鉴定IC50剂量维生素C对RAW264.7和K562细胞差异标志物的方法与流程

本发明涉及应用核磁共振的代谢组学技术鉴别ic50剂量维生素c对raw264.7和k562细胞差异性标志物的方法，属于¹hnmr的代谢组学分析技术。

背景技术：

代谢组学：

代谢组学是鉴定和定量小分子代谢物的分析技术，通过现代超高效液相色谱/高分辨质谱联用等技术分析体液中的代谢物组成谱，利用多变量统计分析技术把所有代谢物的信息整合到一起，在系统和整体层面上比较和分析生物的差异性代谢物的技术。

目前常用的检测仪器有高效液相色谱(hplc)、气相色谱(gc)、质谱(ms)、核磁共振(nmr)、红外光谱(ir)等，其中核磁共振技术灵敏度较高，重复性好，样品处理简便，成本较低，可体外、体内检测，可对代谢物变化进行定性和定量分析。

维生素c代谢物鉴定现状：

维生素c(vitaminc)，又名l-抗坏血酸，一种强氧化剂，是许多重要酶的辅因子。根据who(worldhealthorganization)数据表明正常成年人对维生素c的推荐摄入量(recommendednutrientintakes,rnis)为10mg/day，可耐受最高摄入量(tolerableupperintakelevel,ul)为2000mg/day，目前尚未有利用核磁共振代谢组学方法同时研究体外高剂量维生素c对于正常细胞和癌细胞的影响。已知高剂量维生素c对癌症的细胞毒性比对正常细胞的细胞毒性大，但作用机理未知。目前有文献利用毛细管-飞行时间质谱技术(ce-tofms)探究了ic50剂量维生素c对糖酵解、三羧酸循环(tca)和磷酸戊糖途径(ppp)中相关代谢物的影响，但代谢物变化的生物学意义尚不清楚；且维生素c诱导的细胞中代谢物变化情况未知，生物学意义也未知。

因此，有必要研究维生素c在小鼠巨噬细胞raw264.7和慢性髓性白血病胸腔积液淋巴细胞k562的ic50浓度时，对不同细胞差异性代谢产物以及代谢通路的影响，这有助于进一步了解维生素c的亚毒性，对高剂量维生素c的作用提供一基础性研究。

技术实现要素：

针对现有技术中的不足，本发明的第一个目的是提供一种ic50剂量维生素c对raw264.7或k562细胞亚毒性的分析方法，包括以下步骤：

(1)确定维生素c对raw264.7或k562细胞的ic50剂量；

(2)细胞萃取液的制备：

维生素c组细胞萃取液的制备：将raw264.7或k562细胞在相应的维生素cic50剂量下进行培养，培养24h后加入冷甲醇使细胞代谢淬灭，然后采用甲醇氯仿水提取法进行超声破碎提取，收集水相；

空白组细胞萃取液的制备：将raw264.7或k562细胞进行培养，培养24h后加入冷甲醇使细胞代谢淬灭，然后采用甲醇氯仿水提取法进行超声破碎提取，收集水相；

(3)核磁共振预处理：

将维生素c组和空白组的水相蒸干后采用含有(3－三甲基硅烷基)－2,2,3,3－四氘代丙酸钠(tsp)的d2o溶解，离心，冻干；将冻干之后的样品用d2o配制的磷酸盐缓冲液溶解，离心，得到上清液；

(4)¹h核磁共振检测：将核磁共振预处理后的维生素c组和空白组的上清液进行核磁共振检测，获得细胞核磁共振谱图，从而得到raw264.7或k562细胞样品中代谢物的信号值；

(5)差异性代谢物的筛选：将细胞核磁共振谱图的积分面积进行归一化处理，得到积分面积数据，使用偏最小二乘判别(pls-da)和正交-偏最小二乘判别(opls-da)分析数据，并采用排列实验进行验证筛选差异性变量，选取偏最小二乘判别(pls-da)中第一主成分的变量权重重要性排序值>0.1的代谢物作为差异性代谢物，并得到差异性代谢物的变化趋势；

(6)代谢通路分析：将确定的差异性代谢物导入京都基因与基因组百科全书数据库中，归属出相关的代谢通路；通过代谢组学数据分析软件metaboanalyst对差异性代谢物进行代谢通路富集分析，得到由差异性代谢物归属出的代谢影响分析通路以及代谢序列富集分析通路，代谢影响分析通路的通路影响值>0.1的代谢通路以及代谢序列富集分析通路的通路影响值<0.1的代谢通路均被识别为基于维生素c组受到显著影响的通路；最后从所述受到显著影响的通路中筛选出具有代表性的代谢途径。

基于以上ic50剂量维生素c对raw264.7或k562细胞亚毒性的分析，本发明的第二个目的是提供以下任一应用：

(1)促进半乳糖代谢试剂在制备治疗由ic50剂量维生素c引起的正常细胞亚毒性的试剂中的应用；

(2)抑制谷胱甘肽代谢试剂在制备治疗由ic50剂量维生素c引起的正常细胞亚毒性的试剂中的应用；

(3)抑制丙酮酸代谢试剂在制备治疗由ic50剂量维生素c引起的正常细胞亚毒性的试剂中的应用；

(4)抑制果糖和甘露糖代谢试剂在制备治疗由ic50剂量维生素c引起的正常细胞亚毒性的试剂中的应用；

(5)抑制糖异生途径试剂在制备治疗由ic50剂量维生素c引起的正常细胞亚毒性的试剂中的应用；

(6)促进甘油酯代谢试剂在制备治疗由ic50剂量维生素c引起的癌细胞亚毒性的试剂中的应用；

(7)促进磷酸肌醇代谢试剂在制备治疗由ic50剂量维生素c引起的正常细胞亚毒性的试剂中的应用；

(8)抑制甜菜碱代谢试剂在制备治疗由ic50剂量维生素c引起的正常细胞亚毒性的试剂中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种ic50剂量维生素c对raw264.7或k562细胞的差异性代谢物的筛选方法，包括以下步骤：

