专利名称：细胞计测方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞计测方法。
背景技术：
为进行医药的开发、检查技术的开发等，用显微镜等对细胞进行观察，进行各种计测，例如，收集有关医药对细胞的影响的信息等的各种信息。在进行这种观察测定时，为提高效率，用于容纳细胞进行观察等的微小区域即观察区域(以下简单地称作区域)使用多个二维配置的观察支援设备。
在使用这种的观察支援设备进行细胞的观察测定等时，将观察支援设备载置在显微镜的XYZ载物台上，使载物台相对于物镜系统在二维方向(XY)相对移动，使多个区域依次位于显微镜的视野内，以一定的时间间隔进行对相同的对象进行摄影的时效的摄影(即时摄影)。因此，在应用了这种显微镜的光学测定器中，以使各区域正确地位于显微镜的视野内的方式精密地控制载物台的相对移动。对于这样的延时观察，例如，作为非专利文献，在“Shiro Kanegasaki et al.，A noveloptical assay system for the quantitative measurement ofchemotaxis.Journal of Immunological Methods 282(2003)1 11”中有记载。另外，作为专利文献，在“日本专利特开2002-277754号公报”中有记载。
但是，在观察细胞相对于化合物的反应、响应性等时，寻求测定每种细胞的响应性的差异、或测定在改变细胞的条件时的响应性的变异的方法。
这种情况下，通过以适当的浓度进行实验，可以得到良好的测定结果。例如，在对每种细胞比较细胞相对于某刺激的响应性时，将改变细胞条件时的细胞响应性的变化进行比较时，若设定的浓度过高或过低，则难以了解每种细胞的差异，从而不能得到良好的实验效果。
因此，在试验细胞相对于化合物的响应性时，必须设定化合物刺激的适当的浓度。在设定该适当的浓度条件时，设定多个浓度条件，从而必须对各浓度分别进行细胞反应的计测。但是，在现有的技术中，至此还没有考虑到该问题。
发明内容
本发明的目地在于，提供一种在计测有关细胞的反应时，可以一次性进行宽浓度范围内的计测技术。
根据本发明第一方面，提供一种细胞计测方法，用摄像装置对细胞组的图像进行摄像，将图像输入信息处理装置，在信息处理装置中基于得到的图像进行对细胞的计测，其特征在于，在容纳细胞组的细胞容纳空间充满液体，在上述细胞容纳空间内配置细胞组，向上述细胞容纳空间的液体供给特定的物质，在液体中从该细胞容纳空间的一端朝另一端形成特定物质的浓度梯度，将上述细胞容纳空间内的细胞组用摄像装置摄像，输入信息处理装置，从得到的图像生成表示细胞特征量与特定物质的浓度的对应关系的信息。
根据本发明第二方面，提供一种细胞计测方法，用摄像装置对细胞组的图像进行摄像，将图像输入信息处理装置，在信息处理装置中基于得到的图像进行对细胞的计测，其特征在于，在容纳细胞组的细胞容纳空间充满液体，在上述细胞容纳空间配置细胞组，向上述细胞容纳空间的液体供给特定的物质，在液体中从该细胞容纳空间的一端朝另一端形成特定物质的浓度梯度，将上述细胞容纳空间内的细胞组用摄像装置摄像，输入信息处理装置，在信息处理装置中，对得到的图像沿上述浓度梯度区划出多个区域，从各区域中的图像提取特征量，生成表示上述提取的特征量与浓度梯度的对应关系的信息。
