一种识别左奥硝唑的传感器的制备方法及其应用与流程

本发明属于电化学分析技术领域，具体涉及一种识别左奥硝唑的传感器的制备方法及其应用。

背景技术：

奥硝唑(onz)具有良好的抗厌氧菌、抗滴虫和抗阿米巴原虫作用，临床上主要用于手术前预防感染和手术后抗敏感厌氧菌的治疗。由于左旋奥硝唑(s-onz，简称为左奥硝唑)毒副作用较低，而右旋奥硝唑(r-onz，简称为右奥硝唑)对中枢神经细胞的毒性显著大于其左旋体，临床一般使用左奥硝唑。因此研究具有对映选择性检测onz的方法具有重要的实际意义。

已报道的onz测定方法主要有分光光度法、色谱法以及毛细管电泳法，但是分光光度法不能识别onz对映体，色谱法及毛细管电泳法虽有一定的对映选择性识别能力，但操作繁杂，电化学传感器方法虽然具有高选择性、低检出限、简便快捷等优点，但目前仅有关于非手性检测onz方面的报道。因此，急需发明出一种能够识别onz对映体的方法。

技术实现要素：

本发明提供了一种识别左奥硝唑的传感器的制备方法，解决了现有的奥硝唑测定方法不能识别奥硝唑对映体的问题。

本发明的第一个目的是提供一种识别左奥硝唑的传感器的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，玻碳电极的预处理

将玻碳电极打磨、抛光至表面呈镜面，然后依次用无水乙醇和质量浓度为38％的硝酸清洗，清洗干净后的玻碳电极浸入去离子水中，超声振荡清洗l～3min，得到抛光处理好的玻碳电极；

以抛光处理好的玻碳电极作为工作电极，将其置于浓度为0.1mol/l的磷酸缓冲溶液中，在-0.5～+1.4v的电位区间内循环扫描至伏安曲线稳定，得到活化玻碳电极；

步骤2，制备导电膜玻碳电极

将步骤1中的活化玻碳电极置于含有3-(苯氨基)丙基三甲氧基硅烷(paptms)和2-氨基苯硼酸(2-apba)的硫酸溶液中，然后在-0.5～0.9v的电位扫描范围内，以120～160mvs^-1的速率循环电位扫描20～22圈后，电极表面形成连有-si(och3)3和-b(oh)2基团的聚苯胺型导电膜，该电极即为导电膜玻碳电极，将所述导电膜玻碳电极用去离子水洗涤干净后备用；

其中，所述硫酸溶液中3-(苯氨基)丙基三甲氧基硅烷和2-氨基苯硼酸的浓度均为0.03～0.05mol/l，硫酸的浓度为0.2mol/l；

步骤3，制备复式分子印迹膜修饰玻碳电极

将氨丙基三甲氧基硅烷(aptms)、四乙氧基硅烷(teos)、5mmol/l的左奥硝唑的2-乙二醇乙醚溶液按照1：3：34～38的体积比混合均匀，然后于32～38℃下搅拌15～20min，再往其中加入相当于丙基三甲氧基硅烷体积2～3倍的、浓度为62.5mmol/l的naoh溶液，搅拌15～20min，形成溶胶，取15～18l溶胶均匀滴加到步骤2中制得的导电膜玻碳电极的表面，滴加完毕后于室温下静置15～20h，再将该导电膜玻碳电极用甲醇-醋酸溶液反复清洗至用差分脉冲伏安法检测不到左奥硝唑的还原峰为止，再用蒸馏水清洗电极，晾干后得到复式分子印迹膜修饰玻碳电极(b-dmim/cpe)；

步骤4，组装识别左奥硝唑的传感器

采用常规三电极电解池，以步骤3中得到的复式分子印迹膜修饰玻碳电极作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝作为对电极，组装成识别左奥硝唑的传感器。

优选的，所述步骤3中所用的甲醇-醋酸溶液由甲醇和醋酸按照8：2的体积比混合配制而成。

本发明的第二个目的是提供一种识别左奥硝唑的传感器在奥硝唑药剂、人血浆以及人新鲜尿液检测中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明以3-(苯氨基)丙基三甲氧基硅烷和2-氨基苯硼酸为电聚合单体、在玻碳电极表面电沉积连有-si(och3)3及-b(oh)2基团的聚苯胺型导电聚合物膜；然后在模板左奥硝唑的存在下，以氨丙基三甲氧基硅烷为功能单体、四乙氧基硅烷为交联剂，经溶胶-凝胶法在导电膜表面形成硅氧缩聚物分子印迹膜，最后组装成基于复式分子印迹膜识别的左奥硝唑传感器。本发明的制备工艺简单，成本低，制备出的传感器具有高选择性、低检出限、简便快捷，用所制备的传感器成功检测出了奥硝唑片剂和人血浆、尿中左奥硝唑的含量。

附图说明

图1为本发明的识别左奥硝唑的传感器的制备过程图；

图2为本发明制备出的复式分子印迹膜识别原理图；

图3为本发明实施例1制备出的识别左奥硝唑的传感器用于左奥硝唑测定的校正曲线图。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。

