本发明属于一种检测方法，更具体涉及一种大鼠网织红细胞的检测方法。
背景技术
网织红细胞(retc)是红细胞的未成熟阶段，是反映骨髓红系造血功能以及判断贫血和相关疾病疗效的重要指标。骨髓中红细胞系统的增生发育过程是：多能干细胞→单能干细胞→原始红细胞→早幼红细胞→中幼红细胞→晚幼红细胞→网织红细胞→成熟红细胞。在正常情况下骨髓中有核红细胞并不释放至血循环，只有网织红细胞和成熟红细胞才释放入血中。因此，检查末梢血中网织红细胞数，可以推知骨髓红细胞增生程度。大鼠的应用范围涉及生命科学的各个领域，包括医学研究，药学研究，化学研究，食品科学研究，环境科学研究等。但大鼠网织红细胞相关参数检测结果的准确性还存在一些问题。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种检测效果较好、准确度较高、重复性较好的大鼠网织红细胞的检测方法。
根据本发明的一个方面，提供了一种大鼠网织红细胞的检测方法，包括以下步骤：
s1采集样本：采集大鼠腹主动脉血至抗凝管中，转动混匀后至3℃～5℃的环境中保存；
s2样本染色：对采集的样本在半小时内使用网织红细胞染色试剂染色10～20分钟，或对在3℃～5℃的环境中保存的样本取出恢复至室温后再使用网织红细胞染色试剂染色10～20分钟；
s3样本检测：将染色的样本半小时内或将样本在3℃～5℃的环境中保存不超过2小时或将染色样本在3℃～5℃的环境中保存24～72小时后检测样本的参数红细胞值，将染色样本半小时内或将染色样本在3℃～5℃的环境中保存4～72小时后检测样本的网织红细胞百分比或网织红细胞绝对值；将染色样本半小时内或将染色样本在3℃～5℃的环境中保存在4小时内检测样本的未成熟网织红细胞irf分数。
在一些实施方式中，所述样本染色的时间为10～20分钟。
在一些实施方式中，所述网织红细胞染色试剂为新亚甲蓝n噻嗪染料。
在一些实施方式中，所述样本采集步骤中，采集的大鼠静脉血至edta-k抗凝管中，轻轻转动以使管壁上的抗凝剂与全血充分混匀后至3℃～5℃的环境中保存。
在一些实施方式中，所述样本染色步骤中，样本加入网织红细胞染色试剂后再15℃-30℃的环境下培养。
其有益效果为：本发明确定了大鼠血标本网织红细胞相关指标的检测方法，包括检测步骤、血液标本存放时间、网织红染液的最佳染色时间，以及不同染色时间对结果稳定性的影响，通过本发明大鼠网织红细胞的检测方法的检测效果较好、准确度较高且重复性较好。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步的详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明。
检测原理为：本发明采用cell-dyn3700血细胞分析仪对网织红细胞进行检测，采用新亚甲蓝n噻嗪染料对网织红细胞进行染色，染色后的样本在仪器的woc通道中进行网织红细胞检验。将20μl血液手工稀释成一试管cell-dyn网织红细胞试剂作为样本。于室温条件下，10～20分钟内完成染色。在开放式模式下将被染色的样本抽出。然后用鞘液试剂将抽出的样本稀释成原来体积的50倍。样本一经鞘液稀释，rbc球由于受到非离子活性剂的影响，与染色液合成一体。在数据采集过程中，10度和90度散射可采集多达300,000个事件。0度散射阀值足够排除大多数血小板。直方图数据被用来区分网织红细胞、成熟rbc、血小板块和有核细胞。网织红细胞具有10度散射，与成熟rbc类似，但由于它大于90度的光散射又与成熟rbc不同，因此易于区分。网织红细胞的含量用百分数报告，如果输入一个rbc数，仪器会自动计算出网织红细胞的绝对值。
网织红细胞值(rbc)是指单位体积血液中所含的红细胞数目。
网织红细胞绝对值(reticabs)的计算方法为：网织红细胞百分比(retic％)与红细胞计数的乘积，单位为106个细胞/μl。
未成熟网织红细胞irf分数(irf)定义为幼稚的或未成熟的网织红细胞与总的网织红细胞的比值。
实施例1
s1、采集大鼠动脉血至edta-k抗凝管中，轻轻转动以使管壁上的抗凝剂与全血充分混匀；
s2、在每支抗凝管上贴上标签；
s3、在半小时内对采集的样本使用仪器检测，并记录rbc值；
s4、检测后存放于3℃～5℃冰箱中，于之后每个时间点(2小时、4小时)，提前15分钟从冰箱依次取出，恢复至室温并检测记录rbc值。
s5、将新亚甲蓝n噻嗪染料于15℃～30℃的室温环境下避光储存；
s6、对于步骤4中各时间点所对应的每一个样本，相应地选一管新亚甲蓝n噻嗪染料，并在管上贴上与抗凝管上的标签一一对应的标签；
