一种同时检测草莓中四种真菌毒素的方法与流程

本发明属于食品检测技术领域，更具体涉及一种同时检测草莓中四种真菌毒素的方法，该方法而适用于浆果中腾毒素(ten)、链格孢烯(alt)、链格孢酚单甲醚(ame)、链格孢酚(aoh)这四种毒素的检测。

背景技术

草莓在生长、保藏以及售卖过程中中容易受到霉菌的污染而产生链格孢毒素、赭曲霉毒素a、展青霉毒素等各种真菌毒素，这些真菌毒素毒性较大，严重影响人们对草莓和葡萄果实的食用、以及对草莓和葡萄的加工利用，对消费者的健康具有很大的损伤，甚至威胁生命。

草莓样品中均含有链格孢毒素，其中链格孢酚(aoh)和链格孢酚单甲醚(ame)检测阳性的比例达到42％和55％。

草莓从生长、采集、贮存以及加工过程中均可能污染各种真菌并产生真菌毒素。草莓汁及其他制品的原材料均来自于草莓，一旦原材料受到真菌毒素的污染，常规的方法一般无法将其彻底去除，往往会不可避免的污染注射剂成品。

由于草莓的基质复杂，且含有多糖，多酚，维生素等，加之真菌毒素种类繁杂，含量通常为μg/kg，这样的特点要求检测方法必须灵敏度高，对多种毒素尽可能同时做出分析，以节省时间、成本和提高结果的全面性、可靠性。

技术实现要素：

本发明的目的是在于提供了一种同时检测草莓中四种真菌毒素的方法，方法易行，操作简便，该方法先对样品进行提取净化处理，然后采用液相色谱串联质谱法测定样品中多种真菌毒素的含量。本方法具有快速、适用性广等特点。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种同时检测草莓中四种真菌毒素的方法，其步骤是：

(1)取适量均质后的草莓样品(2±0.01g)，进行干燥；

(2)加入提取溶剂，进行提取，得到提取液；

(3)向步骤(2)提取液中加入4g无水硫酸镁和1g氯化钠，进行离心处理，取上清液进行干燥，得到干燥物；

(4)将步骤(3)中的干燥物用70％(v/v)甲醇水溶解，过0.22μm微孔滤膜，滤液经超高效液相色谱-串联质谱进行定性和定量测定；可以具体检测出草莓中的链格孢酚(aoh)、链格孢酚单甲醚(ame)、链格孢烯(alt)、腾毒素(ten)四种毒素的含量；

所述的步骤(1)中干燥方法为氮气吹干、冷冻干燥或旋蒸中的任意一种；

所述的步骤(2)中提取溶剂为1％(v/v)乙酸的乙腈/水(80∶20，v/v)，提取方式为振荡、涡旋、超声中的任意一种；

所述的步骤(3)中无水硫酸镁和氯化钠的加入方法为quechers方法；

所述的步骤(4)中的检测方法为外标法(以链格孢酚(aoh)、链格孢酚单甲醚(ame)、链格孢烯(alt)、腾毒素(ten)作为外标进行定量)；

所述的四种真菌毒素为链格孢酚(aoh)、链格孢酚单甲醚(ame)、链格孢烯(alt)、腾毒素(ten)。

提取溶剂的选择尤为重要，适合提取溶剂的选择原则是，对有效成分等有着较小溶解性的同时，对毒素有着良好的溶解性。通过对多种注射剂品种及真菌毒素的基质效应及提取效率的考察，高浓度的乙睛溶液成为了理想的选择，加入后，能沉淀大部分杂质，显著提高检测的灵敏度。

本实验考察使用乙腈、氯仿和乙酸乙酯作为提取溶剂提取回收率，考察使用氯仿提取目标毒素时，4种毒素的加标回收率均低于50％，乙酸乙酯提取时，四种链格孢毒素的回收率均低于50％，其中链格孢酚单甲醚(ame)和链格孢酚(aoh)只有15％左右，并且乙酸乙酯提取过程中很容易将草莓中的色素提取出来，定容后的会发现有很多水溶性的杂质，很难去除。乙腈提取过程中回收率都较高，均超过60％，且乙腈在加盐析剂是可以很好的与水分层，减少水溶性的杂质提取。因此决定使用乙腈作为提取溶剂。

