专利名称：细胞剥离剂和细胞片剥离方法
技术领域：
本发明涉及细胞剥离剂和细胞片的剥离方法。
背景技术：
在容器内培养的细胞片附着于容器表面，回收该细胞片时使用ディスパ-ゼ(注册商标)等蛋白分解酶，进行由容器表面剥离的操作。上述使用蛋白分解酶进行的剥离操作中，不仅会对细胞造成损伤，伴随着培养而产生的细胞外基质也分解。另外，蛋白分解酶大多来自动物材料，在应用于再生医疗用的细胞片时存在着安全性的问题。针对该问题，例如在特公平6-104061号公报中提出了无需使用蛋白分解酶即可剥离附着于容器表面的培养细胞并回收的方法。即，准备表面用聚-N-异丙基丙烯酰胺覆盖的培养皿，在该培养皿上、在37℃进行牛主动脉血管内细胞的培养，然后冷却至4℃，将培养皿的表面由疏水性转为亲水性，使培养细胞剥离并回收。
发明内容
但是上述公报中，使培养细胞剥离时必须对温度进行控制，因此很难说操作简便。
本发明的目的之一在于提供通过简便的操作可以将附着于容器表面的细胞剥离的细胞剥离剂。本发明的目的之一还在于提供使用该细胞剥离剂，将附着于容器表面的细胞片剥离的方法。
为实现上述目的的至少一部分，本发明采取了以下方法。
本发明的细胞片剥离剂含有氨基化聚轮烷。该细胞片剥离剂不会对细胞造成损伤，还无需控制温度即可将附着于容器表面的培养细胞剥离。
形成本发明的细胞剥离剂骨架的聚轮烷具有以下结构在使多个环状分子贯穿线状分子的状态下，在线状分子的两端结合大体积的罩，使环状分子不会脱离。
这里，线状分子优选为选自聚乙二醇、聚丙二醇、星形聚乙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、聚乙烯基醚、高支链聚醚、高支链低聚乙二醇、高支链低聚丙二醇、聚(氧杂环丁烷)、聚(ε-己内酯)、聚乳酸、聚(ε-己内酯)和聚乳酸的共聚物、聚乳酸和聚乙二醇的共聚物、聚(ε-赖氨酸)、聚酰胺、聚(亚氨基低聚亚甲基)、紫罗烯、ポリビニルジェンクロルド、聚丙烯、低聚丙烯、聚乙烯、低聚乙烯、聚(亚烷基苯并咪唑)、聚氨酯、ポリ(ビォロゲン)、聚(N-二甲基十亚甲基铵)、聚(二甲基硅氧烷)、聚苯胺、聚碳酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(N-酰基丫丙啶)、聚丫丙啶、聚(4-乙烯基吡碇)-十二烷基苯磺酸复合物、富勒烯(フラ-レン)-聚乙二醇结合物、疏水化多糖、聚乙二醇-多糖接枝共聚物、聚丙二醇-多糖接枝共聚物、二苯基己三烯的一种或多种。该线状分子的平均分子量优选200-1000000，更优选400-50000，特别优选1000-5000。
环状分子优选为α、β或γ-环糊精，也可以是具有与其类似的环状结构的物质，上述环状结构有环状聚醚、环状聚酯、环状聚醚胺、环状多元胺等。线状分子和环状分子的组合优选α-环糊精和聚乙二醇的组合。
大体积的罩只要具有使环状分子无法脱离的结构即可，优选为具有大体积取代基的生物体亲和性基团，优选经由水解性键导入到线状分子的两个末端。这里，生物体亲和性基团只要是对生物体的亲和性高的基团即可(对生物体安全性高的基团)，可以是任何基团，例如优选氨基酸、低聚肽，低聚糖类或糖衍生物。氨基酸例如有丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、组氨酸等。作为低聚肽例如有上述多种氨基酸以肽键结合而形成的肽等。