一种猪流行性腹泻病毒抗体sIgA的ELISA检测方法与流程

本发明涉及一种猪流行性腹泻病毒抗体siga的elisa检测方法，属于动物抗体检测
技术领域：
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背景技术：
：猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea，ped)是由猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，pedv)引起的猪的一种急性高度接触性肠道传染病，以严重的肠炎、呕吐和水样腹泻为主要特征，临床变化和症状与猪传染性胃肠炎(tge)极为相似。pedv的传播途径主要是水平传播，主要途径为消化道，仔猪在采食或接触被感染的饲料、粪便、饮水后引起发病，低温、潮湿、卫生环境差时会加速该疾病的传播。ped呈爆发性流行，多数地区一次爆发流行后，第二年原发猪群不再发生本病，也有个别地区和猪场的架子猪和断奶猪，每年秋冬延续发病。各年龄的猪均易感，尤以2～7日龄仔猪最易感，表现为高发病率和高致死率，给养猪业造成了巨大的经济损失。导致仔猪的大批死亡，生猪出栏率下降，造成市场猪肉供应不足，影响猪肉价格稳定。因2-7日龄的仔猪的自身免疫系统并不完善，若想抵御pedv的侵染只能通过母乳来获得被动免疫，母猪初乳中主要为分泌型免疫球蛋白a(siga)，siga不能通过胎盘屏障，新生仔猪可从母乳中获得，保护其自身不受pedv感染。目前猪流行性腹泻疫苗均进行母猪免疫，使仔猪获得被动免疫，因此评价母乳中pedvsiga抗体的滴度是评价pedv疫苗的主要手段，而国内关于猪初乳siga的检测方法存在空白。因此本发明建立了检测母猪乳汁中pedvsiga抗体的elisa方法，希望能对母猪乳汁中pedvsiga抗体给出客观的评价，以此评判pedv疫苗的免疫效果。技术实现要素：为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种猪流行性腹泻病毒抗体siga的elisa检测方法，该检测方法特异性及重复性好，能够对pedv抗体siga给出准确的检测结果，也有利于pedv疫苗免疫效果的评价。实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种猪流行性腹泻病毒抗体siga的elisa检测方法，包括以下步骤：加入抗原：将抗原pedvs1蛋白和包被液加入酶标板，进行包被，然后用pbst洗去未结合的抗原及杂质；封闭：加入含bsa的pbs作为封闭液进行封闭，然后弃去封闭液，用pbst洗去残余的封闭液；加样：加入待检样品，然后用pbst洗去未与抗原结合的成份；加入酶标抗体：加入酶标抗体hrp-兔抗猪siga，反应后用pbst洗去未结合的酶标抗体；显色和测定：加入显色剂，避光显色后加入终止液，然后测定od450nm。进一步地，制备所述抗原pedvs1蛋白的方法包括：pedv截短s1基因的扩增和重组表达载体的构建步骤：以pedv为模板扩增b细胞抗原表位所在的pedv截短s1基因的435-789位氨基酸序列，回收和纯化目的片段，得到pcr产物；pcr产物与原核表达载体pgex4t1分别进行双酶切，并对酶切产物进行回收和纯化后，通过t4连接酶在16℃的条件下进行酶切产物的连接，得到重组表达载体pgex4t-s1；用重组表达载体转化bl21(de3)感受态细胞，然后进行蓝白斑筛选，挑取菌落进行重组质粒提取，并对重组质粒进行bamhi和sali双酶切的鉴定，以检测是否重组成功；重组质粒的诱导表达及检测步骤：将含有重组质粒的bl21(de3)细胞接种于amp+lb液体培养基中，以转化pgex4t1空载体的大肠杆菌为阴性对照，收集菌体重悬、破碎后，进行sds-page电泳鉴定和以蛋白质印迹法检测重组s1蛋白的表达情况和反应原性。进一步地，pedv截短s1基因的扩增和重组表达载体的构建步骤中，所述pcr扩增b细胞抗原表位所在的pedv截短s1基因的435-789位氨基酸序列的步骤包括：先进行rt-pcr扩增，10μl的rt-pcr扩增体系为：5×rt-buffer2μl，dntps2μl，引物s1-down1μl，rnaseinhibitor1μl，revertraace1μl，pedv核酸模板1μl，depcwater2μl，42℃作用50min，得到cdna；然后进行pcr扩增，20μl的pcr扩增反应体系为：10×kod-plus-neobuffer2μl，2mmdntps2μl，25mmmgso41.2μl，s1-up1μl，s1-down1μl，kod-plus-neo0.5μl，cdna1μl，d2h2o11.3μl；扩增条件为：95℃预变性5min；进入循环：94℃变性45sec，50-62℃退火45sec，72℃延伸1min，30次循环；72℃再延伸10min后，4℃保存，得到目的片段；其中，所用的特异性引物为：下划线部分为酶切位点。