一种多功能电化学传感器及其制备方法与流程

本发明属于电化学领域，具体涉及一种同时俘获，杀菌，检测的多功能电化学传感器及其制备方法。

背景技术：

每年有许多人死于细菌水污染，如“超级细菌”污染等等。如果细菌污染能够被很快的诊断出来并且细菌被快速清除杀死，那么细菌感染的死亡率将大大降低[1]。

电化学生物传感器是基于固体电极和生物敏感分子建立的一种分析方法。因为电化学传感器具有，高效，简单，易于操作成本低等优点电化学传感器，目前已经被广泛应用于分析dna[2]和病毒[3]等。而在在众多的细菌检测技术中，电化学生物传感器引起广泛的关注，例如，mireia等人[4]报道了一种基于多肽识别细菌的电化学传感器检测致病菌。但是目前的电化学传感器只能进行简单的检测细菌，不能具有同时清除，检测，杀菌的多功能。因此，急需开发一种同时俘获，杀菌，检测的多功能电化学生物传感器。

[1]m.e.brecher,s.n.hay,bacterialcontaminationofbloodcomponents.[j].clinicalmicrobiologyreviews2005,18(1),195-204.

[2]x。li,j.guo,q.zhai,j.xia,g.yi.[j].ultrasensitiveelectrochemicalbiosensorforspecificdetectionofdnabasedonmolecularbeaconmediatedcircularstranddisplacementpolymerizationandhyperbranchedrollingcircleamplification.[j].analyticachimicaacta934(2016)52-58

[3]k.shang,x.wang,b.sun,zcheng,s.ai,β-cyclodextrin-ferrocenehost–guestcomplexmultifunctionallabelingtripleamplificationstrategyforelectrochemicalimmunoassayofsubgroupjofavianleukosisviruses.[j].biosensorsandbioelectronics45(2013)40-45.

[4]h.nmireia,b.o.sergi,n.abramova,f.x.a.bratov,m.m.carlos,f.j.gil.impedimetricantimicrobialpeptide-basedsensorfortheearlydetectionofperiodontopathogenicbacteria.[j].biosensorsandbioelectronics86(2016)377–385.

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术中存在的问题，提供一种同时俘获，杀菌，检测的多功能电化学传感器及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案实施：

一种多功能电化学传感器，所述传感器为负载有agnps(尺寸为5～200nm)和万古霉素的zno纳米棒；其中，agnps与万古霉素的质量比为1:1-1:6。

所述agnps作为杀菌单元，万古霉素作为识别单位。

一种权利要求1所述的多功能电化学传感器的制备方法：

(1)zno纳米棒的制备：将清洗后的fto用铝片覆盖，之后将铝片覆盖的fto浸入到将zn(no3)2·6h2o和六亚甲基四胺溶液中，在60-90℃水浴反应1～4h，待用；

(2)agnps/zno/fto的制备:将上述获得zno纳米棒浸入到agno3溶液中；而后利用循环伏安法在浸泡过agno3的zno纳米棒上还原生成纳米银；

(3)van/agnps/zno/fto多功能传感器的制备：将步骤(2)中得到agnps/zno/fto依次分别浸入到巯基乙酸溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)/n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和万古霉素溶液中；所述edc/nhs摩尔量比为2/1；其中，edc和nhs的终浓度均为5～50mm。

所述agnps与万古霉素的质量比为1:1～1:6。

所述清洗后的fto为将fto依次分别用丙酮，乙醇/水的naoh混合溶液，超纯水超声清洗10～15min；其中，乙醇/水的naoh混合溶中naoh浓度为1-2m，乙醇与水的比例为v/v＝1:1。

所述步骤(1)中水浴后将溶液冷却至室温，经双蒸水冲洗，冲洗后于30～40℃干燥2～10h后，得到具有柱状结构的zno修饰的fto，即zno纳米棒。

所述步骤(1)中zn(no3)2·6h2o为zn(no3)2·6h2o将加入到超纯水中磁力搅拌至完全溶液；六亚甲基四胺溶液为将六亚甲基四胺加入到超纯水中磁力搅拌至完全溶液；zn(no3)2·6h2o和六亚甲基四胺溶液按等体积混合。

所述步骤(2)中所述浸泡过agno3的zno纳米棒在电压-0.8～0下循环伏安法扫描，扫描速率10mv/s，扫描段数10段；之后采用双蒸水清洗，最后30～40℃干燥2～10h后可得到agnps@zno/fto。

