，而是仅仅依靠简单的设备来读出信号或者通过观察试纸上的条纹、斑点等颜色变化实现检测目的。即时诊断除应用于医院、诊所中以达到迅速获取病人信息外，也使疫情早期预警、家庭保健防护、贫困地区医疗以及食物、水、环境等的现场监测等成为可能。技术实现要素：本发明针对传统可卡因检测方法的操作复杂、成本高、所需仪器昂贵等问题，设计出了一种快速、低成本、特异性强的可卡因检测新装置及方法。本发明的技术方案为：一种基于距离变化信号输出的可卡因便携检测装置，其特征在于：包括一PCR管，管盖打孔，孔中连接上一短硅胶管；一长硅胶管，长硅胶管中封装有染料；一连接管，所述的连接管一端和长硅胶管连接，另一端能够插入短硅胶管；一用于测量距离的刻度工具。在本发明的较佳实施例中，所述的连接管为硬质管，例如聚四氟乙烯管。在本发明的较佳实施例中，所述的短硅胶管长度为0.5-2cm，长硅胶管的长度大于20cm(例如30cm。40cm,50cm,60cm,70cm,80cm)；连接管长度0.5-2cm。在本发明的较佳实施例中，所用的长、短硅胶管尺寸为：内径0.6-1.0mm，外径1.7-2.1mm，连接管的尺寸为：内径0.5-0.6mm，外径0.9-1.2mm。在本发明的较佳实施例中，长硅胶管中封装的染料，长度为0.5-2cm。本发明所用的PCR管，优选为200微升规格。本发明的又一技术方案为：一种基于距离变化信号输出的可卡因便携检测方法，包括如下步骤：(1)制备前述的便携装置；(2)设计并合成可卡因核酸适体及与其一末端部分序列互补的链A和与其另一末端部分序列互补的链B，并通过化学方法在链A、链B的远离互补序列的一端修饰上丙烯酰胺单体；(3)将修饰后的链A、链B分别与一定比例的丙烯酰胺单体聚合形成线状高分子聚合产物PS-A、PS-B；(4)将PS-A、PS-B、铂纳米颗粒、可卡因核酸适体链组装成水凝胶；(5)往水凝胶中缓慢加入可卡因样品液并充分孵育反应，在较佳的实施例中，可以为反应2-3小时；(6)吸取上清解胶液加入到含过氧化氢的检测装置的产气部分，迅速盖上管盖并连接长硅胶管，开始记时；(7)反应时间结束后拔下长硅胶管，用刻度尺测量染料移动距离，再结合标准曲线计算相应的可卡因浓度。在步骤(1)中，所用的长短硅胶尺寸为：内径0.8mm，外径1.9mm，聚四氟乙烯管的尺寸为：内径0.56mm，外径1.07mm。在步骤(4)中，水凝胶中链A、链B及Linker链的终浓度分别为110μM、110μM、77μM。在步骤(7)中，通过先断开产气部分可以保证每次测量时染料的起始位置相同，且可以通过产气反应结束时拔下长硅胶管来定格住距离信号值，便于后期距离的刻度测量。优选方法如下：(1)有机方法合成丙烯酸亚磷酰胺单体(2)5’端修饰有甲基丙烯基团的寡核苷酸分子的合成与纯化寡核苷酸的合成及修饰，所用方法是亚磷酰胺固相合成法。基本原理是以CPG共价结合的核苷单体作为3’端，再经过脱保护、活化、偶合、封闭、氧化五个不断循环的步骤，不断顺序结合上所需序列的核苷单体，直至完成整个寡核苷酸链的合成。DNA合成与修饰完成后，将DNA捅入2mL的离心管中，再加入氨水甲胺混合液约0.5mL，并用封口膜封口置于65℃下加热半小时，再用1mL枪头吸取液体成分于2mL离心管中，再用酒精沉淀法(3MNaCl溶液约60μL，无水乙醇约1.25mL，并置于-20℃下保存约30min，以促进其充分沉淀)，再用冷冻离心机在10℃、12000r/min下，离心5min，离心后去上清液，再加入200～400μL的0.1M的TEAA溶液(若是现配溶液需过膜除杂)，再振荡、离心，再用0.45μm截留分子量的针头膜过滤纯化，之后再过HPLC分离纯化，再真空抽干为固体，最后用乙酸约150μL于37℃孵育30min去除DMT(对苯二甲酸二甲酯)基团，再真空抽干，再用排阻色谱或超滤离心去掉小分子杂质(如乙酸)，再用紫外分光光度计定量DNA的纯度和浓度，再放置于-20℃下保存备用。(3)链A和链B的聚合首先，将修饰有甲基丙烯基团的链A和链B分别溶于超纯水中配制成高浓度DNA储存液；然后配制新鲜的10％的过硫酸铵和5％的TEMED，即0.05g过硫酸铵溶解至0.5ml超纯水和25μLTEMED溶解于0.475mL超纯水中；再将DNA与终浓度为4％的丙烯酰胺振荡混匀，放入真空干燥器中抽真空除气10min；再加入终浓度为1.4％的引发剂过硫酸铵和加速剂5％TEMED，混匀后将反应体系置于真空干燥器中，37℃条件下抽真空反应15min，从而得到链A和链B的线状高分子聚合产物PS-A、PS-B；最后，用超滤离心管过滤掉示聚合或聚合不完全的反应物，得到较纯的PS-A、PS-B。