根据本发明第三方面，提供一种细胞计测方法，其特征在于，使用细胞观察支援装置和信息处理装置，其中，细胞观察支援装置具有在观察时容纳用于观察的细胞组的细胞容纳区域、和夹着上述细胞容纳区域而连通，且在使用时分别装入液体并用液体将上述细胞容纳区域充满的第一储液空间及第二储液空间；信息处理装置在使用时获取上述细胞容纳区域容纳的细胞组的图像，基于获取到的图像收集有关细胞的信息；进行如下处理配置用于上述观察的细胞组，在向第一储液空间及第二储液空间和上述细胞容纳区域注满液体，并且在上述第一储液空间的液体中添加了刺激上述细胞的细胞刺激物之后，通过上述摄像装置在不同的定时多次取得细胞组的图像；对于各次取得的上述图像，将上述图像中显示的细胞容纳区域从第一储液空间侧沿第二储液空间侧分为多个区域，将各区域含有的细胞的总个数进行计算，同时识别表示预定的特征量的特定的细胞，将其个数进行计算；基于上述的个数计算结果，对各区域算出相对于在各区域内计算的总个数的显示特征量的特定的细胞个数的比例；生成表示有关显示上述特征量的特定的细胞个数的比例的经时变化的信息；根据指令输出表示上述经时变化的信息。
图1是表示本发明一实施例的细胞计测系统的原理的说明图；图2是表示可以在进行本发明的细胞计测时使用的细胞计测系统的构成之一例框图；图3是表示可以用于本发明第一实施例的观察部件的剖面图；图4是表示可以用于本发明第二实施例的观察部件的剖面图；图5是表示可以用于本发明第三实施例的观察部件的剖面图；图6是表示可以用于本发明第四实施例的观察部件的剖面图；图7是表示可以用于本发明第五实施例的观察部件的剖面图；图8是表示通过荧光观察测定添加后的FITC分子的扩散结果的图表；图9是表示捕捉到通过刺激物质将细胞脱颗粒、改变对比度的特征时的说明图；图10是表示对得到的图像沿浓度梯度将图像区划为多区域，提取特征量的方法的说明图；图11是在各地点(区域)计算脱颗粒细胞的比例的图表；图12是表示采用细胞运动的浓度梯度方向的速度作为趋化活性强度的指标，将该值在沟道上的各位置计测的结果的图表；图13是表示细胞对刺激具有何种的响应性的图表。
具体实施例方式
下面，参照附图对实施本发明的最佳方式进行说明。首先，说明本发明的原理，其次，说明具体的应用。
本发明中，细胞在多数存在的平面上再现性好地形成浓度梯度，通过计测在该浓度梯度上的各位置的细胞的反应，可以一次进行在宽浓度范围内的计测。其结果是，根据本发明，可以减少探测最佳的细胞刺激浓度的所需要的实验，提高实验效率。另外，因为刺激细胞的化学物质的浓度可以根据位置连续地设定，故可以得到最佳的浓度的评价。
作为数据的解析方法，可以用如下的考虑方法。即，如后述，将被摄像的画面划分长方形的区域，在得到各区域中包含的细胞集团的特征量后，进行解析。
(a)在最佳的浓度条件下的细胞的药剂响应性评价方法(最佳条件的选定方法)测定细胞对药剂的响应性时，对于该细胞及药剂，必须选定适当的药剂处理浓度。一直以来，在这种情况下，几次选择适当的浓度，独立地测定在其各浓度的细胞性质，由此选定适当的浓度。这时，为选择更适当的浓度，必须在多数浓度中重复实验或比较进行。在本技术中，可以取得药剂对细胞的处理浓度连续变化时的有关细胞性质变化的连续的数据。
例如，在有两种以上的细胞组时，探讨该各细胞组对药剂的响应性的差异时，通过应用浓度梯度的本技术，可以对各细胞组一并取得在连续的药剂浓度的响应性数据。从其一系列的浓度条件中选择评价各细胞组的性质差异的最适合的浓度，在该浓度中可以进行各细胞组的药剂响应性的比较。根据该方法，用多种药剂浓度评价细胞响应性的一系列的检测实验不再需要，可以简便并且确实地取得质量高的数据。
(b)表示细胞的药剂响应性的特性的函数或值的取得根据本方法，可以连续地评价细胞对药剂的响应性。以在此取得的“一系列的浓度—响应性关系数据”为基础，可以取得表示细胞的药剂响应性的特性的函数或值。例如，在某实验中，在细胞对药剂响应性用相对于该药剂浓度的特定的函数的形式表示时，将用本实验得到的数据对于其函数适当的调整，由此可以得到近似实验的细胞组中的药剂反应浓度依存性的函数。作为这里所说的特定的函数，可以假设为S函数等，但不限于此。另外，由该函数取得与极大点、极小点、变极点等特征的点对应的浓度，也可以将该值作为该细胞组对该药剂的响应性的特征量使用。
