一种提取两面针中药牙膏中毛两面针素的方法与流程

本发明属于毛两面针素的提取领域，尤其是一种提取两面针中药牙膏中毛两面针素的方法。

背景技术：

两面针，为芸香科植物两面针zanthoxylumnitidum(roxb.)dc.的干燥根,可活血化瘀，行气止痛，祛风通络，解毒消肿，不能过量服用^[1]，毛两面针为其变种^[2]，两面针药材在化学成分及含量上均有别于毛两面针。毛两面针素又名飞龙掌血内酯，为毛两面针及飞龙掌血根特有成分；氯化两面针碱为两面针主要效用成分之一；存在于药材两面针、毛两面针及飞龙掌血中，但在三者中含量有所不同^[3-5]。《中国药典》2015版一部两面针的检查项下明确规定不得检出毛两面针素。

两面针中药牙膏是添加中药两面针提取物作为日常维护口腔健康的中药牙膏，具有消炎止血，镇痛抗菌，清热降火的功效^[6]。用于牙龈出血，牙龈肿痛。

毛两面针素在两面针牙膏中的含量紧紧关联着两面针牙膏的质量和有效性，有研究发现药材市场上主流药材并非药典所规定品种，而以毛两面针为主，可能出现用毛两面针药材替代两面针投料的情况^[3]。尽管目前有研究发现对毛两面针素含量极高的飞龙掌血药材和毛两面针素对照品进行急性毒性评价，未观察到毒性反应^[7]，但目前并没有研究表明毛两面针或飞龙掌血可替代两面针投料，为了保证添加功效成分来源的纯正性，两面针中药牙膏仍应不得检出毛两面针素。目前对两面针及毛两面针药材主要成分的含量测定^[3]与牙膏中有效成分的含量测定^[4]已有相关研究报道，但尚未见有对两面针牙膏中毛两面针素的含量测定方法进行报道。

由药典^[1]可知，两面针的检查项下明确规定不得检出毛两面针素，而在本实验三批样品中毛两面针素含量的结果(见表6)发现其中一批样品中检出微量的毛两面针素，为不合格样品。其余两批不同样品皆为添加了两面针提取物的中药牙膏，在含量测定项下的结果显示未检出毛两面针素，原因可能为不含毛两面针素或毛两面针素含量极微并低于检出限。

目前，两面针的质量控制指标尚未完善，在制备两面针中药牙膏时选用的两面针药材的质量会有所差别，但两面针牙膏配方工艺严格保密，其质量标准也未见有相关的报道，所以在原料药两面针的选取上也会对两面针牙膏中两面针功效成分的含量及真伪造成影响。

因此建立反相高效液相色谱法测定两面针中药牙膏中毛两面针素的含量对控制该牙膏的质量和保证其日常使用的有效性、安全性有着重要的意义。

技术实现要素：

针对上述不足，本发明旨在提供一种提取两面针中药牙膏中毛两面针素的方法，该方法具有操作简便、迅速、准确、干扰少、精密度与重复性较好等优点，可为测定两面针中药牙膏中毛两面针素的含量提供实验依据。

为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是这样的：一种提取两面针中药牙膏中毛两面针素的方法，依次包括下述步骤：

步骤1：称取两面针牙膏2g，与20ml浓度为80％的甲醇混合，称定重量m1；

步骤2：搅拌30min，称定重量，并用浓度为80％的甲醇补足至m1；

步骤3：超声30min，冷却，称定重量，并用浓度为80％的甲醇补足至m1，离心，冷藏静置10min；

步骤4：取上清液1.5-2ml，离心5min，过滤，即得。

优选地，步骤3所述的超声处理的参数为100w、80hz。

优选地，步骤3所述的离心参数为：4000r/min，5min。

优选地，步骤4所述的离心参数为：15000r/min，5min。

优选地，步骤4所述的过滤具体为：用0.22μm微孔滤膜过滤

本发明与传统方法相比，具有以下优点：

(1)由于毛两面针素易溶于极性较大的有机溶剂甲醇^[9]，牙膏中的其他主要组成部分如粘合剂(纤维素衍生物及其他物质)与摩擦剂等不溶于有机溶剂,但如果在膏体中直接加入甲醇，则膏体会凝聚成团，被测成分被包裹在体内而难以溶出，故本文分别不同体积分数的70％甲醇、75％甲醇、80％甲醇、85％甲醇、90％甲醇溶液对样品进行提取，其他处理方法不变，结果分析表明，用80％甲醇作为提取溶剂，毛两面针素峰面积明显比其余不同体积分数的溶剂所得峰面积要大，且具有良好峰型，所以选用80％甲醇作为提取溶剂。