(4)组装搭建检测装置(5)可卡因特异性响应的定量便携检测将可卡因样品液与制备好的水凝胶孵育后，吸取一定量的解胶液加入到检测装置的产气PCR管中，与PCR管中的过氧化氢反应，立即盖上盖子，接上硅胶管，记时，反应时间结束后，拔下硅胶管，用刻度尺测量染料移动距离，并与标准曲线比较，得到样品的可卡因浓度值。本发明的优点在于：本发明的装置，1)所需材料，包括PCR管、硅胶管、聚四氟乙烯管、刻度尺、染料、502胶水均常见易得，且组装快捷，成本低廉。制备迅速，非常有利于可卡因的便携式现场检测，无需大型仪器。2)检测操作简单，3)结果证明本发明装置选择性好，检测结果可靠，4)检测结果通过刻度尺量染料移动距离即可，为可视化，便于工作人员现场检测。在方法上，该方法在设计上符合ASSURED(MartinezA.，PhillipsS.，WhitesidesG.，et.al.，DiagnosticsfortheDevelopingWorld:MicrofluidicPaper-BasedAnalyticalDevices,AnalyticalChemistry[J].2010,82.3-10.)的国际标准；另外，由于SELEX技术的不断发展，越来越多靶标的核酸适体被筛选出来，因此，改变水凝胶中的Linker-Aptamer序列，即可得到针对不同种靶标的定量便携检测。鉴于成本低廉、操作简单、检测迅速、用户友好以及装置的普适性好，该装置的可进一步发展用于更多临床靶标的定量便携可视化检测。附图说明图1为丙烯酸亚磷酰胺单体合成路线；图2-1、2-2、2-3分别为本发明检测装置检测原理和实物图；图3-1、3-2、表2为可卡因水凝胶PS-A、PS-B和Linker的比例优化结果；图4为实施例6中装置用于可卡因定量检测的工作曲线结果；图5为实施例7中装置对于可卡因及可卡因水解产物选择性实验结果；图6为实施例8中装置用于尿样中可卡因的定量检测结果；图7为实施例9中装置检测与标准LC/MS方法比较结果。具体实施方式实施例1丙烯酸亚磷酰胺单体的合成参见图1，丙烯酸亚磷酰胺单体的有机合成分为两个步骤：第一步：合成Acrydite-OH称取440mg(5mmol)2-甲基丙烯酸，1356mg(6mmol)DCC(二环己基碳二亚胺)，810mg(6mmol)HOBT(1-羟基苯并三唑),59.5mg(0.5mmol)DMAP(4-二甲氨基吡啶)及585mg(5mmol)氨基己醇于一50ml圆底烧瓶中，加磁子，后加入4mlDMF溶剂，用橡胶塞封口，氮气氛围下室温搅拌反应过夜。反应现象：有大量白色固体生成(DCU，1，3-二环己基脲)。后处理：先用棉花漏斗过滤除去沉淀，再水洗用乙酸乙酯萃取。目的是除去DMF(二甲基甲酰胺)。萃取收集有机相，用无水硫酸镁干燥半小时以上，再用滤芯漏斗抽滤后抽去大部分溶剂，保留3-4ml待过柱上样。稍后过柱纯化。产物点板情况：紫外显色，后用高锰酸钾溶液亦显色。第二步：合成Acrydite-phosphoramidite取213mg(1.15mmol)上步产物，抽排三次，加少量二氯甲烷溶解，在0℃温度下后滴加0.55mlDIPEA，最后滴加0.28mlP-(N-iPr2)2(OCH2CH2CN)，滴加完毕后，避光0℃反应约4小时。后处理：旋蒸除去二氯甲烷，直接上样过硅胶柱纯化。产物：碘缸和紫外都显色。得到的终产物为无色油状液体。终产物的核磁表征数据如下：1HNMR(500MHz,CDCl3):5.83(s,1H),5.65(s,1H),5.29(s,1H),3.85–3.76(m,2H),3.65–3.55(m,4H),3.32–3.27(q,2H),2.65–2.62(t,2H),1.954(s,1H),1.61–1.53(m,4H),1.41–1.34(m,4H),1.18–1.16(m,12H).31P(CDCl3):δ147.ESI-MS(m/z)[1+H]+386.2,found:386.4.实施例2甲基丙烯基团修饰的寡核苷酸分子的合成及纯化寡核苷酸的合成及修饰，所用方法是亚磷酰胺固相合成法。基本原理是以CPG共价结合的核苷单体作为3’端，再经过脱保护、活化、偶合、封闭、氧化五个不断循环的步骤，不断顺序结合上所需序列的核苷单体，直至完成整个寡核苷酸链的合成。