下面，就本发明的实施例参照图1进行说明。如图1所示，在本实施例中，在配置了多个细胞的空间形成用于观察细胞的反应的有关特定的物质的浓度梯度。因此，由观察部件100形成作为容纳细胞的细胞容纳空间110。图1所示的细胞容纳空间110，为进行原理说明，而模式的表示其结构。具体的结构后述在该细胞容纳空间110充满对细胞无害的液体120，其中，将要观察的细胞200分散多个(细胞组)配置。在该状态下，将用于观察细胞反应的物质(以下称为刺激物质)130从细胞容纳空间110的一侧注入，在细胞容纳空间110内形成浓度梯度131。在该例中，注入溶解了化合物等的刺激物质130的溶液，在细胞容纳空间110内形成特定的刺激物质130的浓度梯度131的状况下，通过显微镜310，用数码摄像机(例如CCD摄像机)320将各细胞200的状态进行摄像。另外，在本实施例中，利用光刻技术在硅晶片上形成多个(例如12个)细胞容纳空间110。而且，计测在各细胞容纳空间110的浓度梯度的各位置的细胞的响应性。通过该方法，可以容易地进行化合物对细胞的作用的比较。
细胞对刺激物质的响应性因浓度而不同。作为细胞表示的响应，例如有遗传因子的发现、形态变化、生理活性物质的释放等各种的细胞现象。作为这些响应，细胞有时显示可从外部观察的何种特征量。在本发明中，利用该性质，通过解析细胞组的图像而提取细胞组显示的特征量，从而取得有关刺激物质的有关细胞响应的信息。本发明的情况下，在同样的画面内形成浓度梯度。因此，改变浓度，不需要重复实验这种试行错误的费时。用一次的实验就可以观察浓度不同产生的响应。
细胞容纳空间110具体而言如图3～图7所示，通过各种方式的观察部件100可以实现。该细胞容纳空间110是使细胞组在平面上分散配置，从外部通过显微镜等可以观察的空间。因此，其具有扁平的构造。厚度例如为细胞大小的程度。
图3所示的是，用光刻技术在硅晶片115上形成成为细胞容纳空间110的扁平的切口、和成为位于其一端侧且向细胞容纳空间110流入刺激物质的源区域111及位于细胞容纳空间110的另一端侧且从细胞容纳空间110排出刺激物质的漏空间112切口。硅晶片115载置在玻璃基板117上。由此，被硅晶片115和玻璃基板117夹持的切开的空间构成细胞容纳空间110、源区域111及漏区域112。细胞容纳空间110以成为细胞不重叠的程度的深度的扁平空间(channel沟道)的方式形成。另外，源区域111及漏区域112说到底只不过是将刺激物质的注入侧和排出侧为方便而起的名字。在为对称的观察部件时，源区域和漏区域无论在哪一侧都无妨。
在硅晶片115的上面一侧设置构成储液的储液构成部件116。储液构成部件116例如用不锈钢等金属构成。由该储液构成部件116形成第一储液空间113a及第三储液空间113b、第二储液空间114a及第四储液空间114b。第一储液空间113a及第三储液空间113b与源区域111连通。另一方面，第二储液空间114a及第四储液空间114b与漏区域112连通。由于为这样的构造，从而液体120通过细胞容纳空间110，可以在第一储液空间113a及第三储液空间113b、第二储液空间114a及第四储液空间114b之间来往。但是，在本实施例中，液体本身不流动更适宜观察，因此，在储液构成部件116的上方设置了将第一储液空间113a及第三储液空间113b、第二储液空间114a及第四储液空间114b连通的连通部118。使液体120以到达连通部118的方式流入，由此可以控制因液体120中的压力差引起的流动。
细胞、刺激物质等用注射器等注入。这时，通过将注射针设定为到达源区域111的状态，可以可靠地注入细胞容纳空间110。
图4表示与图3所示的构成具有大致同等构成的观察部件100。该观察部件100与在硅晶片115上形成的切口的构造不同，除此之外，与上述图3所示的具有同样的构造、同样的功能。