(2)参考文献中牙膏有效成分的提取一般为磁力搅拌及超声各30min，水浴回流30min等，以毛两面针素的含量为指标，分别考察比较两种提取方法，方法分别为：①磁力搅拌30min+超声30min、②磁力搅拌30min+水浴回流30min，其他处理条件不变。结果表明：两者待测成分提取量相差不大，但水浴回流效果较差。分析原因可能在于牙膏不易分散均匀，待测物溶出不足，水浴回流需要多次转移样品溶液易造成损失，操作不够简便，故排除水浴回流选用方法①作为提取方法。

(3)在选用提取方法为磁力搅拌30min条件下，进一步比较了超声20min、超声40min、超声50min、超声60min与超声30min三者的峰面积的差别,结果显示，超声20min得到的峰面积较小，超声40min、超声50min、超声60min所得的峰面积皆较超声30min小，故确定选用超声30min作为提取方法。

(4)本发明所述的测定方法具有操作简便、迅速、准确、干扰少、精密度与重复性较好等优点，可为测定两面针中药牙膏中毛两面针素的含量提供实验依据。

附图说明

图1为毛两面针素及氯化两面针碱混合标准对照溶液的色谱图；

图2为毛两面针素对照品溶液的色谱图；

图3为供试品溶液的色谱图；

图4为加标供试品溶液的色谱图；

图5为阴性对照的色谱图；

图6为毛两面针素浓度(μg/ml)-峰面积线性回归曲线图；

图7为毛两面针素及氯化两面针碱分子结构式；

图8为提取溶剂选择的比较结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的权利要求书做进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明的权利要求保护范围内所做的任何修改、等同替换仍属于本发明所要保护的范围内。

实施例1

1仪器与试药

1.1仪器

安捷伦生物惰性四元液相色谱仪(仪器型号：agilent1260；厂家：agilenttechnology)；

二极管阵列检测器(dad)；

电子分析天平(仪器型号：cpa225d；厂家：赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；

超声波清洗器(仪器型号：elmasonicp180h；厂家：德国elmaschmidbauergmbh)；

超纯水仪(仪器型号：elgapurelabclassicuvf；厂家：法国威立雅集团)；

加热磁力搅拌器(仪器型号：c-maghs7；厂家：德国ika)；

高性能通用台式离心机(仪器型号：allegrax-15r；厂家：美国贝克曼公司)；

台式冷冻离心机(仪器型号：3k15；厂家：德国sigma)。

1.2试药

毛两面针素对照品(由中国食品药品检定研究院提供，批号为200001，供含量测定用)；

氯化两面针碱对照品(中国食品药品检定研究院批号110848-200502，供含量测定用)；

两面针中药牙膏样品(由某制药公司提供，产品批号分别为b20190216a1、g20190524b1、f20190612b1，本文中方法学采用产品批号为b20190216a1的两面针牙膏样品)；

甲醇(omnichem色谱纯)；

乙腈(omnichem色谱纯)；

甲酸(广东光华科技股份有限公司分析纯)；

超纯水。

2实验方法及结果

2.1色谱条件

色谱柱：采用agilentzorbaxsb-c18(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相a为0.1％甲酸水溶液，流动相b为乙腈，等梯度洗脱6min，a为60％，b为40％；

流速：1.0ml/min；

进样量1μl；

柱温35℃；

检测波长为328nm；

此色谱条件下氯化两面针碱与毛两面针素可很好分离，干扰性小；理论塔板数按氯化两面针碱峰计算，应不低于5000，待测组分与相邻共存物之间的分离度应大于1.5。

2.2对照品与供试品的制备

2.2.1对照品溶液的制备

精密称取毛两面针素对照品适量，加入80％甲醇配制成每1ml含0.1036μg的溶液；另精密称取氯化两面针碱对照品适量，加入80％甲醇与毛两面针素对照品配制成每1ml含0.5μg的混合标准对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备