(1)确定维生素c对raw264.7或k562细胞的ic50剂量；

(2)细胞萃取液的制备：

维生素c组细胞萃取液的制备：将raw264.7或k562细胞在相应的维生素cic50剂量下进行培养，培养24h后加入冷甲醇使细胞代谢淬灭，然后采用甲醇氯仿水提取法进行超声破碎提取，收集水相；

空白组细胞萃取液的制备：将raw264.7或k562细胞进行培养，培养24h后加入冷甲醇使细胞代谢淬灭，然后采用甲醇氯仿水提取法进行超声破碎提取，收集水相；

(3)核磁共振预处理：

将维生素c组和空白组的水相蒸发后采用含有(3－三甲基硅烷基)－2,2,3,3－四氘代丙酸钠(tsp)的d2o溶解，离心，冻干；将冻干之后的样品用d2o配制的磷酸盐缓冲液溶解，离心，得到上清液；

(4)¹h核磁共振检测：将核磁共振预处理后的维生素c组和空白组的上清液进行核磁共振检测，获得细胞核磁共振谱图，从而得到raw264.7或k562细胞样品中代谢物的信号值；

(5)差异性代谢物的筛选：

将细胞核磁共振谱图的积分面积进行归一化处理，得到积分面积数据，使用偏最小二乘判别(pls-da)和正交-偏最小二乘判别(opls-da)分析数据，并采用排列实验进行验证筛选差异性变量，选取偏最小二乘判别(pls-da)中第一主成分的变量权重重要性排序值>0.1的代谢物作为差异性代谢物。

本发明的第四个目的是提供一种ic50剂量维生素c对raw264.7或k562细胞的差异性代谢物，包括：

raw264.7细胞的差异性代谢物为d-葡糖酸-1,5-内酯、l-乳酸、甲酸盐、甘油、乙醇酸盐、dl-α-甘油磷酸酯、乙酸、山梨糖醇、赤藓糖醇、肌醇、l-丝氨酸、木糖醇、葡糖酸、甘氨酸、l-半胱氨酸、氧化三甲胺、d-果糖、戊二酸、半胱胺、核糖醇、甲醇、α—酮戊二酸、n,n-二甲基甲酰胺、3-羟基-3-甲基戊二酸和腐胺；

k562细胞的差异性代谢物为三甲胺、肌醇、赤藓糖醇、核糖醇、甘油和n,n-二甲基甘氨酸。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下有益效果：

(1)用¹hnmr的代谢组学技术能够对体外细胞raw264.7和k562细胞中的差异性代谢物信息进行一个整体的获得。

¹hnmr可以检测到所有含氢原子的代谢产物的信号，提供所有含氢原子的代谢物的图谱信息。代谢物是疾病、药物、食物等与体内相互作用的最终体现，代谢组学方法能够将维生素c组和空白对照组的差异性代谢物进行鉴定和定量，为探讨维生素c与体内的相互作用提供借鉴信息。

(2)前处理方法操作简单。

本发明最终确定采用甲醇氯仿水提取法，甲醇、氯仿、超纯水的比例为4:4:2.8～2.9，超声破碎收集水相。旋转蒸发仪蒸干后溶于d2o，冻干机冻干重溶于d2o及磷酸缓冲液即可待测，方法简单，重复性好。

(3)数据预处理可靠快捷，可利用网站信息对差异性代谢物进行鉴定和定量。

数据预处理包括傅里叶变换、加指数窗函数(提高信噪比)、相位和基线校正、定标及去除溶剂峰和其他杂峰、谱峰对齐、分段积分和面积归一化等，通过数据预处理使数据更加规整，减少水峰的干扰，使后续更加准确。利用丰富的网站信息可对代谢物进行鉴定和定量，结果相对更加准确。

(4)体外条件下探究ic50浓度的维生素c对细胞的代谢物产生的影响，并对差异性代谢物进行信号通路富集分析，为基础性研究提供理论基础。

(5)体外可以达到人体内不能达到的维生素c浓度，对于探究高剂量维生素c利弊提供借鉴意义。

(6)ic50剂量维生素c对raw264.7或k562细胞的差异性代谢物为两种细胞的代谢通路分析提供基础。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1是维生素c对raw264.7细胞存活率的影响及线性回归方程，注：**p＜0.01vc组vs空白组。

图2是维生素c对k562细胞存活率的影响及线性回归方程，注：**p＜0.01vc组vs空白组。

图3是raw264.7细胞vc组和空白组的pca得分图。

图4是raw264.7细胞vc组和空白组的pls-da得分图。

图5是raw264.7细胞vc组和空白组pls-da分析的置换排列验证图。

图6是raw264.7细胞vc组和空白组opls-da得分图。

图7是raw264.7细胞vc组和空白组¹hnmr谱图。

图8(a)是raw264.7细胞中由差异性代谢产物归属出的代谢通路，1.氰基氨基酸代谢；2.乙醛酸盐和二羧酸盐代谢；3.甲烷代谢；4.丙酮酸代谢；5.三羧酸循环；6.赖氨酸降解；7.丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢；8.酪氨酸代谢；9.丁酸代谢；10.牛磺酸和亚牛磺酸代谢；11.硫代谢；12.维生素b6代谢；13.苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成；14.硒氨基酸代谢；15.氮代谢；16.脂肪酸代谢；17.d-谷氨酰胺和d-谷氨酸代谢；18.氨酰trna的生物合成；19.硫胺代谢；20.脂肪酸在线粒体中的延长；21.糖酵解或糖异生；22.赖氨酸生物合成；23.泛醌和其他萜醌类生物合成；24.叶酸生物合成；25.苯丙氨酸代谢；26.组氨酸代谢；27.戊糖和葡萄糖醛酸盐互变；28.半胱氨酸和甲硫氨酸代谢。