图5所示的观察部件是不在上述的图3及图4所示的观察部件上设置的第三储液空间113b及第四储液空间114b的构造。即，为具有第一储液空间113、第二储液空间114、源区域111、细胞容纳空间110、漏区域112的构造。
另外，在图3及图4的观察部件100上设置第三储液空间113b及第四储液空间114b的理由是为了吸收注入的液体的摇动。特别是，为了在离开源区域111的位置用注射器等注入刺激物质时，起到使挤出刺激物质时产生的压力的一部分脱离的作用的效果。
图6及图7所示的观察部件是与上述如图3～图5所示的不同的类型的部件。即，图6所示的观察部件和图7所示的观察部件在储液空间的构成和细胞容纳空间110的构成的方式不同。将第一储液空间113打开，进行液体的注入、细胞的注入、刺激物质的注入等。另一方面，第二储液空间114不开放。另外，作为构成细胞容纳空间110的部件119，不用硅，而直接使用不锈钢。由此，具有使观察部件的生产简单化，降低制作成本的效果。
图6是横置型的即水平放置型的例子。另一方面，图7所示的例子是纵置型的。在图7所示的例子中，在有粘着性的细胞时，其附着在玻璃基板117上，因此，细胞不掉落。
在此，就浓度梯度的形成方法进行说明。
在上述图5所示的观察部件的情况下，在由细胞容纳空间(沟道)110、由此连通的第一储液空间113、第二储液空间114构成的连通管结构的内部充满适当的液体。另外，在第一储液空间113及第二储液空间114的任一个的管中注入含有形成浓度梯度的目标物质的溶液。由此，从源区域111朝漏区域112，物质在沟道110中扩散。另外，由于在上部的连通部118间充满液体120，从而可以大幅减轻因振动与倾斜等的影响使管110内的液体剧烈移动而造成的浓度梯度的紊乱。由此，可以维持稳定的浓度梯度。
如图3及图4所示，也可以应用在第一储液空间113a设置了作为分支路的第三储液空间113b，另外在第二储液空间114a设置了作为分支路的第四储液空间114b的观察部件。在这种情况下，分别从第一储液空间113a或第二储液空间114a投入含有目标刺激物质130的液体。另外，在从第一储液空间113a侧注入了刺激物质130的液体时，刺激物质从源区域111经过沟道110向漏区域扩散。另一方面，在从第二储液空间114a侧投入了刺激物质的液体时，如图所示的漏区域112实质上成为源区域，相反侧的源区域111实质上成为漏区域。因此，源区域和漏区域是在如图3、图4及图5所示的观察部件的情况下为了方便而使用的名称。
另外，也可以用如图6及图7所示的观察部件形成浓度梯度。这时，从开放的第一储液空间113投入含有目标刺激物质130的液体，从源区域111经由沟道110向漏区域形成刺激物质130的浓度梯度。
就浓度梯度是如何形成，参照图8进行说明。向图4所示观察部件充满液体，在此，就投入了特定的刺激物质130时的扩散是如何引起的情况示于图8。在该实验中，在第一储液空间113中添加了荧光物质FITC。如图8所示的是将添加后的FITC分子的扩散通过荧光观察测定的结果。图标的横轴表示沟道上的位置，纵轴表示荧光强度。在此表示FITC分子投入后，1分、3分、6分、9分及15分后的FITC分子的浓度梯度。可知在3分钟之后，形成并维持大致直线的浓度梯度。
图2表示本细胞计测装置的构成之一例。图2所示的细胞计测系统，具有在细胞容纳空间110内容纳的用于进行细胞的摄像的摄像装置、和对摄像后的图像进行处理并进行用于得到目标信息的信息处理的信息处理装置。
摄像装置在本实施例中由显微镜310、CCD摄像机320、载物台316、载物台驱动装置315及信息处理装置350构成。另一方面，信息处理装置具有输入装置330及显示装置340、和计算机350。