另外，低聚糖类的重复单元为1-10左右，有由构成葡聚糖、透明质酸、壳多糖、脱乙酰壳多糖、海藻酸、硫酸软骨素、淀粉等多糖类的单糖构成的低聚糖，或环状低聚糖α、β或γ-环糊精等。作为糖衍生物例如有将低聚糖类、多糖或单糖进行乙酰化或异丙基化等化学改性而成的化合物等。其中，优选具有苯环的氨基酸，例如L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸等。另外，大体积的取代基只要是可以防止环状分子从线状分子上脱落即可，可以是任何基团，例如优选具有一个或以上苯环的基团、或具有一个或以上叔丁基的基团。具有一个或以上苯环的基团例如有苄氧基羰基(Z)、9-芴甲基氧基羰基(Fmoc)、苄基酯基(OBz)等；具有一个或以上叔丁基的基团有叔丁基羰基(Boc)、氨基酸叔丁酯(OBu)等，其中优选苄氧基羰基。水解性键优选在生物体内水解的键，如果考虑在生物体内迅速地非酶性水解，则优选酯键。
本发明的细胞剥离剂中含有的氨基化聚轮烷，只要是聚轮烷中含有的环糊精骨架中的至少一部分羟基被具有氨基的取代基取代的化合物即可。这里，环糊精骨架中的羟基优选为形成环糊精骨架的葡萄糖的羟基，更优选为该葡萄糖的6位羟基。另外，具有氨基的取代基没有特别限定，优选为-OOCNH-A-NR1R2(A为可具有支链的烃链，R1和R2可以相同或不同，为氢或可具有支链的烃基)。这里，A优选为碳原子数为2-4的可具有支链的烃链，例如有-(CH2)2-、-CH(CH3)CH2-、-CH2CH(CH3)-、-(CH2)3-、-CH(CH2CH3)CH2-、-CH2CH(CH2CH3)-、-CH(CH3)CH2CH2-、-CH2CH(CH3)CH2-、-CH2CH2CH(CH3)-、-(CH2)4-等。R1和R2优选为氢或碳原子数1-5的可具有支链的烃基，后者烃基例如有甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基等。-OOCNH-的部位可以认为是发挥连接作用的部位，并不限于该结构，例如还可以是-OCOO-、-OOC-、-OCH2-、-OC(OH)CH2-、-OC(＝S)NH-等。
本发明的细胞剥离剂用于剥离附着在容器表面的细胞(贴壁依赖性细胞)。这里，贴壁依赖性细胞例如有软骨细胞、成骨细胞、成纤维细胞、表皮细胞、上皮细胞、脂肪细胞、肝细胞、胰细胞、肌细胞或它们的前体细胞、间叶干细胞、胚胎干细胞(ES细胞)等。
本发明的细胞剥离剂优选用于剥离附着于容器表面的细胞片、特别是表皮细胞的细胞片。剥离细胞片的方法可以包含以下步骤使细胞贴壁于容器表面进行培养，制成细胞片的培养步骤；在该培养步骤后，更换为添加有本发明的细胞片剥离剂的培养基，使细胞片由容器表面剥离的剥离步骤。这里所述培养基只要是在剥离步骤中不会使构成细胞片的细胞死亡的液体即可，不仅可以使用DMEM等基础培养基、或基础培养基中添加了增殖因子的增殖用培养基，也可以是生理盐水或磷酸缓冲液等液体。还可以包含在剥离步骤之后将剥离的细胞片进行回收的回收步骤。这里，还可以在剥离步骤中一边培养细胞一边将细胞片由容器表面缓慢剥离。回收步骤中，可以通过将剥离的细胞片附着于悬挂支撑膜上，然后提起回收。这里，悬挂支撑膜指只要是可将达到规定状态的细胞原样地整体悬挂的膜即可，例如有无菌纱布、无菌纸、无菌滤纸、无菌无纺布，还可以是PVDF膜(聚偏氟乙烯膜)或PTFE膜(聚四氟乙烯膜)等亲水性膜，硅橡胶等具有柔软性的高分子材料，或聚二醇酸、聚乳酸等生物降解性聚合物，或琼脂培养基，或将胶原、明胶凝胶等水凝胶等制成片状所得等。
