本发明属于血液检测领域，涉及一种血清中尿素氮含量的测定方法，尤其涉及一种血清中尿素氮含量近红外光谱测定方法。
背景技术：
尿素是人体蛋白质代谢的主要终末产物，氨基酸脱氨基产生NH3和C02，两者在肝脏中合成尿素。通常肾脏为排泄尿素的主要器官，尿素从肾小球滤过后在各段小管均可重吸收。各种肾实质性病变，如肾小球肾炎、间质性肾炎、急慢性肾功能衰竭等均可使血尿素氮增高。如能排除肾外因素，尿素氮可作为尿毒症诊断指标之一。
血清(或血浆)中的尿素氮，在尿素氮试剂的酸性环境中与二乙酰-肟(DAM)共沸后，可缩合成一红色化合物，称为fearon反应。其颜色的深浅与血清(或血浆)中尿素氮的含量成正比，与同样处理的尿素氮标准液比色，即可测算出血清(或血浆)中尿素氮的含量。由于此方法干扰性大，目前临床实验室多采用尿素酶偶联法，用尿素酶分解尿素产生氨，氨在谷氨酸脱氢酶的作用下使NADH氧化为NAD+时，通过340nm吸光度的降低值可计算出尿素氮含量。但是，尿素酶偶联法测试时间较长，步骤繁琐，检测效率慢，且大量的人为操作易造成检测结果不准确。
技术实现要素：
本发明提供一种血清中尿素氮含量近红外光谱测定方法，以克服现有技术的缺陷。
为实现上述目的，本发明提供一种血清中尿素氮含量近红外光谱测定方法，步骤一、配制若干个含有不同尿素氮含量的血清标定液；步骤二、用近红外光谱仪对每个血清标定液进行光谱采集；步骤三、根据血清标定液的近红外光谱，建立鉴别模型；步骤四、用近红外光谱仪对待检测的血清样品进行光谱采集，将血清样品的光谱与鉴别模型对比，获得血清样品中的尿素氮含量。
其中，步骤一中，血清标定液是指已知其尿素氮含量的血清样品。且血清标定液的数量需满足建立模型的要求。优选的，血清标定液的数量至少为30个。若干个血清标定液的尿素氮含量的范围为2-7mmol/L。
步骤三中，鉴别模型是指血清标定液的光谱与血清标定液中尿素氮含量之间的对应关系。
进一步，本发明提供一种血清中尿素氮含量近红外光谱测定方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤一是采用尿素酶偶联法测定血清中的尿素氮含量，并配制出不同尿素氮含量的血清标定液；尿素酶偶联法是指采用尿素酶、谷氨酸脱氢酶、α-酮戊二酸、NADH与血清混合，根据NADH与血清反应前后的变化，即依据NADH与血清反应前后的结果，得到血清中尿素氮的含量。
其中，上述血清可以为采集而来的多份血清，用以配制血清标定液。
进一步，本发明提供一种血清中尿素氮含量近红外光谱测定方法，还可以具有这样的特征：其中，尿素酶偶联法的具体步骤为：步骤a、试剂与血清混合，并于36～38℃温浴3-6min；试剂包括尿素酶、谷氨酸脱氢酶、α-酮戊二酸和NADH；步骤b、在340nm波长处测量试剂和血清的混合液中NADH的吸光度下降速率，并与相同处理的尿素氮标准液比较，计算获得样品中尿素氮的含量。
其中，步骤b中，“与相同处理的尿素氮标准液比较”是指：配置尿素氮标准液，加入试剂，混合均匀并温浴，其中，尿素氮标准液与血清等量，试剂的加入量与其加入至血清中的量相等，温浴温度和时间也与样品的处理条件相同。然后，在340nm波长处测量试剂和尿素氮标准液的混合液中NADH的吸光度下降速率，由于尿素氮标准液的浓度已知，通过计算可知血清中尿素氮的含量。并且，尿素氮标准液可以与血清同时处理，以使检测结果更加准确并节省检测时间。
尿素氮标准液的配制方法为：称取尿素，溶于无氨去离子水中，并用无氨去离子水定容。尿素氮标准液的浓度为6～8mmol/L。