计算机350具有中央处理器(CPU)351、存储器352、辅助存储单元353。在辅助存储单元353中存储该CPU351的执行程序360、数据370。
作为程序360，含有未图示的OS之外的控制细胞计测装置的计测动作的摄像序列361、控制载物台的载物台控制352、控制摄像的摄像控制363、进行得到的图像数据解析的数据解析364。这些程序，是从网络等上安装到辅助存储单元353中的。作为数据，图像数据371是典型的数据。
对细胞的摄像，通过上述的观察部件来准备上述的细胞组，通过计算机350的控制进行测定。测定根据预定的摄像序列进行。即，计算机350通过载物台控制程序362驱动控制载物台控制装置315，将观察部件的多个部位、例如12个部位用1分钟一定的定时以摄像的方式进行定位。摄像序列361由XY载物台316定位，同时由摄像控制程序363在一定的定时，以进行细胞容纳空间110的细胞组的摄像的方式对CCD摄像机320发出指令。而且，在预定的定时，将CCD摄像机320拍摄到的图像输入存储器352。
对输入的图像数据，通过数据解析程序64进行解析处理。首先，将摄像数据与摄像条件一起存储于辅助存储单元353。
之后，对得到的图像进行指定的处理。要从摄像的图像提取特征量，可以有各种的方法。例如，对得到的图像，沿浓度梯度将画面区划出多个区域，在每个区域进行它们中含有的细胞组表示的特征量的提取。区域例如图10所示，确定为长方形状。该区域的大小可以适当设定。例如，在显示装置340条显示的画面上，用输入装置进行框架指定，由此对计算机350识别区域的方法。另外，通过指示区域数，将画面均等分割为指示的区域数，也可以成为确定区域。无论哪一情况，由于都将计算机350识别的区域显示给人，故可以将长方形的框架显示在显示画面上。图10是进行显示的例子。
另外，在图10上，为说明的方便，在表示区域的框架的左侧付记1至4的数字。在图10中，将画面上方作为源侧，将下方侧作为漏侧来表示。因此，如图10所示的例子的情况中，从上顺次下降的数值表示为浓度的浓的顺序。
在此，作为细胞组表示的特征量，例如可以列举如下。当然也不局限于此。
(a)相对于各区域存在的细胞整体的个数的在该区域具有特定性质的细胞个数的比例
(a1)特定的性质是细胞的脱颗粒的情况(a2)a1中，细胞还是肥大细胞的情况(b)细胞的特征量的平均值、中央值、分散、标准偏差等(b1)细胞的某特征量是细胞的运动速度的情况(b2)细胞的某特征量是细胞的运动方向特异性的情况特征量的提取如图10所示，通过用在区域内含有的细胞的图像的对比度，调查细胞从膨胀到破裂的情况来进行。除此之外，对于大小例如平均直径、面积等而言，与预定的阈值进行比较，通过调查是否超过阈值，也可以构成判断。在此，如图9所示，对捕捉到通过刺激物质将细胞脱颗粒，使对比度变化的特征的情况进行说明。
首先，进行细胞组的个数的计数。即，分为对比度大的(例如，图9所示的细胞212)与小的(图9所示的细胞211)，分别进行识别，将其个数进行计数。识别有各种方法，例如，求轮廓、将封闭形状的作为一个计数。这时，例如，基于轮廓线与周围的亮度差，调查对比度。或者，对于图像而言，使用过滤器分离对比度的大小，对分离出的图像分别求轮廓，将细胞的个数进行计数。任一种方法都可以计算对比度高的细胞的个数与对比度低的细胞的个数。
另外，作为代替细胞个数的计数，也可以计测细胞区域占画面上的面积。例如，在将对比度作为指标识别细胞时，通过对特定的对比度范围含有的画面上的区域计数其面积，可以得到与细胞个数的计数同等的效果。例如，评价具有特定的对比度的细胞比例时，持有具有该性质的细胞相对于画面上占有的细胞的总面积的的比例，可以作为具有该性质的细胞相对于细胞总数的比例应用。