取供试品约2g，精密称定，置具塞锥形杯中，精密加入80％甲醇20ml,称定重量，磁力搅拌30min，称定重量，超声处理30min(100w，80hz，下文出现的皆同此)，放冷，再称定重量，后两次称定后皆用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，将样品转移至50ml离心管中，4000r/min离心分离5min，冰柜冷藏静置10min，取上清液1.5ml至2ml离心管中，15000r/min离心分离5min，上清液用0.22μm微孔膜滤过即得供试品溶液。

2.3系统适用性考察

按2.1项下的色谱条件对供试品溶液与对照品溶液进行测定，得到相应的色谱图(见图1)。结果表明：两面针牙膏供试品溶液的色谱图在与毛两面针素对照品相应保留时间处未出现明显毛两面针素的色谱峰，但是对供试品进行加样(加入毛两面针素标准对照品溶液15μl，浓度：0.4144mg/ml)同法处理供试品，加样供试品溶液的色谱图在与毛两面针素对照品相应保留时间处出现明显毛两面针素的色谱峰,说明该色谱条件适用于毛两面针素成分的分析与测定。

2.4线性关系考察

取毛两面针素对照品10.36mg(含量按100％计)，精密称定，加80％甲醇25ml(浓度：0.4144mg/ml)作为储备液，再精密吸取0.25ml置10ml容量瓶中，加80％甲醇稀释至刻度(浓度：1.036μg/ml)，然后分别精密吸取该溶液0.5ml、1ml、2ml、4ml、8ml置10ml容量瓶中，加入80％甲醇稀释至刻度，摇匀，并依照上述方法测定，结果详见表1。

以浓度(μg/ml)-峰面积进行线性回归，求得回归方程：y＝0.455x+5e-05，r2＝0.9997。毛两面针素在0.0518～0.8288μg/ml范围内呈良好的线性关系，详见图2。

表1线性实验结果

2.5精密度试验

取浓度为0.4144μg/ml的对照品溶液，按上述色谱条件连续测定6次，所得平均峰面积为0.0842，rsd＝0.35％，详见表2。

结果表明，本方法的精密度较好。

表2精密度实验结果

2.6稳定性试验

取样品(批号：b20190216a1)约2g，精密称定，按2.2.2项下的供试品制备方法制备供试品溶液。以1μl为进样量，测定样品中毛两面针素的峰面积。并每隔一定的时间测定一次，共测5次，详见表3。

结果表明，在10h内，被测物稳定。

表3稳定性实验结果

2.7重复性试验

取相同批号的样品(批号：b20190216a1)2g，共6份，精密称定，按2.2.2项下的提取方法制备供试品溶液，进样量为1μl，以上述的色谱条件平行实验，测得样品中毛两面针素的含量为0.1258μg/g，rsd为0.98％。

结果表明本方法重复性良好，结果详见表4。

表4重复性试验结果

2.8加样回收率实验

精密称取已知含量两面针牙膏(批号：b20190216a1，毛两面针素含量为0.1258μg/g2g，共取6份，置具塞锥形瓶中，精密加入毛两面针素对照品溶液(浓度为0.4144mg/ml)1.5μl，再精密加入80％甲醇20ml，称定重量，磁力搅拌30min，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，后两次称定后皆用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，将样品转移至50ml离心管中，4000r/min离心分离5min，冰柜冷藏静置10min，取上清液1.5ml至2ml离心管中，15000r/min离心分离5min，上清液用0.22μm微孔膜滤过即得供试品溶液。

按上述方法测定，结果显示本方法回收率较好，详见表5。

表5回收率实验结果

2.9含量测定

取本品3批(批号分别为：b20190216a1、g20190524b1、f20190612b1)各2g，精密称定，按2.2.2项下的方法制备供试品溶液，进样1μl，测定毛两面针素的含量，结果详见表6。

表6含量测定结果(n＝3)