进一步地，pedv截短s1基因的扩增和重组表达载体的构建步骤中，20μl双酶切体系为：10×buffer-t3μl，bamhi1μl，sali1μl，pcr产物或pgex4t110μl，d2h2o5μl，37℃反应3h。进一步地，pedv截短s1基因的扩增和重组表达载体的构建步骤中，10μl酶切产物的连接体系为：10×t4dna连接酶buffer1μl，s1基因pcr酶切产物5μl，原核表达载体pgex4t1酶切产物3μl，t4dna连接酶1μl；各组分混匀后，离心，16℃条件下连接至少8h。进一步地，重组质粒的诱导表达及检测步骤中，将含有重组质粒的bl21(de3)细胞接种于amp+lb液体培养基中，以转化pgex4t1空载体的大肠杆菌为阴性对照，于37℃的条件下培养至od600nm为0.6时，于37℃的条件下加入终浓度为0.8mm的iptg，继续培养4h。进一步地，制备hrp-兔抗猪siga的的方法包括：siga的分离纯化步骤：收集母猪的初乳，在4～8℃的条件下离心，弃掉上层脂肪和下层沉淀，取中间层乳清；以滴加的方式往乳清中加入醋酸，使得乳清的ph为3.2-5.6，则蛋白被沉于杯底；再于4℃的条件下离心，取上清液，将上清液调至ph＝7；将得到的上清液进行凝胶过滤层析纯化，收集各吸收峰的洗脱液，对洗脱液进行sds-page电泳鉴定；将第二峰对应的洗脱液进行蛋白质电泳，然后通过转膜仪将蛋白质转至pvdf膜上，用稀释1000倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗猪iga的多克隆抗体对膜上的蛋白质进行孵育，以蛋白质印迹法检测分离结果，从检测结果得出siga中iga重链的免疫印迹，则表明siga分离成功，得到siga；兔抗猪siga的制备及标记步骤：将经分离纯化的siga免疫新西兰大耳兔，首免将siga加入等体积的弗氏不完全佐剂乳化后多点免疫兔子，两周后取siga与等体积弗氏完全佐剂乳化后多点免疫兔子，二免后三周进行三免，颈背部多点注射；三免两周后采血分离血清，得到siga兔抗猪阳性血清；将血清用hrp标记试剂盒进行标记，得到hrp-兔抗猪siga。进一步地，加入抗原步骤中，抗原pedvs1蛋白的浓度为12.5μg/ml，加入量为100μl/每孔；在37℃的条件下1h，然后4℃的条件下包被至少8h。进一步地，封闭步骤中，加入含体积百分比1％bsa的pbs作为封闭液，在37℃的条件下封闭1.5h，然后弃去封闭液，并用pbst洗去残余的封闭液。进一步地，加样步骤中，加入待检样品后37℃的条件下反应1h。进一步地，酶标抗体hrp-兔抗猪siga的稀释度为1:5000-23000，加入量为100μl。进一步地，加入酶标抗体步骤中，加入经稀释的酶标抗体hrp-兔抗猪siga，在37℃的条件下反应30～45min后，用pbst洗去未结合的酶标抗体。进一步地，显色和测定步骤中，加入显色剂100μl，避光显色10min后加入50μl终止液，然后测定od450nm。相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明旨在提供一种猪初乳siga的间接elisa检测方法，该检测方法特异性及重复性好，能够对pedv抗体siga给出准确的检测结果，也有利于pedv疫苗免疫效果的评价。附图说明图1为实施例1的层析纯化峰图；图2为实施例1sds-page电泳图；图3为实施例1蛋白质印迹显影图；图4为实施例2pcr和双酶切电泳图；图5实施例2sds-page电泳图；图6为实施例2蛋白质印迹显影图。