计算结果是，对各区域而言，通过求低对比度的细胞的个数对于整体细胞个数的比例，例如，可作为相对于刺激物质的脱颗粒率来掌握。再者，在不同的定时进行多次摄像时，在时间的经过的同时，浓度梯度的各浓度中可以生成显示细胞相对于刺激物质的响应性的信息。图10是基于这样生成的信息，将细胞组表示的特征量(在这里是脱颗粒的细胞的比例，即刺激物质的活性强度)，对各浓度作为其时间变化显示的图。根据图10表示的信息，可以看到，随浓度不同活性度不同，及响应性随时间的经过同时变化。
实施例下面，就实施例进行更具体的说明。
肥大细胞受某化合物的刺激，引起将细胞内现有的颗粒向细胞外释放的称为脱颗粒的反应。在脱颗粒时，细胞的形态与对比度变化，因此通过光学装置可以区分脱颗粒的细胞。在此，在肥大细胞分散的环境中，形成肥大细胞刺激物质的浓度梯度，在各位置计算引起脱颗粒的细胞的比例。
在实验中使用细胞趋药性测定用的器具即TAXIScan(KK chamber)(参照Kanegasaki S et al.，(2003)J.Immunol.Methods 282，1-11)。向由硅晶片形成的微型沟道和玻璃基板的间隙(细胞容纳空间110)导入由老鼠腹腔采取的肥大细胞，从靠近与微型沟道的一侧端连接的源区域111，投入作为刺激物质的肥大细胞刺激剂。这此，作为刺激剂，导入1微升含有100μm的lysoPS与2000，1000，200，80μg/ml的刀豆素A的缓冲液。肥大细胞的脱颗粒是通过显微镜直接观察沟道中的细胞而监视的。肥大细胞的脱颗粒通过以图9所示的形态的变化与对比度的变化等为指标可以监视。另外，通过以对比度变化等作为指标，也可以用图像解析进行自动的脱颗粒的检测。
刺激剂由于通过扩散而形成浓度梯度，因画面上的位置而使浓度不同。通过在其各地点分别测定脱颗粒活性的强度，来区分各地点的浓度的活性强度(图10)。图10右侧所示的4幅图追着时间计测是在照片中的4个区域按脱颗粒的细胞的比例的图(横轴是时间(min)、纵轴是比例(％))。浓度梯度通过扩散形成，放置某时间后，脱颗粒细胞的比例稳定。如上所述，在图10所示的例子中，区域(1)浓度最高，按区域(2)、区域(3)、区域(4)的顺序，具有依次降低的浓度梯度。
在图10中，在细胞容纳空间110配置肥大细胞，从画面上方向导入刺激剂的照片(左刺激前、右刺激后)。画面上方的细胞脱颗粒，从而使对比度下降，变白的被确认。另外，211表示脱颗粒的细胞，212是未脱颗粒的细胞。
在各地点(区域)计算的脱颗粒细胞的比例图如图11所示。纵轴是脱颗粒的细胞的比例(％)，横轴是刺激剂的浓度(μg/ml)。在横轴的数字表示形成了浓度梯度的沟道(细胞容纳空间)上的区域。1是浓度最高的点，以1至4的顺序浓度依次降低的方式形成浓度梯度。在此，1至4的序号与图10标注的区域的序号(1)至(4)相对应。另外，用于刺激的刀豆素A的浓度为，黑四角2000μg/ml，白四角1000μg/ml，×号200μg/ml，白圆点80μg/ml。根据图，在地点2和3中，刺激剂的浓度与脱颗粒细胞的比例有差异，并且其值与刺激剂的浓度相关。
在图11所示的图表中，在区域(1)及(4)中刺激剂的浓度差几乎没有，但是，在区域(2)及(3)中，由浓度引起的反应的差异明了。例如，在研究该细胞的相对于刺激强度的活性偏差，确认试药给细胞活性的阻害/促进活性的实验时，通过在区域(2)及(3)的区域采用该刺激物的浓度，可以取得适当的数据。这样，通过利用浓度梯度，在一次实验中可以观察连续变化的浓度中细胞的反应，因此，可以在最适当的条件下进行比较。
下面，对其它的实施例进行说明。在此，叙述细胞的趋药性的浓度变化。