进一步，本发明提供一种血清中尿素氮含量近红外光谱测定方法，还可以具有这样的特征：其中，试剂还包括磷酸盐缓冲液；磷酸盐缓冲液的pH指为7.7±0.2；优选的，磷酸盐缓冲液为TRIS-盐酸缓冲剂。
进一步，本发明提供一种血清中尿素氮含量近红外光谱测定方法，还可以具有这样的特征：其中，试剂还包括防腐剂；优选的，防腐剂为ProcIin-300。
进一步，本发明提供一种血清中尿素氮含量近红外光谱测定方法，还可以具有这样的特征：其中，试剂由磷酸盐缓冲液30～70nmol/L、尿素酶4000～6000U/L、谷氨酸脱氢酶8000～10000U/L、α-酮戊二酸140～180nmol/L、NADH2.0～4.0nmol/L、防腐剂150～250μl/L组成；试剂与血清的体积比为1:70～80。
其中，试剂由上述各组分混合制成。
进一步，本发明提供一种血清中尿素氮含量近红外光谱测定方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤二和步骤四中，使用近红外光谱仪检测血清标定液和血清样品时，还采用配合近红外光谱仪的液体检测装置；液体检测装置包括通光孔、半透半反镜片和样品通道探测器；通光孔、半透半反镜片和样品通道探测器设于同一直线上，形成样品测试光路。
进一步，本发明提供一种血清中尿素氮含量近红外光谱测定方法，还可以具有这样的特征：其中，液体检测装置还包括空气通道探测器；空气通道探测器设于半透半反镜片的一侧，与样品测试光路垂直的方向，用于接收半透半反镜片的反射光。
进一步，本发明提供一种血清中尿素氮含量近红外光谱测定方法，还可以具有这样的特征：其中，液体检测装置还包括样品试管；样品试管放置在半透半反镜片和样品通道探测器之间，位于样品测试光路上；进行近红外光谱采集时，血清标定液或待检测的血清样品均放入样品试管中。
检测时，近红外光线通过通光孔，射至半透半反镜片上，一部分近红外光线由半透半反镜片反射进入空气通道探测器；另一部分近红外光线透过半透半反镜片照射样品试管，透过样品试管及其内部的测试液体(血清标定液或血清样品)射入样品通道探测器，光线在透过测试液体时发生吸收现象。
进一步，本发明提供一种血清中尿素氮含量近红外光谱测定方法，还可以具有这样的特征：其中，样品试管呈长方体，测试光线与样品试管的管壁垂直。
本发明的有益效果在于：本发明提供一种血清中尿素氮含量近红外光谱测定方法，采集若干个不同尿素氮含量血清的近红外光谱，建立尿素氮含量与光谱相对应的鉴别模型，当需要检测其他血清样品的尿素氮含量时，仅需采集该血清样品的近红外光谱，并将其与上述鉴别模型对比，即可获得该血清样品中的尿素氮含量。与传统的标准检测方法相比，首先，本方法的待检测血清样品无需预处理，不使用任何化学试剂，无环境污染、成本低；其次，检测所需的血清样品量少，且每份样品的检测时间约为近红外光谱的采集时间，检测时间短、效率高；此外，本方法避免了人为操作的误差，提高检测准确率。
具体实施方式
实施例一
本实施例提供一种血清中尿素氮含量近红外光谱测定方法：
步骤一、采用尿素酶偶联法测定血清中的尿素氮含量，并配制出若干个不同尿素氮含量的血清标定液。上述血清可以为采集而来的多份血清，用以配制血清标定液。
其中，血清标定液的数量需满足建立模型的要求。优选的，血清标定液的数量至少为30个。
若干个血清标定液的尿素氮含量的范围为2-7mmol/L。