图8(b)是raw264.7细胞代谢产物组富集概述图，由上至下分别为：蛋氨酸代谢、半乳糖代谢、氨循环、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、谷胱甘肽代谢、甘氨酸丝氨酸苏氨酸代谢、果糖和甘露糖代谢、丙酮酸代谢、丙氨酸代谢、糖异生、半胱氨酸代谢、苹果酸-天冬氨酸代谢、泛酸和辅酶a的生物合成、葡萄糖-丙氨酸循环、甘油脂代谢、淀粉和蔗糖代谢、鞘脂代谢、戊糖磷酸途径、谷氨酸代谢、肌醇代谢、蛋白质生物合成、尿素循环、卟啉代谢、柠檬酸循环和胆汁酸生物合成。

图9是k562细胞vc组和对照组的pca得分图。

图10是k562细胞vc组和对照组的pls-da得分图。

图11是k562细胞vc组和空白组pls-da分析的置换排列验证图。

图12是k562细胞vc组和对照组的opls-da得分图

图13是k562细胞vc组和对照组¹hnmr谱图。

图14(a)是k562细胞中由差异性代谢产物归属出的代谢通路，1.甘油脂代谢；2.肌醇磷酸代谢；3.甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢；4.半乳糖代谢；5.核黄素代谢；6.甲烷代谢；7.维生素c代谢；8.戊糖和葡萄糖醛酸盐互变。

图14(b)是k562细胞代谢产物组富集概述图，由上至下分别为：半乳糖代谢、甜菜碱代谢、甘油脂代谢、肌醇代谢、蛋氨酸代谢和甘氨酸丝氨酸苏氨酸代谢。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

本发明对术语的解释：

亚毒性：是指具有毒性或有小毒而未列入国务院《医疗用毒性药品管理法》规定的有毒中药品种，临床使用过量或应用不当会中毒或产生严重不良反应,应用或药房管理上需加以注意。

ic50(halfmaximalinhibitoryconcentration)：是指被测量的拮抗剂的半抑制浓度

raw264.7：小鼠腹腔巨噬细胞细胞系，也是常用的炎症细胞模型之一。

k562：人慢性髓性白血病胸腔积液淋巴细胞。

topspin3.2：一种核磁分析软件。

simca-p软件：多元分析软件。

pca：主成分分析(principalcomponentsanalysis)，是一种无监督的模式统计方法。通过正交变换将一组可能存在相关性的变量转换为一组线性不相关的变量，转换后的这组变量叫主成分。

pls-da：偏最小二乘判别(partialleastsquaresprojectiontolatentstructure-discriminantanalysis)，是一种有监督的模式统计方法，利用偏最小二乘法对数据结构进行投影分析。

opls-da：正交-偏最小二乘判别分析(orthogonal-pls-da)，将正交信号校正方法(orthogonalsignalcorrection,osc)与pls-da进行结合从而对pls-da进行修正的分析方法。

京都基因和基因组百科全书(kegg)：是系统分析基因功能、联系基因组信息和功能信息的数据库。

metaboanalyst：是一种代谢组学数据分析网站，能够由差异性代谢产物归属出代谢通路。

正如背景技术中所介绍的，现有技术中缺少一种ic50剂量维生素c对raw264.7和k562细胞的影响分析方法，针对以上技术问题，本发明的目标是采用半抑制浓度(ic50)维生素c处理raw264.7细胞和k562细胞两种细胞系，利用核磁共振氢谱分析比较两种细胞系在代谢水平的变化。针对此，本发明的第一个方面，提出一种ic50剂量维生素c对raw264.7或k562细胞亚毒性的分析方法，该方法包括以下步骤：

(1)确定维生素c对raw264.7或k562细胞的ic50剂量；

采用mtt法确定维生素c对raw264.7或k562细胞的ic50剂量，其中，raw264.7的ic50为920mm，k562的ic50为800mm。

(2)细胞萃取液的制备：

维生素c组细胞萃取液的制备：将raw264.7或k562细胞在相应的维生素cic50剂量下进行培养，培养后加入冷甲醇使细胞代谢淬灭，然后采用甲醇氯仿水提取法进行超声破碎提取，收集水相；

空白组细胞萃取液的制备：将raw264.7或k562细胞进行培养，培养后加入冷甲醇使细胞代谢淬灭，然后采用甲醇氯仿水提取法进行超声破碎提取，收集水相；

在制备细胞萃取液的过程中，针对raw264.7或k562细胞这两种细胞的组织结构和成分，为了保证尽可能多的获取维生素c组细胞和空白组细胞代谢物信息，提取试剂优先选用的是甲醇、氯仿和超纯水的混合溶剂，对细胞样品进行多次超声破碎提取，提取后即可进行核磁共振预处理，前处理步骤简单，易于操作。

为达到较好的提取代谢物的效果、更有利于提高后续差异性代谢物、代谢通路分析的准确性，本发明采用的提取剂为甲醇、氯仿和超纯水的混合溶液，体积比例为4:4:2.8～2.9，在本发明的优选的技术方案中，甲醇、氯仿和超纯水的体积比例为4:4:2.85。

(3)核磁共振预处理：

将维生素c组和空白组的水相蒸发后采用含有(3－三甲基硅烷基)－2,2,3,3－四氘代丙酸钠(tsp)的d2o溶解，离心，冻干；将冻干之后的样品用d2o配制的磷酸盐缓冲液溶解，离心，得到上清液；

核磁共振待测样品制备阶段，样品的预处理方法会对核磁共振检测结果和主成分分析的准确性产生影响，由于代谢组学需要高通量的试验数据，必须保证数据的稳定性和可比较性，基于对核磁共振检测影响，本发明建立了针对raw264.7或k562细胞萃取液的预处理方法。故在本发明的优选的技术方案中，核磁共振预具体的处理方法是：将维生素c组和空白组的水相蒸干后用900μl含有0.1％(w/w)tsp的d2o溶解，离心后取上清液冻干，将冻干的样品用d2o配制的磷酸盐缓冲液溶解至650μl，离心后取上清液至核磁管中，待测。