对细胞的趋药性的浓度变化而言，通过考虑浓度梯度上的细胞位置也可以检测。细胞的趋药性有感应细胞特定的因子的浓度梯度，向浓度浓的方向移动的功能。该趋药性在特定的浓度活性最大，在高浓度与低浓度中活性减小，公知的是表示钟型的活性。在现有的方法中，相对于浓度是活性钟型的情况通过在多种浓度中进行实验可以确认。若利用在浓度梯度环境中各位置浓度的不同，则可以容易地知道活性的浓度特性。该情况用实验表示时，使用细胞细胞趋药性测定用的器具即TAXiscan(KK chamber)(对于方法和材料等Kanegasaki S etal.，(2003)J.Immunol.methods 282，参照1-11)。
在此，将Jurkat细胞导入细胞容纳空间110，在那里测定形成SDF-1a的浓度梯度时的细胞的运动。作成浓度梯度时使用的SDF-1a的浓度用10及1nM的3种，对各区域注入1微升。Jurkat细胞表示在SDF-1a的浓度梯度方向趋药性，因此，作为趋药活性强度的指标采用细胞运动的浓度梯度方向的速度，在沟道(细胞容纳空间110)上的各位置计测其值。图12表示其结果。图表的横轴是沟道上的位置、纵轴表示趋药活性(细胞移动速度的浓度梯度方向成分)。浓度梯度靠近图的右方向形成的，因此越向右浓度越高。纵轴表示细胞运动的浓度梯度方向的速度(μg/sec)。在加上了SDF-1a的浓度为1nM时，如图12所示，浓度越高趋药活性越高。观察10nM时的结果，可知在图12(a)沟道上的途中地点有活性的峰值，靠近那里的浓度变浓后趋药活性减小。由此可知趋药活性确实是钟型的。
细胞运动的计测，例如，将图10所示的画面区划成多个网格，在各网格内关注细胞轮廓线的局部，其轮廓线的位置与时间一起对何种的变位进行计测，通过平均这些变位的x成分、y成分，由平均的变位方向和摄像定时可以求出平均速度。
如上所述，在本发明中，给细胞容纳空间投入细胞组，同时对细胞组注入刺激物质，形成该刺激物质的浓度梯度，对摄像并得到的图像沿浓度梯度设置区域，基于图像处理提取各区域的细胞组显示的特征量。至此，每一种浓度、每经过的时间、必须进行多少次的试行的计测，用一次的处理即可进行。
即，在测定因每个细胞的种类引起的响应性的差异、或测定改变细胞的条件时的响应性的变化时，通过适当的浓度进行实验，可以得到良好的测定结果。例如，在将细胞对于某种刺激的响应性与细胞的每个种类比较、将改变了细胞的条件时的细胞响应性的变化进行比较时，若设定的浓度过高或过低，则不容易发现细胞的种类引起的差异，因此不能得到良好的实验结果。
在此，细胞对刺激有何种的响应性如图13(a)所示(横轴浓度、纵轴活性)。在细胞在适当分散的环境中形成如图13(b)(横轴位置、纵轴浓度)所示的浓度梯度时，在浓度梯度中的各位置的细胞响应性如图13(c)所示(横轴位置、纵轴活性)。在通常的实验中，实验多数的浓度时，将浓度分阶段地观察各浓度的反应，因此实验的浓度为断续的。再者，为确认多数的浓度的反应，必须独立地进行那么多数量的实验。若利用浓度梯度，则可以用一次独立的试验确认在连续的浓度范围各浓度的细胞反应。由此，可以减少独立试验的个数从而实验变得简便。
另外，对于细胞的活性评价而言，以应用了细胞的形态变化与运动性、或荧光探测器等的细胞内分子的局部变化、遗传因子的发现等在显微镜上可以评价的所有的生命现象为对象。
权利要求
1.一种细胞计测方法，用摄像装置对细胞组的图像进行摄像，将图像输入信息处理装置，在信息处理装置中基于得到的图像进行对细胞的计测，其特征在于，在容纳细胞组的细胞容纳空间充满液体，在上述细胞容纳空间内配置细胞组，向上述细胞容纳空间的液体供给特定的物质，在液体中从该细胞容纳空间的一端朝另一端形成特定物质的浓度梯度，将上述细胞容纳空间内的细胞组用摄像装置摄像，输入信息处理装置，从得到的图像生成表示细胞特征量与特定物质的浓度的对应关系的信息。
2.如权利要求1所述的细胞计测方法，其特征在于，浓度梯度是通过荧光观察将荧光物质形成的浓度梯度进行测定的浓度梯度。
3.如权利要求1或2所述的细胞计测方法，其特征在于，细胞特征量是细胞的脱颗粒、运动速度、运动方向特异性、大小、平均直径、面积、对比度、形态变化、细胞内分子的局部变化、及遗传因子发现中的任意一种。