附图简述
图1是表示氨基化聚轮烷的合成顺序的说明图。
实施例[实施例1]按照以下的顺序合成聚轮烷(参照图1)。
经由酯键合成两末端具有氨基的PEG将33g(10mmol)分子量为3300的聚乙二醇(PEG)和20g(200mmol)琥珀酸酐溶解于200ml甲苯中，将该溶液在150℃回流5小时。反应终止后，倒入到过量的二乙醚中，过滤并减压干燥，得到粗产物，将其溶解于二氯甲烷中，通过离心除去不溶物质，倒入到过量的二乙醚中，进行过滤并减压干燥，得到为白色粉末的、两个末端具有羧基的PEG(化合物A)。将20g(5.7mmol)该化合物A和17.1g(148.2mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)溶解于350ml 1，4-二噁烷和二氯甲烷的混合溶液中(体积比1∶1)，冰冷却后，加入23.5g(114mmol)二环己基碳二亚胺(DCC)。冰冷却下搅拌1小时，然后在室温下搅拌过夜。滤除副产物二环己脲，滤液经浓缩后倒入到过量的二乙醚中，过滤并减压干燥后得到白色粉末的羧基活化的PEG(化合物D)。接着，向75ml溶解有0.4ml(6mmol)乙二胺的二氯甲烷中滴加75ml溶解有10g(2.7mmol)化合物B的二氯甲烷，滴加结束后在室温下搅拌1小时。反应终止后，将溶液倒入到过量的二乙醚中，过滤并减压干燥，得到为白色粉末的、两个末端具有氨基的PEG(化合物C)。
准聚轮烷的制备在室温下，向48g(49.2mmol)α-环糊精(α-CD)的311ml饱和水溶液中滴加4g(1.12mmol)化合物C的20ml水溶液。用超声波处理1小时，同时搅拌，然后在室温下搅拌24小时。通过离心回收白色沉淀物，在50℃减压干燥，得到白色粉末的准聚轮烷。聚轮烷是指线状分子(例如PEG)贯穿多个环状分子(例如环糊精)，并将该线状分子的两个末端用大体积取代基封住，准聚轮烷是指尚未用大体积取代基封住聚轮烷的两个末端的化合物。
末端封端剂的制备为了导入作为防止α-CD离去的大体积取代基的苄氧基羰基-L-苯丙氨酸(Z-L-Phe，Z表示苄氧基羰基)，进行Z-L-Phe的羧基的活化。即，将100g(334mmol)Z-L-Phe溶解于800ml 1，4-二噁烷中，一边冰冷却一边加入38.42g(334mmol)HOSu。1小时后缓慢加入溶解有75.7g(367mmol)DCC的200ml 1，4-二噁烷溶液，冰冷却下搅拌1小时，然后在室温下搅拌过夜。滤除副产物二环己脲，滤液在浓缩后倒入到过量的二乙醚中，过滤并减压干燥后得到粗产物。将粗产物溶解于二氯甲烷中，使其在室温下尽量达到饱和浓度，然后适量加入石油醚并冷藏，进行重结晶。滤取晶体，减压干燥，得到白色针状晶体的Z-L-Phe琥珀酰亚氨酯(Z-L-Phe-OSu)。
聚轮烷的制备将80g(200mmol)Z-L-Phe-OSu溶解于60ml二甲基亚砜(DMSO)，加入45g(2mmol)准聚轮烷。将该不均匀溶液在室温下搅拌，同时少量多次加入DMSO，搅拌96小时，使其均匀。反应终止后，将反应溶液倒入到过量的二乙醚中，得到粗产物。将粗产物依次用丙酮、二甲基甲酰胺(DMF)洗涤，除去杂质(未反应的Z-L-Phe-OSu、α-CD、化合物C等)，过滤并减压干燥，得到为白色粉末的生物降解性聚轮烷。合成的确认通过1H-NMR进行。另外，由1H-NMR中的PEG的质子和α-CD的C(碳)的1位质子的积分比求出该聚轮烷中α-CD的贯穿数，为17。