3讨论

3.1色谱柱及流动相的选择

两面针中药牙膏中的两面针提取物主要成分为氯化两面针碱及可能由两面针主要伪品毛两面针及飞龙掌血替代投料产生的毛两面针素，根据毛两面针素以及氯化两面针碱分子结构(图3)中有一定的极性基团[8-9]，所以比较了极性较低的zorbaxsb-c18(4.6mm×250mm，5μm)及welchutimate@hplcaq-c18(2.1mm×50mm，1.8μm),检测结果显示，两种低极性色谱柱中，使用长柱zorbaxsb-c18(4.6mm×250mm，5μm)对毛两面针素分离效果较好，干扰成分少，峰面积较高，该色谱柱键合耐溶剂冲洗的固定相，对复杂的高极性的化合物具有优异的分离能力，因此本文中选用zorbaxsb-c18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱。

本实验考察了多种流动相体系，包括0.02mol/l乙酸铵-乙腈、0.05mol/l磷酸二氢钠-磷酸-乙腈、0.1％甲酸水-乙腈，结果表明：采用0.1％甲酸水-乙腈系统作为流动相，分离效果较好，不出现拖尾现象，且流动相为弱酸性，对色谱柱损害较小，毛两面针素及氯化两面针碱对照品均在273nm、328nm处发现最大吸收波长，后者峰形较良好。故采用0.1％甲酸水-乙腈作为流动相，使用dad检测器，选取328nm作为检测波长，等梯度梯度洗脱测定毛两面针素含量。

3.2提取溶剂的选择

由于毛两面针素易溶于极性较大的有机溶剂甲醇^[9]，牙膏中的其他主要组成部分如粘合剂(纤维素衍生物及其他物质)与摩擦剂等不溶于有机溶剂,但如果在膏体中直接加入甲醇，则膏体会凝聚成团，被测成分被包裹在体内而难以溶出，故本文分别不同体积分数的70％甲醇、75％甲醇、80％甲醇、85％甲醇、90％甲醇溶液对样品进行提取，其他处理方法不变，结果分析表明，用80％甲醇作为提取溶剂，毛两面针素峰面积明显比其余不同体积分数的溶剂所得峰面积要大，且具有良好峰型，所以选用80％甲醇作为提取溶剂，比较结果详见图4。

3.3提取方法的选择

参考文献中牙膏有效成分的提取一般为磁力搅拌及超声各30min，水浴回流30min等，以毛两面针素的含量为指标，分别考察比较两种提取方法，方法分别为：①磁力搅拌30min+超声30min、②磁力搅拌30min+水浴回流30min，其他处理条件不变，结果比较详见表8，两者待测成分提取量相差不大，但水浴回流效果较差。分析原因可能在于牙膏不易分散均匀，待测物溶出不足，水浴回流需要多次转移样品溶液易造成损失，操作不够简便，故排除水浴回流选用方法①作为提取方法。

在选用提取方法为磁力搅拌30min条件下，进一步比较了超声20min、超声40min、超声50min、超声60min与超声30min三者的峰面积的差别,结果显示，超声20min得到的峰面积较小，超声40min、超声50min、超声60min所得的峰面积皆较超声30min小，故确定选用超声30min作为提取方法，详见表9。

表8不同提取方法结果比较

表9不同超声时间的结果比较

3.4含量测定结果分析

目前，两面针的质量控制指标尚未完善，在制备两面针中药牙膏时选用的两面针药材的质量会有所差别，但两面针牙膏配方工艺严格保密，其质量标准也未见有相关的报道，所以在原料药两面针的选取上也会对两面针牙膏中两面针功效成分的含量及真伪造成影响。

由药典^[1]可知，两面针的检查项下明确规定不得检出毛两面针素，而在本实验三批样品中毛两面针素含量的结果(见表6)发现其中一批样品中检出微量的毛两面针素，为不合格样品。其余两批不同样品皆为添加了两面针提取物的中药牙膏，在含量测定项下的结果显示未检出毛两面针素，原因可能为不含毛两面针素或毛两面针素含量极微并低于检出限。

本文采用高效液相色谱法对两面针中药牙膏中毛两面针素的含量进行测定，该方法具有操作简便、迅速、准确、干扰少、精密度与重复性较好等优点，可为测定两面针中药牙膏中毛两面针素的含量提供实验依据。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。