(4)核磁共振检测：将核磁共振预处理后的维生素c组和空白组的上清液进行核磁共振检测，获得细胞核磁共振谱图，从而得到raw264.7或k562细胞样品代谢物的信号值，该信号值指的是不同化学位移处的核磁信号，每个信号峰既包含了代谢物的定性信息，也包含了定量信息，定性信息就是该代谢物的特征谱图和化学位移，定量信息就是该代谢物的核磁响应强度，如峰高、峰面积；

核磁共振样品检测阶段中，核磁共振的检测参数对核磁共振检测结果产生影响，代谢组学是一种需要高通量试验数据的技术，必须保证试验数据的稳定性，本发明筛选优化得到一套针对raw264.7或k562细胞萃取液的核磁共振检测条件。所有的核磁共振氢谱都采用配备了¹³c、¹h双优化5mmcptci三共振反式超低温探头的iii600mhz超导超屏蔽傅立叶变换核磁共振波谱仪检测。其中质子共振频率为600.104mhz，脉冲序列为zg30，谱宽为12019.230hz，累加次数为256次，空采次数为2次，实验温度为298k，使用topspin3.2(brukerbiospin,germany)处理谱图。

(5)差异性代谢物的筛选：核磁共振谱图使用mestrenova6.11(mestrelabresearch,espain)处理，所有谱图添加指数窗函数(exponential:0.5)，以提高信噪比。手动相位矫正，基线矫正后，用tsp定标，手动切除水峰，选取0.002ppm为间隔标准分段积分，这一间隔标准能够提高细胞萃取液谱峰的识别度，减小核磁共振谱峰重叠引起的误差，之后对谱图积分面积进行归一化。积分面积数据以excel文件保存，分组编号。之后，将数据导入simca-p+12.0软件(umetricsinc.,umea,sweden)中。使用偏最小二乘判别分析(pls-da)分析数据。为了确保pls-da模型建立的可信性，运用排列实验进行验证筛选差异性变量。根据第一主成分的变量权重重要性排序值(vip)和载荷权重(loadingweights)确定差异性代谢产物。选取在偏最小二乘判别分析(pls-da)中vip值大于1的物质，判定为差异性代谢产物。载荷权重的正负代表相关差异性代谢产物在空白组与维生素c组中的上下调关系。最后通过人类代谢组数据库(hmdb)以及生物核磁共振数据库(bmrb)进行定性分析，得到差异性代谢产物的种类名称。

(6)代谢通路分析：将确定的差异性代谢产物导入京都基因与基因组百科全书(kegg)数据库获得kegg号，然后metaboanalyst(metpa)中进行通路富集分析，得到由差异性代谢物归属出的代谢影响分析通路以及代谢序列富集分析通路，代谢影响分析通路的通路影响值>0.1的代谢通路和代谢序列富集分析通路的通路影响值<0.1的代谢通路均被识别为基于维生素c组受到显著影响的通路；最后从所述受到显著影响的通路中筛选出具有代表性的代谢途径。

筛选具有代表性的代谢途径时，将各种氨基酸、牛磺酸和亚牛磺酸、乙醛酸盐、二羧酸盐代谢、甲烷代谢、氨循环等代谢途径排除，因为当细胞受到ic50剂量维生素c作用时，上述的代谢途径均为常规的代谢途径(或者属于细胞的基础代谢途径)，并不可以作为代表性的代谢途径。