本实验分别考察了乙腈与水的比例，乙腈占比40％、60％、80％作为提取剂提取毒素的效率影响。结果表明：40％乙腈水作为提取溶剂，毒素回收率最低，只有40％～60％，而80％乙腈作为提取溶剂，毒素回收率最高，4种目标真菌毒素的回收率均高于80％。说明乙腈/水比例越高，毒素的回收率越高。(水溶液中的乙腈比例在80％～85％的时候回收率最高。当溶剂为乙腈水且体积比在80～85％之间时，多种毒素的提取效率均达到较高水平。因此确定80％乙腈水作为提取溶剂的比例。

由于很多真菌毒素属于偏酸性的化合物，在偏碱性的溶剂中稳定性比较差。本实验分别以乙腈和乙酸-乙腈为提取液，分别对样品进行提取。结果发现，加酸后毒素的回收率均有一定程度的提高。因此确定乙腈中加入乙酸作为提取溶剂。

在固相萃取柱的选择上，本发明比较了固相萃取小柱(c18)、固相萃取小柱(hlb)、多功能净化柱(mycosep226)以及quechers方法对多种真菌毒素的回收效果，结果发现：固相萃取小柱(c18)净化后4种真菌毒素回收率均不高，固相萃取小柱(hlb)净化后链格孢酚单甲醚(ame)、链格孢酚(aoh)回收率比较低，多功能净化柱(mycosep226)的4种链格孢毒素的回收率低，quechers方法可以达到四种毒素回收率最高。最终不选择使用固相萃取柱净化，选择使用quechers方法。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

本发明在草莓中验证了本发明方法的线性、灵敏度、回收率、精密度及重现性，结果表明本发明检测方法的上述指标均良好。本发明方法为首次应用于草莓中4种真菌毒素的检测与分析，具有快速、简便、适用性广等特点，对于控制草莓果实的风险、提高食品安全性具有重要的意义。

确定了方法后，4种毒素的加标回收率在60％～118％之间，4种真菌毒素在3.0～120μg/l的内都表现良好的线性关系(r²＞0.999)，检出限在0.11～0.91μg/kg之间，相对标准偏差为1.1％～6.34％，本方法表现出良好的精密度、检出限低和回收率高等优点，可同时检测草莓样品中4种真菌毒素。

附图说明

图1为一种混合对照品溶液中链格孢烯(alt)的总离子流图；

图2为一种混合对照品溶液中腾毒素(ten)的总离子流图；

图3为一种混合对照品溶液中链格孢酚单甲醚(ame)的总离子流图；

图4为一种混合对照品溶液中链格孢酚(aoh)的总离子流图；

图5为一种乙腈含量对4种毒素回收率的影响，通过对比添加乙腈水中乙腈的比例的不同对四种毒素的回收率的影响；

图6为一种乙酸含量对4种毒素回收率的影响，通过对比乙酸是否添加对四种毒素回收率的影响；

图7为一种净化方法对4种毒素回收率的影响，通过对比c18柱子、226柱子、hlb柱子以及quechers方法对四种毒素回收率的影响。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例1：

一种同时检测草莓中四种真菌毒素的方法，其步骤是：

(1)取适量均质后的草莓样品(2±0.01g)，进行干燥，干燥方法为氮气吹干、冷冻干燥或旋蒸中的任意一种；

(2)加入提取溶剂，进行提取，得到提取液，所述的提取溶剂为1％(v/v)乙酸的乙腈/水(80∶20，v/v)，提取方式为振荡、涡旋、超声中的任意一种；

(3)向步骤(2)提取液中加入4g无水硫酸镁和1g氯化钠，进行离心处理，取上清液进行干燥，得到干燥物，所述的无水硫酸镁和氯化钠的加入方法为quechers方法；(4)将步骤(3)中的干燥物用70％(v/v)甲醇水溶解，过0.22μm微孔滤膜，滤液经超高效液相色谱-串联质谱进行定性和定量测定，所述的检测方法为外标法，可以准确、快速的检测出样品中的毒素含量。

