手性巯基化合物拆分新型质谱衍生化试剂的制作方法

本发明涉及生物分析领域的含巯基官能团手性代谢物分析，特别是指一种手性巯基化合物拆分新型质谱衍生化试剂。

背景技术

生物体内巯基化合物是构成蛋白质的主要物质，在人体生理活动中起着至关重要的作用，不仅参与细胞的氧化还原平衡和细胞生长，还可以表征细胞内氧化还原状态以及蛋白质的高级有序结构。细胞内巯基化合物的水平与人体的许多疾病有关。如半胱氨酸水平异常与儿童生长缓慢、毛发色素脱失、水肿、肝损害、皮肤病变等密切相关；高半胱氨酸水平异常是导致心血管疾病与阿尔茨海默病的一个重要因素，也与神经管畸形、妊娠并发症、骨质疏松症有关；谷胱甘肽与许多细胞反应过程有关，包括细胞内的氧化还原平衡、外源性物质的代谢与维持、细胞内信号传导、基因调控等。异常的谷胱甘肽水平会导致癌症、不正常的衰老、心脏疾病的发生。而生物巯基化合物大多含有一个或者多个手性中心，巯基化合物的一对手性对映体在体内的生物活性有时会有显著的差异。因此设计开发能够选择性检测手性巯基化合物的质谱手性衍生化试剂具有重要的生物学和临床意义。

目前检测巯基化合物的方法主要有高效液相色谱法（hplc），毛细管电泳，分光光度法，伏安法，质谱（ms）法。其中分光度法和伏安法因检测灵敏度低，操作复杂，结果重现性差等原因难以让人接受。而最近，荧光光谱法因具有灵敏度高、选择性强、快速简便等优点已成为研究热点，用于检测巯基化合物的荧光探针也发展迅速，各种探针不断涌现，例如：荧光碳点，荧光素类，香豆素类，罗丹明类，苯的衍生物类，吡唑啉基类等。然而，大多数用于检测巯基化合物的探针都会受到一些限制，如发射波长短（低于500nm），荧光变化很小，检出限高，响应时间长等问题。另外，能否选择合适的荧光基团和识别基团是构建荧光探针的关键，而在激发波长与发射波长处是否表现出优异的荧光稳定性则是构建荧光探针的必要条件。液相-质谱（lc-ms）法由于其高灵敏度和特异性已成为代谢物分析的有利工具，另外其操作简便，分析速度快，重现性好等优点广为大众所接受。然而，相对于荧光手性衍生化试剂，质谱手性衍生化试剂还处于发展中的阶段。现如今，利用荧光分析手段进行鉴别不同巯基化合物的文献相对较多，而以lc-ms进行拆分手性巯基化合物的相关报道则少之又少。鉴于此，开发一种基于lc-ms拆分手性巯基化合的新型质谱衍生化试剂是十分必要的。

技术实现要素：

本发明的目的是为了拆分手性巯基化合物，提供一种巯基官能团手性化合物的手性拆分用高灵敏度、高选择性质谱衍生化试剂。

本发明的技术方案为：

一种手性巯基化合物拆分新型质谱衍生化试剂，以4-羧丁基三苯基溴化膦（tpp）和手性氨基吡咯烷（pr-boc-n）,n-羟基琥珀酰亚胺(n-hydroxysuccinimide,nhs)起始物，与二氯硫化碳（cscl2）为反应合成(r)-(5-(3-

isothiocyanatopyrrolidin-1-yl)-5-oxopentyl)triphenylphosphonium(ncs-otpp)。该ncs-otpp的具体结构式如下：

chemicalformula:c28h30n2ops

exactmass:473.11

ncs-otpp。

本发明试剂本身结构中含有带有正电荷的三苯基膦结构可提高质谱中的离子化效率，因此能提高检测灵敏度。此外，该试剂结构中又含有异硫氰酸酯及一个手性中心可靶向识别带有巯基官能团的手性代谢物，进而形成一对非对映异构体，并在廉价的反相色谱柱上可拆分手性巯基化合物的新型高灵敏度质谱衍生化试剂。

本发明是以带有正电荷的三苯基膦结构为母体，以异硫氰酸酯为靶向基团开发了具有高灵敏度、高选择性的拆分手性巯基化合物质谱衍生化试剂。该质谱衍生化试剂的开发，将对发展和建立高灵敏、高选择性的生物巯基化合物的手性拆分和定量分析方法，对筛选真正有效的巯基官能团手性生物标志物具有重要意义。

本发明针对带有巯基官能团的手性化合物与新合成的手性质谱衍生化试剂ncs-otpp进行络合,开发高灵敏度、高选择性手性拆分分析方法。为巯基官能团手性代谢物的拆分研究及各种疾病手性生物标志物的筛选提供有效、可靠的分析检测手段。