4.如权利要求3所述的细胞计测方法，其特征在于，细胞特征量是从图像求取轮廓，将封闭形状作为一个细胞进行识别，从该识别的细胞得到的特征量。
5.一种细胞计测方法，用摄像装置对细胞组的图像进行摄像，将图像输入信息处理装置，在信息处理装置中基于得到的图像进行对细胞的计测，其特征在于，在容纳细胞组的细胞容纳空间充满液体，在上述细胞容纳空间配置细胞组，向上述细胞容纳空间的液体供给特定的物质，在液体中从该细胞容纳空间的一端朝另一端形成特定物质的浓度梯度，将上述细胞容纳空间内的细胞组用摄像装置摄像，输入信息处理装置，在信息处理装置中，对得到的图像沿上述浓度梯度区划出多个区域，从各区域中的图像提取特征量，生成表示上述提取的特征量与浓度梯度的对应关系的信息。
6.如权利要求5所述的细胞计测方法，其特征在于，上述特征量是通过细胞的图像表示的对比度的差异而提取的特征量。
7.如权利要求6所述的细胞计测方法，其特征在于，将相对于各区域存在的细胞整体的个数的、在该区域具有特定性质的细胞个数的比例作为特征量从上述各区域的图像提取。
8.如权利要求7所述的细胞计测方法，其特征在于，上述特定的性质是细胞的脱颗粒。
9.如权利要求8所述的细胞计测方法，其特征在于，上述细胞是肥大细胞。
10.如权利要求6所述的细胞计测方法，其特征在于，将各区域存在的细胞整体的运动的平均值、中央值、分散及标准偏差中任一个指标作为特征量从上述各区域的图像提取。
11.如权利要求10所述的细胞计测方法，其特征在于，作为上述特征量提取的是有关细胞的运动速度的指标。
12.如权利要求10所述的细胞计测方法，其特征在于，作为上述特征量提取的是有关细胞的运动方向特异性的指标。
13.一种细胞计测方法，其特征在于，使用细胞观察支援装置和信息处理装置，进行下述处理其中，细胞观察支援装置具有在观察时容纳用于观察的细胞组的细胞容纳区域、和夹着上述细胞容纳区域而连通，且在使用时分别装入液体并用液体将上述细胞容纳区域充满的第一储液空间及第二储液空间；信息处理装置在使用时获取上述细胞容纳区域容纳的细胞组的图像，基于获取到的图像收集有关细胞的信息，进行的处理为配置用于上述观察的细胞组，在向第一储液空间及第二储液空间和上述细胞容纳区域注满液体，并且在上述第一储液空间的液体中添加了刺激上述细胞的细胞刺激物之后，通过上述摄像装置在不同的定时多次取得细胞组的图像；对于各次取得的上述图像，将上述图像中显示的细胞容纳区域从第一储液空间侧沿第二储液空间侧分为多个区域，将各区域含有的细胞的总个数进行计算，同时识别表示预定的特征量的特定的细胞，将其个数进行计算；基于上述的个数计算结果，对各区域算出相对于在各区域内计算的总个数的显示特征量的特定的细胞个数的比例；生成表示有关显示上述特征量的特定的细胞个数的比例的经时变化的信息；根据指令输出表示上述经时变化的信息。
全文摘要
本发明提供一种在计测有关细胞的反应时，可以在宽范围浓度范围内一次性进行计测的技术。在充满了液体(120)的细胞容纳空间(110)中配置细胞组(200)。向细胞容纳空间(110)内的液体供给特定的物质，从该细胞容纳空间(110)的一端(111)朝另一端(112)在液体(120)中形成特定物质(130)的浓度梯度(131)。将细胞容纳空间(110)内的细胞组用摄像装置(320)摄像，输入信息处理装置，通过信息处理装置，对得到的图像沿上述浓度梯度区划出多个区域，从各区域中的图像提取特征量，生成表示提取到的特征量和浓度梯度的对应关系的信息。
文档编号C12Q1/02GK101036043SQ200580033510
公开日2007年9月12日 申请日期2005年12月7日 优先权日2004年12月7日
发明者新田尚 申请人:艾菲克特细胞研究所股份有限公司