DNA合成与修饰完成后，将DNA捅入2mL的离心管中，再加入氨水甲胺混合液约0.5mL，并用封口膜封口置于65℃下加热半小时，再用1mL枪头吸取液体成分于2mL离心管中，再用酒精沉淀法(3MNaCl溶液约60μL，无水乙醇约1.25mL，并置于-20℃下保存约30min，以促进其充分沉淀)，再用冷冻离心机在10℃、12000r/min下，离心5min，离心后去上清液，再加入200～400μL的0.1M的TEAA溶液(若是现配溶液需过膜除杂)，再振荡、离心，再用0.45μm截留分子量的针头膜过滤纯化，之后再过HPLC分离纯化，再真空抽干为固体，最后用乙酸约150μL于37℃孵育30min去除DMT(对苯二甲酸二甲酯)基团，再真空抽干，再用排阻色谱或超滤离心去掉小分子杂质(如乙酸)，再用紫外分光光度计定量DNA的纯度和浓度，再放置于-20℃下保存备用。具体合成的序列见表1。表1实施例2中所用DNA序列实施例3链A和链B的聚合首先，将修饰有甲基丙烯基团的链A和链B分别溶于超纯水中配制成高浓度DNA储存液；然后配制新鲜的10％的过硫酸铵和5％的TEMED，即0.05g过硫酸铵溶解至0.5ml超纯水和25μLTEMED溶解于0.475mL超纯水中；再将DNA与终浓度为4％的丙烯酰胺振荡混匀，放入真空干燥器中抽真空除气10min；再加入终浓度为1.4％的引发剂过硫酸铵和加速剂5％TEMED，混匀后将反应体系置于真空干燥器中，37℃条件下抽真空反应15min，从而得到链A和链B的线状高分子聚合产物PS-A、PS-B；最后，用超滤离心管过滤掉示聚合或聚合不完全的反应物，得到较纯的PS-A、PS-B。实施例4可卡因便携检测新装置的制作取一个200μL的PCR管，用打孔器在其管盖上打一个直径2mm的小圆孔，再用502胶水粘接上一小段1.5cm的短硅胶管，硅胶管伸入PCR管盖的距离尽量短。再剪一段长硅胶管(长度可根据需要调节)，用移液枪在长硅胶管一端注入5μL的色素染料，并用聚四氟乙烯管封住染料，再备用一把刻度尺，整个装置即制备完毕。装置如图2-1,2-2,2-3所示。实施例5可卡因水凝胶PS-A、PS-B和Linker的比例优化首先固定PS-A、PS-B的浓度均为110μM，尝试以44μM、66μM、77μM、88μM的Linker链浓度分别成胶，并以500μM的可卡因作为解胶液，对比成胶解胶情况，结果如图3所示。其中，图3-1为解胶前各比例水凝胶的图像结果，图3-2为以500μM的可卡因作为解胶液进行解胶后的图像结果，表2为图3-2各比例水凝胶解胶上清液的520nm吸收值。通过肉眼即可观察得知，当可卡因Linker链的浓度为77μM时，成胶与解胶的上清金纳米颗粒颜色深浅差异最大，故选择Linker链的浓度为77μM作为后续实验的成胶浓度。表2水凝胶解胶后上清吸收A520解胶后A5205:5:25:5:35:5:3.55:5:4实验0.1010.0460.0910.022Ctrl0.0980.0070.0030.003实施例6可卡因溶液检测实验准确配制5个可卡因浓度样品，一一使用本装置进行检测，并测量最终染料移动距离。检测结果如图4所示，线性方程为y＝0.72x+4.7，R2＝0.98。实施例7可卡因检测的选择性实验同时为了验证装置对可卡因的特异性检测，选择10倍于可卡因浓度的可卡因水解产物，进行检测，结果显示出装置对可卡因具有良好的选择性，结果如图5所示。实施例8尿样中可卡因检测实验为尝试装置对尿液环境中可卡因检测可行性，将尿液进行预处理后，稀释一倍，并在其中加入可卡因，配制成不同浓度点，而后利用新装置进行检测，结果如图6所示，线性方程为y＝0.69x+3.2，R2＝0.97，以3倍空白样品标准偏差比曲线斜率，得出检测限为5.6μM。实施例9装置检测方法与LC/MS方法比较实验为验证本装置的检测准确性，在尿液环境中配制相同8个可卡因浓度点分别用本装置和标准LC/MS方法进行检测，最终比对结果如图7所示，其线性方程为y＝0.997x-0.647，R2＝0.99，表明本方法具有良好的准确性。<110>厦门大学<120>一种基于距离变化信号输出的可卡因便携检测装置及方法<160>3<210>1<211>56<212>DNA<213>人工序列<400>1ACTCATCTGTGAATCTCGGGAGACAAGGATAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCTCCC56<210>2<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>2AAAATCACAGATGAGT16<210>3<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>3AAAAGTCTCCCGAGAT16当前第1页1 2 3