基于以上ic50剂量维生素c对raw264.7或k562细胞亚毒性的分析研究，本发明的第二个方面，提出下述任一应用：

(1)促进半乳糖代谢试剂在制备治疗由ic50剂量维生素c引起的正常细胞亚毒性的试剂中的应用；

(2)抑制谷胱甘肽代谢试剂在制备治疗由ic50剂量维生素c引起的正常细胞亚毒性的试剂中的应用；

(3)抑制丙酮酸代谢试剂在制备治疗由ic50剂量维生素c引起的正常细胞亚毒性的试剂中的应用；

(4)抑制果糖和甘露糖代谢试剂在制备治疗由ic50剂量维生素c引起的正常细胞亚毒性的试剂中的应用；

(5)抑制糖异生途径试剂在制备治疗由ic50剂量维生素c引起的正常细胞亚毒性的试剂中的应用；

(6)促进甘油酯代谢试剂在制备治疗由ic50剂量维生素c引起的癌细胞亚毒性的试剂中的应用；

(7)促进磷酸肌醇代谢试剂在制备治疗由ic50剂量维生素c引起的正常细胞亚毒性的试剂中的应用；

(8)抑制甜菜碱代谢试剂在制备治疗由ic50剂量维生素c引起的正常细胞亚毒性的试剂中的应用。

其中，促进半乳糖代谢试剂为能够促进体内细胞半乳糖代谢的试剂，使得细胞内的半乳糖的含量降低。

抑制谷胱甘肽代谢的试剂为能够抑制体内细胞谷胱甘肽代谢的试剂，使得细胞内的谷胱甘肽的含量增加。

抑制丙酮酸代谢试剂为能够抑制体内细胞丙酮酸代谢的试剂，使得细胞内的丙酮酸的含量增加。

抑制果糖和甘露糖代谢试剂为能够抑制体内细胞果糖和半乳糖代谢的试剂，使得细胞中的果糖和甘露糖的含量增加。

抑制糖异生途径试剂为能够抑制体内细胞糖异生途径发生的试剂，使得细胞中的非糖前体(例如：乳酸、甘油、生糖氨基酸等)的含量增加。

促进甘油酯代谢试剂为能够促进体内细胞甘油酯代谢的试剂，使得细胞中的甘油酯的含量增加。

促进磷酸肌醇代谢试剂为能够促进体内细胞磷酸肌醇代谢的试剂，使得细胞中的磷酸肌醇的含量增加。

抑制甜菜碱代谢试剂为能够促进体内细胞甜菜碱代谢的试剂，使得细胞中的甜菜碱的含量降低。

所述的正常细胞为小鼠巨噬细胞raw264.7，所述的癌细胞为人白血病淋巴细胞k562。

本发明的第三个方面，提供一种ic50剂量维生素c对raw264.7或k562细胞的差异性代谢物的筛选方法，包括以下步骤：

(1)确定维生素c对raw264.7或k562细胞的ic50剂量；

(2)细胞萃取液的制备：

维生素c组细胞萃取液的制备：将raw264.7或k562细胞在相应的维生素cic50剂量下进行培养，培养后加入冷甲醇使细胞代谢淬灭，然后采用甲醇氯仿水提取法进行超声破碎提取，收集水相；

空白组细胞萃取液的制备：将raw264.7或k562细胞进行培养，培养后加入冷甲醇使细胞代谢淬灭，然后采用甲醇氯仿水提取法进行超声破碎提取，收集水相；

(3)核磁共振预处理：

将维生素c组和空白组的水相蒸发后采用含有(3－三甲基硅烷基)－2,2,3,3－四氘代丙酸钠(tsp)的d2o溶解，离心，冻干；将冻干之后的样品用d2o配制的磷酸盐缓冲液溶解，离心，得到上清液；

(4)¹h核磁共振检测：将核磁共振预处理后的维生素c组和空白组的上清液进行核磁共振检测，获得细胞核磁共振谱图，从而得到raw264.7或k562细胞样品中代谢物的信号值；

(5)差异性代谢物的筛选：

将细胞核磁共振谱图的积分面积进行归一化处理，得到积分面积数据，使用偏最小二乘判别(pls-da)和正交偏最小二乘判别分析(opls-da)进行数据分析，并采用排列实验进行验证筛选差异性变量，选取偏最小二乘判别(pls-da)中第一主成分的变量权重重要性排序值>0.1的代谢物作为差异性代谢物。

每一步的具体技术方案可参照本发明的第一个方面。

本发明的第四个方面，提供一种ic50剂量维生素c对raw264.7或k562细胞的差异性代谢物，包括：

raw264.7细胞的差异性代谢物为d-葡糖糖酸-1,5-内酯、乳酸、甲酸、甘油、乙醇酸、dl-α-甘油磷酸、乙酸、山梨糖醇、赤藓糖醇、肌醇、l-丝氨酸、木糖醇、葡糖酸、甘氨酸、半胱氨酸、氧化三甲胺、d-果糖、戊二酸、半胱胺、核糖醇、甲醇、α—酮戊二酸、n,n-二甲基甲酰胺、3-羟基-3-甲基戊二酸和腐胺；

k562细胞的差异性代谢物为三甲胺、肌醇、赤藓糖醇、核糖醇、甘油和二甲基甘氨酸。

ic50剂量维生素c对raw264.7或k562细胞的差异性代谢物为两种细胞的代谢通路分析提供基础。

本发明的主要技术创新

(1)用¹hnmr的代谢组学技术能够对体外细胞raw264.7和k562细胞中的差异性代谢物信息进行一个整体的获得。

¹hnmr可以检测到所有含氢原子的代谢产物的信号，提供所有含氢原子的代谢物的图谱信息。代谢物是疾病、药物、食物等与体内相互作用的最终体现，代谢组学方法能够将维生素c组和对照组的差异性代谢物进行鉴定和定量，为探讨维生素c与体内的相互作用提供借鉴信息。

(2)前处理方法操作简单。

本发明最终确定采用甲醇氯仿水提取法，甲醇、氯仿、超纯水的比例为4:4:2.8～2.9，超声破碎收集水相。前处理步骤简单，易于操作。

核磁共振预处理方法操作简单，旋转蒸发仪蒸干后溶于d2o，冻干机冻干重溶于d2o及磷酸缓冲液即可待测，方法简单，重复性好。从主成分分析的分析结果可知，通过该核磁共振预处理方法，主成分分析模型拟合的较好，模型的预测准确性高，同组内差异性较小，不同组的样品分离更加明显。

(3)数据预处理可靠快捷，可利用网站信息对差异性代谢物进行鉴定和定量。

数据预处理包括傅里叶变换、加指数窗函数(提高信噪比)、相位和基线校正、定标及去除溶剂峰和其他杂峰、谱峰对齐、分段积分和面积归一化等，通过数据预处理使数据更加规整，减少水峰的干扰，使后续更加准确。利用丰富的网站信息可对代谢物进行鉴定和定量，结果相对更加准确。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

1、方法原理

高浓度剂量的维生素c作用于细胞后会影响细胞的代谢水平，使细胞内代谢物种类和浓度发生改变，通过利用¹hnmr技术可以将维生素c处理后和对照组的差异性代谢物进行鉴定，然后利用代谢组学分析技术对所得的数据应用pca、pls-da、opls-da等技术进行分析，寻找差异性代谢物。通过人类代谢组数据库(hmdb)以及生物核磁共振数据库(bmrb)进行定性分析，确定差异性代谢物的种类名称。将确定的差异性代谢产物导入京都基因与基因组百科全书(kegg)数据库以及metaboanalyst(metpa)中进行通路富集分析。