所述步骤(3)中agnps/zno/fto于巯基乙酸溶液中浸泡2～12h，在于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)/n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)中浸泡2～5h，最后于含有3mg的万古霉素水溶液中2～5h。

一种van/agnps/zno/fto多功能传感器的应用，所述van/agnps/zno/fto电极作为电化学传感器在检测细菌或作为杀菌剂中的应用。

所述万古霉素功能化的agnps@zno/fto多功能传感器清除溶液细菌的应用。

所述万古霉素功能化的agnps@zno/fto在水体细菌检测中的应用。

所述水体中的细菌为革兰阳氏细菌，例如金黄色葡萄球菌，白色葡萄球菌等。

万古霉素功能化的agnps@zno/fto多功能传感器应用于水体中，以下仅以对有害微生物金黄色葡萄糖球菌(staphylococcusaureus)的检测为例，清除，杀灭，采用chi760c电化学工作站检测；

其检测具体方法为：采用chi760c电化学工作站，以pt片为对电极，以饱和甘汞电极作为参比电极，以制备的多功能传感器为工作电极；将不同多功能传感器浸入到一系列浓度的微生物溶液中10～30min，之后在检测液中行电化学测量。所述的细菌浓度为10²～10⁶cfu/ml；所述检测液为5mm[fe(cn)6]^3-/4-溶液，ph值为7.4。

其清除具体方法为：将制备的传感器浸入到细菌溶液中10～30min，之后将溶液通过平板计数法测定剩余细菌浓度，计算清除率。所述细菌浓度为500cfu/ml。

其杀菌活性具体方法为：将制备传感器浸入到细菌溶液中2～12h，通过平板计数法测定存活细菌浓度，计算杀灭率。所述细菌浓度为10⁶cfu/ml。

本发明的有益效果在于：

本发明将agnps和万古霉素结合起来，纳米银(agnps)能够通过释放ag⁺破坏细菌细胞膜引起细胞死亡，因此agnps具有高效的抗菌效果且其具有低毒性。同时，万古霉素作为一种抗生素，对多种细菌具有杀菌效果，同时其具有的氨基和羧基基团能够与细菌细胞壁上的肽聚糖形成氢键，从而起到俘获细菌的作用，因此，将万古霉素和agnps结合起来能够起到协同杀菌的作用，可大大提高其杀菌效果，将检测，清楚，杀菌的功能结合起来，可以扩展传感器的应用范围，对开发新型传感器有重要意义；具体：

(1)本发明通过将万古霉素与agnps@zno/fto结合起来，得到了万古霉素功能化的agnps@zno/fto多功能传感器，制备方法工艺简单，易于控制、成本低廉；

(2)本发明制备的万古霉素功能化的agnps@zno/fto传感器，具有检测，清除，杀菌的多功能；

(3)本发明制备的万古霉素功能化的agnps@zno/fto传感器能够快速检测水体中的细菌含量，检测限为100cfu/ml；

(4)本发明制备的万古霉素功能化的agnps@zno/fto传感器能够快速清除水体中的细菌，1h内清除率为40％；

(5)本发明制备的万古霉素功能化的agnps@zno/fto传感器具有高效杀菌效果，对浓度为10⁶cfu/ml的微生物12h内杀灭率可达到99.99％

(6)本发明制备的万古霉素功能化的agnps@zno/fto传感器具有良好的稳定性和重复利用性，在水体净化和医学诊断等领域有很好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例提供的样品的sem图，其中，(a)zno/fto，(b)agnps@zno/fto；

图2为本发明实施例提供的多功能传感器对不同浓度的细菌的检测标准曲线图；

图3为本发明实施例提供的样品对金黄色葡萄球菌的的杀菌率(a)和分离效率(b)，其中：a图中纵坐标为antibacterialrate(杀菌率)，单位为％；b图中横坐标为俘获细菌量，纵坐标为分离效率，单位为％。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明作进一步说明，有助于本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

本发明属于电化学领域，具体涉及一种同时俘获，杀菌，检测的多功能电化学传感器及其制备方法。所述传感器由万古霉素，纳米银，zno纳米棒组成。首先制备在fto电极表面制备3d柱状zno材料，然后利用电还原法在zno表面修饰纳米银，再通过巯基乙酸与万古霉素反应将万古霉素接入电极表面。对水体中有害微生物具有高效的杀灭效果，在水体净化等领域将具有很好的应用前景。