下述各实施例中所述实验方法和检测方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到。

实施例1

一种识别左奥硝唑的传感器的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，玻碳电极的预处理

将玻碳电极用磨砂纸打磨、抛光至玻碳电极的表面呈镜面，抛光完毕后，依次用无水乙醇和质量浓度为38％的硝酸清洗，清洗干净后的玻碳电极浸入去离子水中，超声振荡清洗3min，得到抛光处理好的玻碳电极；

以抛光处理好的玻碳电极作为工作电极，将其置于浓度为0.1mol/l的磷酸缓冲溶液中，在-0.5～+1.4v的电位区间内循环扫描至伏安曲线稳定，得到活化玻碳电极；

步骤2，制备导电膜玻碳电极

将步骤1中的活化玻碳电极置于含有3-(苯氨基)丙基三甲氧基硅烷和2-氨基苯硼酸的硫酸溶液中，然后在-0.5～0.9v的电位扫描范围内，以140mvs^-1的速率循环电位扫描20圈后，电极表面形成连有-si(och3)3和-b(oh)2基团的聚苯胺型导电膜，该电极即为导电膜玻碳电极，将所述导电膜玻碳电极用去离子水洗涤干净后备用；

其中，硫酸溶液中3-(苯氨基)丙基三甲氧基硅烷和2-氨基苯硼酸的浓度均为0.05mol/l，硫酸的浓度为0.2mol/l；

步骤3，制备复式分子印迹膜修饰玻碳电极

将氨丙基三甲氧基硅烷、四乙氧基硅烷、5mmol/l的左奥硝唑的2-乙二醇乙醚溶液按照1：3：36的体积比混合均匀，然后于35℃下搅拌15min，再往其中加入相当于丙基三甲氧基硅烷体积2倍的、浓度为62.5mmol/l的naoh溶液，搅拌20min，形成溶胶，取18l溶胶均匀滴加到步骤2中制得的导电膜玻碳电极的表面，滴加完毕后于室温下静置20h，再将该导电膜玻碳电极用甲醇-醋酸溶液反复清洗至用差分脉冲伏安法检测不到左奥硝唑的还原峰为止，再用蒸馏水清洗电极，晾干后得到复式分子印迹膜修饰玻碳电极；

其中，甲醇-醋酸溶液由甲醇和醋酸按照8：2的体积比混合配制而成；

步骤4，组装识别左奥硝唑的传感器

采用常规三电极电解池，以步骤3中得到的复式分子印迹膜修饰玻碳电极作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝作为对电极，组装成识别左奥硝唑的传感器。

实施例2

一种识别左奥硝唑的传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，玻碳电极的预处理

将玻碳电极用磨砂纸打磨、抛光至玻碳电极的表面呈镜面，抛光完毕后，依次用无水乙醇和质量浓度为38％的硝酸清洗，清洗干净后的玻碳电极浸入去离子水中，超声振荡清洗2min，得到抛光处理好的玻碳电极；

以抛光处理好的玻碳电极作为工作电极，将其置于浓度为0.1mol/l的磷酸缓冲溶液中，在-0.5～+1.4v的电位区间内循环扫描至伏安曲线稳定，得到活化玻碳电极；

步骤2，制备导电膜玻碳电极

将步骤1中的活化玻碳电极置于含有3-(苯氨基)丙基三甲氧基硅烷和2-氨基苯硼酸的硫酸溶液中，然后在-0.5～0.9v的电位扫描范围内，以160mvs^-1的速率循环电位扫描22圈后，电极表面形成连有-si(och3)3和-b(oh)2基团的聚苯胺型导电膜，该电极即为导电膜玻碳电极，将所述导电膜玻碳电极用去离子水洗涤干净后备用；

其中，硫酸溶液中3-(苯氨基)丙基三甲氧基硅烷和2-氨基苯硼酸的浓度均为0.03mol/l，硫酸的浓度为0.2mol/l；

步骤3，制备复式分子印迹膜修饰玻碳电极

将氨丙基三甲氧基硅烷、四乙氧基硅烷、5mmol/l的左奥硝唑的2-乙二醇乙醚溶液按照1：3：38的体积比混合均匀，然后于38℃下搅拌20min，再往其中加入相当于丙基三甲氧基硅烷体积3倍的、浓度为62.5mmol/l的naoh溶液，搅拌18min，形成溶胶，取15l溶胶均匀滴加到步骤2中制得的导电膜玻碳电极的表面，滴加完毕后于室温下静置18h，再将该导电膜玻碳电极用甲醇-醋酸溶液反复清洗至用差分脉冲伏安法检测不到左奥硝唑的还原峰为止，再用蒸馏水清洗电极，晾干后得到复式分子印迹膜修饰玻碳电极；

其中，甲醇-醋酸溶液由甲醇和醋酸按照8：2的体积比混合配制而成；

步骤4，组装识别左奥硝唑的传感器

采用常规三电极电解池，以步骤3中得到的复式分子印迹膜修饰玻碳电极作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝作为对电极，组装成识别左奥硝唑的传感器。