2、仪器与材料

仪器与设备：

statfax-2000酶标仪美国awareness公司

labservco2培养箱美国thermofisher公司

epsilon2-4lscplus冻干机德国christ公司

5804r高速冷冻离心机德国eppendorf公司

sb-1000旋转蒸发仪日本eyela公司

vc130pb细胞超声波破碎仪美国sonic公司

avanceiii600mhz全数字化超导核磁共振波谱仪德国bruker公司

材料与试剂：

raw264.7细胞上海中科院细胞库

k562细胞上海中科院细胞库

维生素c(纯度≥98％)美国sigma公司

含有0.1％tsp的d2o美国sigma公司

dmem培养基美国hyclone公司

rpmi1640培养基美国hyclone公司

二甲基亚砜北京solarbio公司

双抗试剂、谷氨酰胺试剂北京迈晨公司

胎牛血清杭州四季青公司

3、样品前处理

首先利用mtt实验分别确定维生素c作用于raw264.7细胞和k562细胞的ic50浓度，分别用ic50浓度的维生素c处理细胞24小时，处理后用冷甲醇使细胞代谢猝灭；然后按甲醇：氯仿：超纯水为4:4:2.85的体积比例即甲醇氯仿水提取法收集细胞，细胞悬液进行超声破碎收集水相。旋转蒸发仪将上清蒸干后溶于含有0.1％tsp的d2o，12000rpm，4℃离心取上清，冻干机冻干后重溶于650μld2o和d2o配制的磷酸缓冲液中，12000rpm，4℃离心15min后，取550μl上清加入5mm核磁管中，待核磁检测。

4、核磁共振检测

所有¹hnmr谱都采用配备¹³c、¹h双优化5mmcptci三共振反式超低温探头的avance600ⅲ(bruker)超导超屏蔽傅立叶变换核磁共振波谱仪检测。其中，质子共振频率为600.104mhz，采用zg30脉冲序列，谱宽(swh)为12019.230hz，累加次数(ns)为256次，空采次数(ds)为2次，实验温度(te)为298k，使用topspin3.2(brukerbiospin,germany)处理谱图。

5、成果展示

(1)mtt法确定维生素c对raw264.7细胞和k562细胞的ic50作用浓度。

为了确定维生素c对raw264.7和k562细胞活性的影响，本发明用含有不同浓度维生素c的培养基处理细胞，细胞活性的影响如图1和2所示。mtt实验结果表明，维生素c处理细胞24h后有明显抑制作用，并且确定了两种细胞不同的ic50浓度。

根据图1，巨噬细胞raw264.7经mtt法最终确定的维生素c的ic50作用浓度为920mmol/l(21.528g/130ml)。

根据图2，白血病细胞k562经mtt法最终确定的维生素c的ic50作用浓度为800mmol/l(8.64g/30ml)。

(2)核磁共振谱图分析

根据raw264.7和k562两种细胞水相萃取物的核磁共振氢谱谱图，能够确定相应的差异性代谢产物并进一步进行多元统计分析。两种细胞系各自维生素c组和空白组的核磁共振谱图如图7和13所示。从谱图中可见，维生素c组和空白组相比，两者的信号峰具有较大的差异，这预示着维生素c组和空白组中的具有差异性代谢物，而且代谢物的种类非常多。

(3)多元统计分析

将核磁共振谱图使用mestrenova6.11(mestrelabresearch,espain)处理，所有谱图添加指数窗函数(exponential:0.5)，以提高信噪比。手动相位矫正，基线矫正后，用tsp定标，手动切除水峰，选取0.002ppm为间隔标准分段积分，之后对谱图积分面积进行归一化。积分面积数据以excel文件保存，分组编号。之后，将数据导入simca-p+12.0软件(umetricsinc.,umea,sweden)中。使用主成分分析(pls-da)和正交偏最小二乘判别分析(opls-da)分析数据。为了确保pls-da和opls-da模型建立的可信性，运用排列实验和cv-anova进行验证筛选差异性变量。根据第一主成分的变量权重重要性排序值(vip)和载荷权重(loadingweights)确定差异性代谢产物。选取在偏最小二乘判别分析(pls-da)中vip值大于1的物质，判定为差异性代谢产物。载荷权重的正负代表相关差异性代谢产物在空白组与维生素c组中的上下调关系。最后通过人类代谢组数据库(hmdb)以及生物核磁共振数据库(bmrb)进行定性分析，得到差异性代谢产物的种类名称，如表1和表2。

取vip≥1的化学位移。其中vip值越大对差异性分组贡献越大。两种细胞系的化学位移确定的差异性代谢产物以及比较差异性代谢产物的上下调程度见表1和表2。

表1raw264.7细胞系差异性代谢物

表2k562细胞系差异性代谢物

simca-p软件中进行多元统计分析的pca和pls－da分析结果表明，对于raw264.7和k562细胞，维生素c组和空白组能够分开。两种细胞的pca得分图(图3和图9)和载荷图表明，两种细胞经过维生素c处理后都有各自的差异性代谢产物。

首先，使用pca模型对数据进行降维处理，提取数据集中的大部分信息观察空白组和维生素c组的自然分组状况。结果显示对于raw264.7细胞来说，维生素c组和空白组能够从第一主成分和第二主成分上明显区分。同样地，k562的维生素c组和空白组也能在其第一主成分和第二主成分上有良好的区分。pca作为无师监督的分析方法，只能反应数据的原始状况。但是，在实验的实际操作中存在许多因子影响结果的准确性，例如环境或某些系统性错误。为了获取更为准确的分组情况，尽可能排除这些外在影响因子，我们使用有师监督的分析方法pls-da和opls-da处理数据。巨噬细胞raw264.7和k562细胞的pls-da得分图中vc组和对照组都能发生明显区分，见图4和图10。通过排列实验可以验证模型的有效性，观察两个细胞系的排列验证实验结果图，如图5和图11所示，结果表明raw264.7(r²x＝0.891，r²y＝0.972，q²＝0.939)，无过拟合现象，具有较好的数据预测能力。k562细胞系建立的pls-da模型拟合的也较好(r²x＝0.98，r²y＝0.989，q²＝0.978)，无过拟合现象，也具有较好的数据预测能力。