s7、确认取样前样本已被恢复至室温并充分混合为全血样本；
s8、用移液管将全血样本移取至相对应的新亚甲蓝n噻嗪染料管中；
s9、在管架内将已染色的样本完全倒转5次后，将染色的网织红细胞样本15℃～30℃的室温环境下培养15分钟；
s10、将培养好的网织红细胞样本再次倒转5次后，测定retic％、reticabs、irf值。
s11、将检测后的样本继续培养至30分钟，重复步骤10。
对比实施例1
s1、采集大鼠动脉血至edta-k抗凝管中，轻轻转动以使管壁上的抗凝剂与全血充分混匀；
s2、在每支抗凝管上贴上标签；
s3、将采集的样本分别在半小时内使用仪器检测，并记录rbc值；
s4、检测后存放于3℃～5℃冰箱中，于之后每个时间点(8小时、24小时、48小时、72小时)，提前15分钟从冰箱依次取出，恢复至室温并检测记录rbc值。
s5、将新亚甲蓝n噻嗪染料于15℃～30℃的室温环境下避光储存；
s6、对于步骤4中各时间点多对应的每一个样本，相应地选一管新亚甲蓝n噻嗪染料，并在管上贴上与抗凝管上的标签一一对应的标签；
s7、确认取样前样本已被恢复至室温并充分混合为全血样本；
s8、用移液管将全血样本移取至相对应的新亚甲蓝n噻嗪染料管中；
s9、在管架内将已染色的样本完全倒转5次后，将染色的网织红细胞样本15℃～30℃的室温环境下培养15分钟；
s10、将培养好的网织红细胞样本再次倒转5次后，测定retic％、reticabs、irf值。
s11、将检测后的样本继续培养至30分钟，重复步骤10。
实施例1和对比实施例1中，共采集大鼠动脉血样品10份，雌雄各半，采用spss23.0统计学软件进行统计分析，计数资料以
表1染色15或30分钟大鼠网织红细胞相关指标结果
注：表中pvalue的计算为相同染色时间下，不同保存时间与半小时内检测进行比较，*为p<0.05，**为p<0.01。
根据表1的结果可知：
(1)染色时间控制在15分钟，除体外储存2小时的血样外，其他时间段retic％和reticabs检测结果均无明显统计学差异，irf值在4小时内无明显差异，8小时至72小时差异明显(p<0.01)；
(2)染色时间控制在30分钟，retic％和reticabs检测值在2小时以内无统计学差异，4小时至24小时有统计学差异(p<0.05)，48小时至72小时则无统计学差异，irf值需半小时内检测，其余各时间段均有显著差异(p<0.01)；
(3)rbc值在2小时以内无统计学差异，4小时到8小时有显著差异(p<0.01)，24小时至72小时差异不明显。
因此：
(1)rbc检测最佳时间为2小时以内，若不能半小时内检测，可存放于冰箱(4℃冰箱)24小时～72小时；
(2)retic％和reticabs最好半小时内检测，若在冰箱(4℃冰箱)存储4小时至三天，提前15分钟取出恢复至室温，检测结果也较为可信；
(3)irf的最佳检测时间是4小时以内，若不是半小时内检测，需放置4℃冰箱；
(4)染色时间15分钟为最佳，染色30分钟其各项指标随血液放置时间变动较明显，实验过程中应严格控制好染色时间。
实施例2
s1、采集大鼠动脉血至edta-k抗凝管中，轻轻转动以使管壁上的抗凝剂与全血充分混匀；
s2、在每支抗凝管上贴上标签；
s3、对采集的样本在分别在半小时内使用仪器检测，并记录rbc值；
s4、将新亚甲蓝n噻嗪染料于15℃～30℃的室温环境下避光储存；
s5、对于步骤3中各时间点多对应的每一个样本，相应地选一管新亚甲蓝n噻嗪染料，并在管上贴上与抗凝管上的标签一一对应的标签；
s6、确认取样前样本已被恢复至室温并充分混合为全血样本；
s7、用移液管将全血样本移取至相对应的新亚甲蓝n噻嗪染料管中；
s8、在管架内将已染色的样本完全倒转5次后，将染色的网织红细胞样本15℃～30℃的室温环境下培养10分钟、15分钟和20分钟；
s9、将培养好的网织红细胞样本再次倒转5次后，分别测定样本的retic％、reticabs、irf值。
实施例2中，共采集大鼠动脉血样品12份，雌雄各半，采用spss23.0统计学软件进行统计分析，计数资料以
表2：染色10分钟、15分钟及20分钟大鼠网织红细胞相关指标结果
注：表中pvalue的计算为不同染色时间，半小时内检测，各时间点分别与15分钟时间点结果比较，*为p<0.05，**为p<0.01。
由表2结果可知：在取血半小时内检测，染色时间点10分钟和20分钟分别与15分钟时间点做对比，结果没有统计学差异(p>0.05)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。