实施例1-2均制备出了基于复式分子印迹膜识别的左奥硝唑传感器，该传感器的制备过程见图1，图2则为本发明制备出的的复式分子印迹膜识别原理图，从图2可以分析出本发明的反应机理，具体如下：

左奥硝唑分子中的-no2与硅氧缩聚物层的-nh2产生氢键相互作用、其烃基可与含-b(oh)2基团的复式分子印迹膜中的亚丙基发生疏水相互作用，咪唑环可与导电聚合物层的苯环发生π-π堆积作用。除此之外，左奥硝唑分子中带孤电子对的n原子还可以与含-b(oh)2基团的复式分子印迹膜中的路易斯酸中心-b(oh)2形成配位相互作用，因此，印迹过程在含-b(oh)2基团的复式分子印迹膜中构建了与模板分子在形状、大小及官能团等方面具有互补性相互作用的印迹位点，从而赋予了含-b(oh)2基团的复式分子印迹膜传感器手性识别左奥硝唑的能力，也因此建立了灵敏度更高、选择性更好的新方法。

由于实施例1和实施例2制备出的传感器的性能基本相同，因此仅以实施例1制备出的传感器应用于奥硝唑片剂和人血浆、人新鲜尿液中左奥硝唑的检测，具体检测过程及结果如下：

1、组装左奥硝唑检测系统

以chi660c电化学工作站为电化学检测装置，将其和实施例1中制备出的识别左奥硝唑的传感器组装成用于检测奥硝唑片剂和人血浆、人新鲜尿液中左奥硝唑的检测系统。

2、建立校正曲线及校正曲线方程

用无水乙醇配制浓度为30mmol/l的左奥硝唑溶液，再用ph为5的br缓冲液将其稀释成不同浓度的左奥硝唑系列标准溶液，用实施例1的传感器测定系列标准液中左奥硝唑含量，采用差分脉冲伏安法(differentialpulsevoltammetry，dpv)测定。检测前，电解质溶液通氮10min除氧，然后将工作电极浸入任意一个浓度的左奥硝唑标准溶液中预富集10min，取出后用蒸馏水洗去可能吸附的杂质，再用氮气干燥，干燥完毕再将其放入ph为5的br缓冲液中，用dpv从0.0v扫描至-1.0v，脉冲幅度为120mv，脉冲宽度为150ms，电位增量为20mv，记录扫描的伏安数据。以同一浓度左奥硝唑标准液平行测定三次的ip平均值为纵坐标，以对应的标准溶液浓度c为横坐标，作校正曲线，并建立校正曲线方程，具体校正曲线见图3，其中，a→n表示a、b、c……n的14个曲线，分别对应校正曲线上从小到大的14种浓度标准溶液的dpv图，对应的校正曲线方程如下：

ip(μa)＝4.39+0.0565c(μmol/l)

该曲线方程的相关系数r＝0.997，检测限为1.0×10^-8mol/l。

3、实施例1的传感器对奥硝唑片剂、人血浆以及人新鲜尿液中左奥硝唑的检测。

(1)样品的预处理：

奥硝唑片剂的预处理：取奥硝唑片剂研磨成粉，然后从粉状奥硝唑中称取0.1g溶于20ml乙醇中，超声助溶10min后过0.46μm滤膜，滤液转移到100ml容量瓶中，用乙醇稀释至刻度，然后取20μl该溶液加入到5ml的ph为5的br缓冲溶液中，作为供试液。

人血浆的预处理：将2ml人血浆与2ml乙醇置于10ml的试管中，漩涡30s，5000rpm离心5min，取上清液用ph5的b-r缓冲液稀释定容至20ml，用作供试液。

人新鲜尿液的预处理：取新鲜尿液1ml用ph为5的b-r缓冲液稀释定容至20ml作为供试液。

(2)样品的测定：

测定方法与建立校正曲线时的测定方法相同，只是测定对象不是标准溶液，而是待测药物的供试液。对于每一种样品，均平行测定三次得到的ip平均值，将该ip值与校正曲线比对，读出对应的c值；或将ip值代入校正曲线方程，计算出左奥硝唑的浓度c，然后换算成左奥硝唑的含量；

加标回收率的计算：取两份完全相同的样品，其中一份加入定量的左奥硝唑标准样，然后采用上述检测方法对两份样品进行含量检测，并按下式计算加标回收率r：

r＝(加标试样测定值-试样测定值)/加标量*100％

具体实验结果见表1：

表1实施例1的传感器检测左奥硝唑含量结果

表1中，a代表的含义是奥硝唑片剂中左奥硝唑含量以mg/片表示；b代表的含义是血浆和尿液中左奥硝唑浓度以μmol/l表示。

高效液相色谱法是分析奥硝唑含量最常用的方法，但是从表1中可以看出，实施例1的左奥硝唑传感器检测结果与高效液相色谱法的检测结果比较无显著性差异，且操作方法更为简单，综合考虑可作为左奥硝唑分析的最佳分析方法。

需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例1-2相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内也意图包含这些改动和变型在内。