利用opls-da分析建立raw264.7细胞的模型，根据得分图(图6)发现空白组和维生素c组能够最大程度的得到区分并且能够降低组内差异。k562细胞建立opls-da模型，对其得分图(图12)观察发现也能够很好的区分。

(4)代谢通路分析

为了研究维生素c作用于raw264.7和k562细胞相关生物标志物的代谢通路，本发明将筛选得到的差异性代谢物通过kegg数据库确定kegg号，然后再通过metaboanalyst(metpa)(网址：http://www.metaboanalyst.ca/)归属出这些差异性代谢物的代谢通路，从而探究差异性代谢物与代谢通路之间的相互作用关系。metpa能够根据代谢信息数据库(kegg)得到相应代谢物的kegg序列号(keggid)，利用计算机自动对不同代谢物的生化变化进行分组，从而寻找出相关度最高的代谢通路和疾病。一种是路径分析，即整合富集分析和路径拓扑分析，该模型能够对21种模式生物进行可视化分析。所得结果以通路影响特性作为横坐标，代表代谢通路富集重要性的-logp值为纵坐标，计算代谢通路重要性的拓扑分析进行作图。代谢途径影响的-logp值越大，不同分组之间的代谢相关性越高。两种细胞得到的路径分析图见图7和11。另一种是对人类和哺乳动物的代谢物组富集分析(msea)，基于数据库中的大约6300组代谢物组进行的通路归属分析。本实验选取表征分析(overrepresentaionanalysis,ora)作为富集分析算法，该方法只需要将对应化合物的kegg序列号导入即可进行后续分析。该模型通过传统的特征选择方法或是聚类算法检测有意义的生物模式。

将raw264.7的25种差异性代谢物和k562的6种差异性代谢物分别导入metpa软件中，通过两种数据库归属代谢通路。raw264.7细胞相关的25个差异性代谢产物归属出28条代谢通路，包括：1.氰基氨基酸代谢；2.乙醛酸盐和二羧酸盐代谢；3.甲烷代谢；4.丙酮酸代谢；5.三羧酸循环；6.赖氨酸降解；7.丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢；8.酪氨酸代谢；9.丁酸代谢；10.牛磺酸和亚牛磺酸代谢；11.硫代谢；12.维生素b6代谢；13.苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成；14.硒氨基酸代谢；15.氮代谢；16.脂肪酸代谢；17.d-谷氨酰胺和d-谷氨酸代谢；18.氨酰trna的生物合成；19.硫胺代谢；20.脂肪酸在线粒体中的延长；21.糖酵解或糖异生；22.赖氨酸生物合成；23.泛醌和其他萜醌类生物合成；24.叶酸生物合成；25.苯丙氨酸代谢；26.组氨酸代谢；27.戊糖和葡萄糖醛酸盐互变；28.半胱氨酸和甲硫氨酸代谢。而k562细胞相关的6个生物标记物归属出8条相关代谢通路，包括：1.甘油脂代谢；2.肌醇磷酸代谢；3.甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢；4.半乳糖代谢；5.核黄素代谢；6.甲烷代谢；7.维生素c代谢；8.戊糖和葡萄糖醛酸盐互变。

raw264.7细胞差异代谢物的通路富集分析显示经ic50剂量vc处理后，细胞代谢的改变途径主要集中在蛋氨酸代谢、半乳糖代谢、氨循环、牛磺酸及亚牛磺酸代谢、果糖和甘露糖的降解、谷胱甘肽代谢、甘氨酸丝氨酸苏氨酸代谢、丙酮酸代谢、丙氨酸代谢、糖异生、半胱氨酸代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭、泛酸和辅酶a的生物合成、葡萄糖-丙氨酸循环、甘油酯代谢、淀粉和蔗糖的代谢、鞘脂代谢、戊糖磷酸途径、谷氨酸代谢、肌醇代谢、蛋白质合成、尿素循环、卟啉代谢、柠檬酸循环、胆酸生物合成，共25种信号通路。

raw264.7细胞信号通路影响分析结果与通路富集分析结果综合来看，两者在蛋氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、丙酮酸代谢、丙氨酸代谢、糖异生、三羧酸循环和谷氨酸代谢中共发生代谢通路的改变。其中在信号通路分析中存在显著性差异的有氰基氨基酸代谢、乙醛酸盐和二羧酸盐代谢、甲烷代谢和丙酮酸代谢(如图8(a)所示，pi值大于0.1)。蛋氨酸代谢、半乳糖代谢、氨循环、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、谷胱甘肽代谢、甘氨酸丝氨酸苏氨酸代谢、果糖和甘露糖代谢、丙酮酸代谢、丙氨酸代谢和糖异生在信号通路富集分析中存在显著性差异(如图8(b)所示，pvalue值小于0.1，图中5e-03代表5×10^-3)。