下面结合附图对本发明的具体实施方式具体阐述。

附图说明

图1为ncs-otpp质谱衍生化试剂的lc-uv色谱图。

图2为ncs-otpp质谱衍生化试剂的lc-esi-tof-ms的质谱图（m/z=473.11）。

图3为手性巯基化合物的结构式。

图4为ncs-otpp质谱衍生化试剂与d/l-半胱氨酸(cysteine)的反应结构式。

图5为ncs-otpp质谱衍生化试剂与d/l-半胱氨酸(cysteine)的手性拆分lc-uv色谱图。

图6为ncs-otpp质谱衍生化试剂与d/l-青酶胺(penicillamine)的反应结构式。

图7为ncs-otpp质谱衍生化试剂与d/l-青酶胺(penicillamine)的手性拆分lc-uv色谱图。

图8为ncs-otpp质谱衍生化试剂与二硫苏糖醇（dithiothreitol,dtt），二硫赤藓糖醇(dithioerythritol,dte)的反应结构式。

图9为ncs-otpp质谱衍生化试剂与二硫苏糖醇（dithiothreitol,dtt），二硫赤藓糖醇(dithioerythritol,dte)的手性拆分lc-uv色谱图。

具体实施方式

ncs-otpp的合成：

n-[1-oxo-5-(triphenylphosphonium)pentyl]-(s)-3-aminopyrrolidine(otpa),50mg溶解在4ml乙腈溶液中,二氯硫化碳150ul溶解于乙腈溶液中，将两种溶液混合，在恒温磁力搅拌器上60℃下反应8小时，减压蒸除溶剂。将所得残余物重新溶解在100ml水中，然后加入相同体积的二氯甲烷，充分静止后，弃水层。然后，再加入等量的二氯甲烷萃取，重复萃取三次。合并的二氯甲烷层，用无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压蒸干，得黄色油状物9.98mg。lc-esi-tof-ms谱图数据(m/z):473.11[m]⁺;1h-nmr(cdcl3,500mhz,ppm):δ7.80-7.70(m,15h,ar-h),4.16-4.03(m,1h,-ch-ncs),3.76-3.61(m,4h,-ch2-n-ch2-),2.76-2.62(m,2h,-p-ch2-),2.36-2.04(m,4h,-co-ch2-,-ch2-ch-ncs),1.93-1.82(m,2h,-co-ch2-ch2),1.33-1.28(m,2h,-p-ch2-ch2).13c-nmr(cdcl3,125mhz,ppm):δ172.59,135.09(3c),133.96(3c),133.88(3c),130.65(4c),130.55(3c),118.65,118.02,117.97,56.73,54.95,52.77,33.83,32.18,29.71,25.41,22.23.产率约为18.19%。

本发明的ncs-otpp试剂含有含有异硫氰酸酯及一个手性中心可靶向识别带有巯基官能团的手性代谢物。对3种巯基化合物进行了手性拆分，结果分离度（rs）为1.78-7.45.。首次在廉价的反相色谱柱上对3种手性氨基酸全部达到了手性拆分。手性拆分效果及能力明显高于现有的手性衍生化试剂。本试剂可利用液相色谱-质谱（lc-ms）技术，建立巯基官能团手性化合物拆分高灵敏、高选择性的分析方法。为巯基官能团手性代谢物的拆分研究及手性生物标志物的筛选提供有效、可靠的手性质谱衍生化试剂。

具体数据：

从图1和图2的紫外色谱图和质谱图中我们可以看出，合成的ncs-otpp试剂分子量与检测出的质荷比m/z=473.11[m]⁺一致。可以判断合成的化合物确实是ncs-otpp试剂。具体¹h-nmr数据请参照ncs-otpp合成部分。另外，从图1,图2的中我们可以看出ncs-otpp质谱衍生化试剂的纯度均达到98.0%以上。

图3，图4具体表示分析对象手性巯基化合物的结构式和ncs-otpp质谱衍生化试剂和d/l-半胱氨酸(cysteine)的反应结构式。ncs-otpp与手性巯基化合物的巯基官能团反应生成含有两种手性中心的非对映体，可在廉价的反相色谱中进行手性拆分。

从图5中可以看出在lc-uv上d/l-半胱氨酸达到完全手性分离，分离度(rs)为1.78。

图6ncs-otpp质谱衍生化试剂与d/l-青酶胺(penicillamine)的反应结构式。

从图7中可以看出在lc-uv上青酶胺达到完全手性分离，分离度(rs)为2.95。

图8ncs-otpp质谱衍生化试剂与二硫苏糖醇（dithiothreitol,dtt），二硫赤藓糖醇(dithioerythritol,dte)的反应结构式。

从图9中可以看出在lc-uv上二硫苏糖醇（dtt），二硫赤藓糖醇(dte)得到良好的手性拆分效果，分离度(rs)为7.45。