按照以下的顺序制备CDI活化聚轮烷。即，在氮气氛下，将1g(0.0369mol，CD＝0.871mmol，OH＝15.6mmol)实施例1所得的聚轮烷溶解于10ml DMSO中。加入2.54g(15.6mmol；与聚轮烷中的羟基等量)N，N-羰基二咪唑(CDI)，在氮气氛下、室温下进行反应，经过3小时后滴加乙醚，生成白色沉淀物，将其过滤，在室温下减压干燥，得到为白色粉末的CDI活化聚轮烷(CDI-PR)。使用紫外吸收分光光度计，由207nm吸光度计算该CDI-PR的活化率，为91.37％。
如下制备氨基化聚轮烷或磺化聚轮烷、羧基化聚轮烷。
按照以下顺序制备氨基化聚轮烷。即，将1g(0.029mmol)实施例2所得的CDI-PR溶解于20ml二甲基亚砜(DMSO)中，向其中加入过量的氨基化试剂，在室温下搅拌3小时。然后将反应溶液倒入到过量的二乙醚中，将所得沉淀物用同样的溶剂洗涤，得到目标氨基化聚轮烷。其中，将使用氨基化试剂1，2-二氨基丙烷的作为样品No.1(导入的胺数为16，α-CD贯穿数为17)，将使用1，3-二氨基丙烷的作为样品No.2(导入的胺数为38，α-CD贯穿数为17)，将使用N，N-二甲基-1，2-二氨基乙烷的作为样品No.3(导入胺数为158，α-贯穿数为17)，将使用N，N-二甲基-1，3-二氨基丙烷的作为样品No.4(导入的胺数为128，α-CD贯穿数为17)。
按照以下顺序制备羧基化聚轮烷。即，按照实施例1制备将贯通了很多α-CD空洞部的PEG(分子量4000)的两末端用Z-酪氨酸封端，制备聚轮烷。该聚轮烷通过琥珀酸酐进行酯化，合成在α-CD羟基上导入了羧基乙基酯(CEE)基团的水溶性羧基化聚轮烷(导入的CEE数为188，α-CD贯穿数为15)。将该羧基化聚轮烷作为样品No.5。
按照以下顺序制备磺化聚轮烷。即，使用水溶性碳二酰亚胺作为缩合剂，向上述合成的羧基化聚轮烷中导入牛磺酸、得到磺化聚轮烷(导入的牛磺酸数为117，α-CD贯穿数为9)。以该磺化聚轮烷为样品No.6。以实施例1的聚轮烷作为样品No.7。下表1给出了各样品的结构性特征。
对于各聚轮烷样品，按照以下顺序进行细胞剥离试验。即，正确地称量各聚轮烷样品，然后加入70％乙醇，制备200m/ml的溶液或悬浮液。然后用70％乙醇制备0.02-20mg/ml的稀释系列，将各100μL添加到96孔板中，在超净工作台内以排风的状态干燥过夜。添加100μL细胞增殖用培养基，搅拌1小时。再溶解聚轮烷，然后分别添加100μLNIH3T3细胞悬浮液(高密度条件3×105细胞/ml、中密度条件9×104细胞/ml、低密度条件3×104细胞/ml)。聚轮烷的终浓度为0.01、0.1、1、10mg/ml，NIH3T3细胞密度为1、3、10×104细胞/cm2。然后，在5％CO2、37℃的条件下培养8天，用显微镜进行观察。
结果，在含有羧基化聚轮烷(样品No.5)、磺化聚轮烷(样品No.6)和α-CD羟基无取代的聚轮烷(样品No.7)的培养基中，与接种密度无关，在浓度为1mg/ml或以下时，只见与板面附着并增殖，未见到剥离，在浓度10mg/ml时，细胞不贴壁、不增殖。