实施例1：

万古霉素功能化的agnps@zno/fto多功能传感器的制备方法：

(1)zno/fto的制备：将50mmzn(no3)2·6h2o加入超纯水中，磁力搅拌至完全溶解，命名为溶液a；同时将50mm六亚甲基四胺加入到超纯水中磁力搅拌至完全溶液，命名为溶液b；然后将溶液a和溶液b等体积混合。之后将铝片包裹的清洗后的fto浸入到上述混合溶液中，导电面垂直朝下放置，放入90℃水浴中反应3h；而后将溶液冷却至室温，将fto拿出，经冲洗和40℃干燥6h后，可得到具有柱状结构的zno修饰的fto(如图1a)；

所述清洗后的fto为将fto依次分别用丙酮，乙醇/水的naoh混合溶液，超纯水超声清洗10～15min；其中，乙醇/水的naoh混合溶中naoh浓度为1m，乙醇与水的比例为v/v＝1:1。

(2)agnps@zno/fto的制备：将步骤(1)中得到的zno/fto浸入到含有10ml0.25mm的agno3溶液通过循环伏安法沉积纳米银，之后采用双蒸水清洗，最后40℃干燥6h后可得到agnps@zno/fto(参见图1b)；

所述浸泡过agno3的zno纳米棒在电压-0.8～0下循环伏安法扫描，扫描速率10mv/s，扫描段数10段。

(3)万古霉素功能化的agnps@zno/fto的制备：将步骤(2)中得到的agnps@zno/fto浸入到巯基乙酸溶液中2h，冲洗后将其浸入到50mmedc/nhs溶液中2h。再将其浸入到含有3mg的万古霉素溶液中2h。得到的电极为van/agnps@zno/fto。

所述巯基乙酸溶液浓度为5mm；edc和nhs的终浓度为50mm，其中edc/nhs两者之间用量2:1。

实施例2：上述所得多功能传感器应用于水体中，对有害微生物金黄色葡萄球菌的检测性能。

以金黄色葡萄球菌(500～10⁶)评价万古霉素功能化的agnps@zno/fto多功能传感器：

首先准备细菌悬液，将金黄色葡萄球菌储存液接种到灭菌lb液体培养基中，然后将其置于37℃、150rpm的空气恒温摇床中，过夜培养。培养得到的细菌悬液离心后悬浮于0.01mol/lpbs(ph＝7.4)缓冲液中，得到浓度为1×10⁸cfu/ml的金黄色葡萄球菌悬液，待用

检测实验中用灭菌0.01mol/lpbs(ph＝7.4)缓冲液将上述细菌悬液稀释到100～10⁶cfu/ml浓度梯度，之后将本发明制备的多功能传感器分别浸入到不同浓度的菌液中1h。之后将多功能传感器清洗后浸入到5mm铁氰化钾溶液中进行交流阻抗测量。实验中每组实验均需平行测定3次，取平均值作为最后结果(参见图2)。

由图2可以看出阻抗值的变化与lgc成线性关系，线性回归方程为：y＝724.5lgc–1342.42(r＝0.9987)

实施例3：

上述所得万古霉素功能化的ag@zno/fto多功能传感器对水体中有害微生物金黄色葡萄球菌的杀灭和分离作用。

杀菌实验：

取取金黄色葡萄球菌原液用灭菌0.01mol/lpbs(ph＝7.4)缓冲液稀释到10⁶cfu/ml。将稀释后的菌液置于5ml反应器中，加入将实施例1中制备的多功能传感器浸入菌液中，反应12h后取1.0ml反应液，用0.01mol/lpbs(ph＝7.4)缓冲液按照系列稀释法依次稀释几个梯度(10，100，100倍)，然后从不同稀释倍数的溶液中分别取100μl至已经准备好的lb固体培养基上，将菌液均匀地涂抹在lb培养基上。将lb培养基倒置，放入电热恒温培养箱中37℃培养24h，通过计数培养基上长出的菌落个数，以及相应稀释倍数得出细菌浓度，以确定细菌的存活率和杀菌率。实验中每组实验均需平行测定3次，取平均值作为最后结果，空白实验作为对照组(参见图3a)。

由图3(a)可以看出所制备的van/ag@zno/fto在24h的杀菌率为99.99％，远高于空白对照组和zno/fto的杀菌率。细菌分离实验：

取金黄色葡萄球菌原液用灭菌0.01mol/lpbs(ph＝7.4)缓冲液分别稀释至500和1000cfu/ml，之后放入1ml反应器中，将制备的多功能传感器浸入到菌液中，将由图3(b)可见，制备的多功能传感器显示出良好的细菌分离作用。