尿素酶偶联法的具体步骤为：步骤a、试剂与血清混合，并于36℃温浴6min。其中，试剂由磷酸盐缓冲液30nmol/L、尿素酶4000U/L、谷氨酸脱氢酶8000U/L、α-酮戊二酸140nmol/L、NADH2.0nmol/L、防腐剂150μl/L组成。其中，磷酸盐缓冲液为TRIS-盐酸缓冲剂，防腐剂为ProcIin-300。血清与试剂的体积比为1:70。步骤b、在340nm波长处测量试剂和血清的混合液中NADH的吸光度下降速率，并与相同处理的尿素氮标准液比较，计算获得样品中尿素氮的含量。
其中，尿素氮标准液的浓度为6mmol/L。在尿素氮标准液中加入试剂，混合均匀并温浴，其中，尿素氮标准液与血清等量，试剂的加入量与其加入至血清中的量相等，温浴温度和时间也与样品的处理条件相同。然后，在340nm波长处测量试剂和尿素氮标准液的混合液中NADH的吸光度下降速率，由于尿素氮标准液的浓度已知，通过计算可知血清中尿素氮的含量。
步骤二、用近红外光谱仪对每个血清标定液进行光谱采集。
步骤三、根据血清标定液的近红外光谱，建立鉴别模型。该鉴别模型是指血清标定液的光谱与血清标定液中尿素氮含量之间的对应关系。
步骤四、用近红外光谱仪对待检测的血清样品进行光谱采集，将血清样品的光谱与鉴别模型对比，获得血清样品中的尿素氮含量。
其中，步骤二和步骤四中，使用近红外光谱仪检测血清标定液和血清样品时，还采用配合近红外光谱仪的液体检测装置。该液体检测装置包括通光孔、半透半反镜片、样品试管、样品通道探测器和空气通道探测器。
通光孔、半透半反镜片和样品通道探测器设于同一直线上，形成样品测试光路。空气通道探测器设于半透半反镜片的一侧，与样品测试光路垂直的方向，用于接收半透半反镜片的反射光。样品试管放置在半透半反镜片和样品通道探测器之间，位于样品测试光路上，进行近红外光谱采集时，血清标定液或待检测的血清样品均放入样品试管中。样品试管呈长方体，测试光线与样品试管的管壁垂直。
检测时，近红外光线通过通光孔，射至半透半反镜片上，一部分近红外光线由半透半反镜片反射进入空气通道探测器；另一部分近红外光线透过半透半反镜片照射样品试管，透过样品试管及其内部的测试液体(血清标定液或血清样品)射入样品通道探测器，光线在透过测试液体时发生吸收现象。
实施例二
本实施例提供一种血清中尿素氮含量近红外光谱测定方法，与实施例一的方法基本相同，区别仅在于：步骤一中的尿素酶偶联法不同。
尿素酶偶联法的具体步骤为：步骤a、试剂与血清混合，并于38℃温浴3min。其中，试剂由磷酸盐缓冲液70nmol/L、尿素酶6000U/L、谷氨酸脱氢酶10000U/L、α-酮戊二酸180nmol/L、NADH4.0nmol/L、防腐剂250μl/L组成。其中，磷酸盐缓冲液为TRIS-盐酸缓冲剂，防腐剂为ProcIin-300。血清与试剂的体积比为1:80。步骤b、在340nm波长处测量试剂和血清的混合液中NADH的吸光度下降速率，并与相同处理的尿素氮标准液比较，计算获得样品中尿素氮的含量。
其中，尿素氮标准液的浓度为8mmol/L。处理方式与实施例一相同。
实施例三
本实施例提供一种血清中尿素氮含量近红外光谱测定方法，与实施例一的方法基本相同，区别仅在于：步骤一中的尿素酶偶联法不同。
尿素酶偶联法的具体步骤为：步骤a、试剂与血清混合，并于37℃温浴4min。其中，试剂由尿素酶5000U/L、谷氨酸脱氢酶9000U/L、α-酮戊二酸160nmol/L、NADH3.0nmol/L。血清与试剂的体积比为1:75。步骤b、在340nm波长处测量试剂和血清的混合液中NADH的吸光度下降速率，并与相同处理的尿素氮标准液比较，计算获得样品中尿素氮的含量。
其中，尿素氮标准液的浓度为7mmol/L。处理方式与实施例一相同。