通过上述技术措施，解决了加标回收率比较低，杂质比较多会损伤柱子的问题。其发明相对于现有技术的进步在于达到了将样品中的杂质清楚，提高回收率，均达到80％以上，可以尽最大程度的提取出草莓样品中的毒素。技术方案与现有技术的主要区别可以同时兼顾链格孢酚(aoh)、链格孢酚单甲醚(ame)、链格孢烯(alt)、腾毒素(ten)这四种毒素，可以很好的提取出这四种毒素。

实施例2：

一种同时检测草莓中四种真菌毒素的方法，其步骤是：

1、实验仪器与试剂

sciextriplequadtm6500超高效液相色谱-串联质谱仪(美国ab公司)，配有thermohypercarbc18色谱柱(50mm×2.1mm，1.7μm)；kq5200de超声波清洗器(江苏昆山市超声仪器有限公司)；ks260摇床(德国ika公司)；3k15离心机(德国sigma公司)；sanyomdf-382e(n)超低温冰箱(日本松下集团)；vortexgenius3涡旋混合器(德国ika公司)；milli-qa10超纯水器(美国millipore公司)；0.22μm有机滤膜(中国捷盛依科科技有限公司)。

甲醇、乙睛为色谱纯，水为超纯水，用乙腈水将腾毒素(ten)、链格孢烯(alt)、链格孢酚单甲醚(ame)、链格孢酚(aoh)配制成600μg·l^–1、600μg·l^–1、600μg·l^–1、600μg·l^–1的标准储备液，-18℃以下贮存，(4种真菌毒素均购自于新加坡pribolab公司)。草莓采购于武汉市超市。

2实验方法

2.1色谱与质谱条件

色谱柱：thermohypercarbc18色谱柱(50mm×2.1mm，1.7μm)；柱温40℃；流动相体系为：a(甲醇)+b(甲酸水)梯度洗脱程序：b的初始比例为85％，在1～5min，85％～5％b；5.1～8.0min，5％b；8.1～8.5min，5％～85％b；8.5～12min，85％b。进样量：2μl；流速：0.3ml/min。

2.2质谱条件

采用电喷雾离子源，正离子模式(esi+)；质谱扫描方式：多反应监测(mrm)；电离电压3kv，离子源温度120℃，脱溶剂温度380℃，脱溶剂气流量800l/h，碰撞气流量0.18l/min，锥孔反吹气流量50l/h。真菌毒素的监测离子、锥孔电压和碰撞电压等质谱参数：

表1种真菌毒素的串联质谱测定参数

2.3标准溶液的配置

毒素标准储备液的配制(100mg·l^–1):用乙腈水将腾毒素(ten)、链格孢烯(alt)、链格孢酚单甲醚(ame)、链格孢酚(aoh)配制成600μg·l^–1、600μg·l^–1、600μg·l^–1、600μg·l^–1的标准储备液，-18℃以下贮存。

基质空白标准溶液：以不含链格孢霉毒素的草莓果实、葡萄果实为材料，利用本实验前处理方法分别制备草莓果实、葡萄果实的基质空白溶液。分别移取适量的960、480、240、120、60和30μg/l的混合标准溶液，用基质空白溶液稀释成一系列质量浓度为96、48、24、12、6、3μg/l的基质空白标准溶液，在优化后的方法条件下测定，分别得到4种毒素的草莓的标准曲线。

3.结果

3.1线性关系和检出限

在优化的前处理方法和色谱条件下，对系列质量浓度的基质空白混合标准溶液进行检测，其线性范围和精密度结果：

表24种毒素的线性范围、线性方程、r²和检出限(lods)

3.2加标回收率

在不含真菌毒素的草莓中，分别选定高、中、低水平下加标。样品经提取、浓缩和定容后，用超高效液相色谱-串联质谱仪(uplc-ms/ms)进行检测分析。所有回收率介于65％—118％之间，精密度介于1.14％—6.34％之间(n＝6)。本方法对草莓样品中不同浓度的4种真菌毒素均有较高的回收率及不高于10％的相对标准偏差，符合检测的标准。

表3草莓种5种毒素的加标回收率

本发明方法为首次应用于中草莓中4种真菌毒素的检测与分析，具有快速、简便、适用性广等特点，对于控制草莓果实的风险、提高食品安全性具有重要的意义。