与此相对，在导入了伯胺的氨基化聚轮烷(样品No.1、2)中，在浓度为0.1-1mg/ml、接种密度为中、高密度条件时，至培养的第三天，细胞增殖为片状并剥离，并且收缩，形成一个球状体。由此可推测，氨基化聚轮烷与细胞弱结合，部分抑制细胞与板面的附着，在形成片后，细胞的片的收缩力高于板面与细胞的附着力，剥离成片状。因此，在形成球状体之前的片状阶段，可以使用细胞片支撑体回收细胞片。另外，在该氨基化聚轮烷中，在浓度为10mg/ml、接种密度为中、高密度的条件下，培养的第一天，细胞集落凝聚，形成很多小球状体。由此可以推测，与呈片状剥离、形成一个球状体的情况相比，氨基化聚轮烷与细胞的结合量多，在形成小的集落的阶段，细胞集落的片收缩力高于板面与细胞的附着力。
另一方面，在导入了叔胺的氨基化聚轮烷(样品No.3、4)中，在浓度为10mg/ml的高密度条件下，培养至第二、三天，细胞集落凝聚，形成很多小球状体，而在同样浓度的中、低密度条件下，细胞只是与板附着并增殖。由此可以推测，导入了叔胺的氨基化聚轮烷与导入了伯胺的氨基化聚轮烷相比，与细胞的附着性弱。
以上的细胞剥离试验是将培养步骤和剥离步骤同时进行，如果在培养步骤中在汇合之前添加氨基化聚轮烷，则细胞增殖成片状，并且通过片收缩力由容器表面剥离，例如由上方落在亲水处理的PVDF膜(聚偏氟乙烯膜)上，使细胞片与该PVDF膜上接触，然后分别提起每张膜，可以剥离并回收细胞片。
本发明以2004年9月30日提出的日本国特许出愿2004-286163号作为优先权主张的基础，其内容全部引入本发明中。
产业实用性本发明可用于再生医疗领域。
权利要求
1.细胞剥离剂，该细胞剥离剂含有氨基化聚轮烷。
2.权利要求1的细胞剥离剂，其中，所述氨基化聚轮烷是聚轮烷中所含的环糊精骨架中的至少一部分羟基被具有氨基的取代基取代的化合物。
3.权利要求2的细胞剥离剂，其中，上述聚轮烷是在使多个环状分子贯穿线状分子的状态下，经由水解性键向线状分子的两端导入具有大体积取代基的生物体亲和性基团的化合物。
4.权利要求2或3的细胞剥离剂，其中，上述具有氨基的取代基为-OOCNH-A-NR1R2，其中A为可具有支链的烃链，R1和R2可以相同或不同，为氢或可具有支链的烃基。
5.权利要求4的细胞剥离剂，其中，A为碳原子数为2-4的、可具有支链的烃链。
6.权利要求4或5的细胞剥离剂，其中，R1和R2可以相同或不同，为氢或碳原子数为1-5的、可具有支链的烃基。
7.权利要求1-6中任一项的细胞剥离剂，该细胞剥离剂用于剥离附着在容器表面的细胞片。
8.细胞片的剥离方法，该方法包含以下步骤使细胞附着于容器表面进行培养、制成细胞片的培养步骤；在上述培养步骤之后，更换为添加有权利要求7的细胞片剥离剂的培养基，使上述细胞片从上述容器表面剥离的剥离步骤。
9.权利要求8的细胞片剥离方法，该方法还包含在上述剥离步骤后，将上述剥离的细胞片回收的回收步骤。
全文摘要
本发明的细胞片剥离剂含有氨基化聚轮烷，这里，形成本发明的细胞剥离剂骨架的聚轮烷具有以下结构在使多个环状分子贯穿线状分子的状态下，在线状分子的两端结合大体积的罩，使环状分子不会脱离。本发明的细胞剥离剂中所含的氨基化聚轮烷是聚轮烷中含有的环糊精骨架上至少一部分羟基被具有氨基的取代基取代的化合物。根据该细胞片剥离剂，不会对细胞造成损伤，无需进行温度控制，可以将附着于容器表面的培养细胞剥离。
文档编号C12N5/10GK101031636SQ20058003319
公开日2007年9月5日 申请日期2005年9月9日 优先权日2004年9月30日
发明者W·塔查布恩阿基艾, 加藤雅一, 大谷亨, 由井伸彦 申请人:独立行政法人科学技术振兴机构, 株式会社日本组织工程, 国立大学法人北陆先端科学技术大学院大学