报道表明甲烷的产生与氧化还原调节有关，且在抗坏血酸存在下由胆碱形成甲烷，ic50浓度维生素c作用细胞后，细胞氧化还原状态发生改变，细胞缺氧从而导致甲烷产生。丙酮酸对于真核生物和人类新陈代谢的许多方面是一个重要的分子，线粒体丙酮酸代谢由许多酶调节，其中在应激条件下代谢物乙酸能通过细胞内酯化诱导细胞反应，未解离的乙酸穿透细胞膜的脂质双分子层酯化内环境而诱导细胞反应，因此细胞在ic50浓度维生素c作用后，乙酸含量上升丙酮酸代谢发生显著性差异；蛋氨酸是细胞存活的必需氨基酸，在蛋氨酸循环中检测出一种甜菜碱同型半胱氨酸-s-甲基转移酶，该酶在维持蛋氨酸水平和渗透调节中发挥双重作用，蛋氨酸代谢酶的变化能促进巨噬细胞中atpase和adpase活性的增加，因此蛋氨酸代谢的改变对于细胞维持渗透压平衡和正常生命状态有关；半乳糖与诱导细胞衰老有关，但诱导机制尚不清楚，似乎与葡萄糖和脂质代谢紊乱有关，d-半乳糖通过4种酶催化反应代谢为丙酮酸和d-甘油醛-3-磷酸，这与ic50剂量维生素c作用后导致的果糖和甘露糖代谢、丙酮酸代谢、甘油脂代谢等变化是相符的；据报道牛磺酸发挥许多生理功能，包括膜稳定，渗透调节和细胞保护作用，抗氧化和抗炎作用以及调节细胞内钙浓度和离子通道功能，能够影响多数哺乳动物细胞的线粒体功能、细胞凋亡以及抗氧化防御；已有研究表明牛磺酸能够作为神经胶质瘤细胞凋亡的标志物，这意味着在raw264.7细胞中亚牛磺酸降低合成了更多的牛磺酸，进而引发细胞在ic50浓度维生素c作用时发生凋亡，且牛磺酸的改变推测也与细胞渗透压的变化有关；细胞可以通过转运蛋白将胞外的牛磺酸转运至胞内而代谢成半胱氨酸，这是半胱氨酸代谢中代谢物浓度增高的一个原因，有研究表明丙氨酸能够拮抗牛磺酸的转运，因此丙氨酸代谢也随之发生变化。氧化三甲胺(tmao)主要被认为是胆碱代谢的废物，许多研究表明tmao参与许多生物体的重要生物学功能，例如细胞使用tmao以在渗透压和静水压力的条件下维持细胞体积，所以当ic50浓度维生素c作用细胞后，tmao在维持细胞正常体积方面发挥部分作用；谷胱甘肽在保护细胞免受氧化损伤、异质亲电子毒性及维持氧化还原稳态方面起重要作用，是细胞中合成的低分子量抗氧化剂，ic50浓度维生素c作用巨噬细胞后，细胞氧化还原状态发生变化，谷胱甘肽为维持细胞氧化还原稳态而发生显著性变化；在巨噬细胞raw264.7的代谢障碍过程中还涉及了糖异生、甘氨酸丝氨酸苏氨酸代谢、氨循环的显著性差异，该代谢通路的改变是细胞应激时会发生的正常的变化。每种代谢通路显著性变化的具体意义仍然需要进一步研究，以明确各自分子机制。

k562细胞差异代谢物的通路富集分析显示经ic50剂量维生素c处理后，细胞代谢的改变途径主要集中在蛋氨酸代谢、半乳糖代谢、甜菜碱代谢、甘油酯代谢、肌醇代谢、甘氨酸丝氨酸苏氨酸代谢，共6种信号通路。k562细胞信号通路影响分析结果与通路富集分析结果综合来看，两者在半乳糖代谢、甘油酯代谢、肌醇代谢和甘氨酸丝氨酸苏氨酸代谢中都发生显著变化。在信号通路分析中发生显著性变化的代谢通路有甘油脂代谢和肌醇磷酸代谢(如图14(a)所示，pi值大于0.1)；信号通路富集分析中半乳糖代谢、甜菜碱代谢和甘油脂代谢存在显著性差异(如图14(b)所示，pvalue值小于0.1，图中1e-02代表1×10^-2)。

研究发现磷酸肌醇代谢途径的成员能调节细胞增殖、细胞迁移和磷脂酰肌醇-3-激酶/akt的信号转导，ic50浓度维生素c作用k562细胞后，肌醇含量显著下降，不利于细胞膜双层结构的维持、细胞渗透性和代谢稳态的维持；半乳糖代谢中甘油和肌醇表达量下降表明维生素c也加速了细胞的衰老过程；二甲基甘氨酸表达量上升导致甜菜碱代谢发生显著差异，这对于维持细胞渗透压的平衡具有重要意义，且甜菜碱作为蛋氨酸循环中的甲基供体，导致蛋氨酸代谢也发生相同的变化趋势；遗传和生物化学分析显示，甘油脂在细胞信号转导、膜运输等过程起重要作用，其生物合成的调节对于细胞脂质存储和膜稳态至关重要，甘油含量的下降表明ic50剂量维生素c作用后，能量存储水平下降、膜结构稳定性受到影响；k562细胞供能效率的下降还与细胞有氧呼吸转变为糖酵解的呼吸方式有关。

综上，针对巨噬细胞raw264.7，半乳糖代谢、谷胱甘肽代谢、丙酮酸代谢、果糖和甘露糖代谢和糖异生为其代表性代谢途径，也就是说，维生素c对raw264.7细胞的亚毒性的影响体现在半乳糖代谢、谷胱甘肽代谢、丙酮酸代谢、果糖和甘露糖代谢和糖异生代谢途径上；针对k562细胞，甘油脂代谢、肌醇磷酸代谢、甜菜碱代谢和半乳糖代谢为其代表性的代谢途径，也就是说，维生素c对k562细胞的亚毒性体现在甘油脂代谢、肌醇磷酸代谢、甜菜碱代谢和半乳糖代谢。申请人后续经过了细胞实验验证，可以验证以上结论。

raw264.7细胞和k562细胞共同改变的细胞代谢途径有蛋氨酸代谢、半乳糖代谢、甘油脂代谢、肌醇代谢、甘氨酸丝氨酸苏氨酸代谢。结果表明ic50剂量维生素c作用细胞后，蛋氨酸代谢变化、各种氨基酸代谢变化与维持细胞正常生命活动有关，属于细胞正常的代谢变化途径；而ic50剂量维生素c在使癌细胞k562细胞衰老的同时也加速正常细胞的衰老，且导致巨噬细胞raw264.7中大量物质的代谢紊乱。因此我们应该合理、正确辩证地态度对待和服用维生素c。本实验利用代谢组学方法对ic50剂量维生素c作用细胞后产生的影响作了初步研究，为后期实验探究提供实验方法、思路和理论基础。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。