具体实施方式下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：一种猪流行性腹泻病毒抗体siga的elisa检测方法，包括以下步骤：一、加入抗原：将抗原pedvs1蛋白和包被液加入酶标板，在37℃的条件下1h，然后4℃的条件下包被至少8h，抗原pedvs1蛋白的浓度为12.5μg/ml，加入量为100μl/每孔；然后用pbst洗去未结合的抗原及杂质；二、封闭：加入含体积百分比1％bsa的pbs作为封闭液，在37℃的条件下封闭1.5h，然后弃去封闭液，并用pbst洗去残余的封闭液；三、加样：以待检猪初乳样品，用稀释液稀释后，于37℃的条件下反应1h，然后用pbst洗去未与抗原结合的成份；四、加入酶标抗体：加入酶标抗体hrp-兔抗猪siga，酶标抗体hrp-兔抗猪siga的稀释度为1:5000-23000，加入量为100μl；在37℃的条件下反应30～45min后，用pbst洗去未结合的酶标抗体；五、显色和测定：加入显色剂100μl，避光显色10min后加入50μl终止液，然后测定od450nm。具体实施方式中，制备抗原pedvs1蛋白的方法包括：1、pedv截短s1基因的扩增和重组表达载体的构建步骤：以pedv为模板扩增b细胞抗原表位所在的pedv截短s1基因的435-789位氨基酸序列，具体为：采用以下的引物作为特异性引物，上下游引物分别引入限制性内切酶位点bamhi和sali(下划线部分)，先进行rt-pcr扩增，10μl的rt-pcr扩增体系为：5×rt-buffer2μl，dntps2μl，引物s1-down1μl，rnaseinhibitor1μl，revertraace1μl，pedv核酸模板1μl，depcwater2μl，42℃作用50min，得到cdna；然后进行pcr扩增，20μl的pcr扩增反应体系为：10×kod-plus-neobuffer2μl，2mmdntps2μl，25mmmgso41.2μl，s1-up1μl，s1-down1μl，kod-plus-neo0.5μl，cdna1μl，d2h2o11.3μl；扩增条件为：95℃预变性5min；进入循环：94℃变性45sec，50-62℃退火45sec，72℃延伸1min，30次循环；72℃再延伸10min后，4℃保存，得到目的片段，回收和纯化目的片段，得到pcr产物。pcr产物与原核表达载体pgex4t1分别进行双酶切，20μl双酶切体系为：10×buffer-t3μl，bamhi1μl，sali1μl，pcr产物或pgex4t110μl，d2h2o5μl，37℃反应3h，对酶切产物进行回收和纯化。通过t4连接酶在16℃的条件下进行酶切产物的连接，10μl酶切产物的连接体系为：10×t4dna连接酶buffer1μl，s1基因pcr酶切产物5μl，原核表达载体pgex4t1酶切产物3μl，t4dna连接酶1μl；各组分混匀后，离心，金属浴16℃条件下连接至少8h，得到重组表达载体pgex4t-s1。金属浴是指：采用微电脑控制和半导体制冷技术制造的一款恒温金属浴仪器，仪器可配置多种模块，可广泛应用于样品的保存、各种酶的保存和反应、核酸和蛋白质的变性处理、pcr反应、电泳的预变性和血清凝固等。用重组表达载体转化bl21(de3)感受态细胞，然后进行蓝白斑筛选，挑取菌落进行重组质粒提取，并对重组质粒进行bamhi和sali双酶切的鉴定，以检测是否重组成功。2、重组质粒的诱导表达及检测步骤：将含有重组质粒的bl21(de3)细胞接种于amp+lb液体培养基中，以转化pgex4t1空载体的大肠杆菌为阴性对照，于37℃的条件下培养至od600nm为0.6时，于37℃的条件下加入终浓度为0.8mm的iptg，继续培养4h；取菌液，离心收集菌体，以pbs重悬，超声破碎后，进行sds-page电泳鉴定；sds-page电泳鉴定后，以蛋白质印迹法检测重组s1蛋白的表达情况和反应原性。具体实施方式中，制备hrp-兔抗猪siga的步骤包括：1、猪初乳中siga的分离纯化步骤：收集母猪的初乳，在4～8℃的条件下离心，弃掉上层脂肪和下层沉淀，取中间层乳清；以滴加的方式往乳清中加入醋酸，使得乳清的ph为3.2-5.6，则蛋白被沉于杯底；再于4℃的条件下离心，取上清液，将上清液调至ph＝7；将得到的上清液进行凝胶过滤层析纯化，收集各吸收峰的洗脱液，对洗脱液进行sds-page电泳鉴定；将第二峰对应的洗脱液进行蛋白质电泳，然后通过转膜仪将蛋白质转至pvdf膜上，用稀释1000倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗猪iga的多克隆抗体对膜上的蛋白质进行孵育，以蛋白质印迹法检测分离结果，从检测结果得出siga中iga重链的免疫印迹，则表明siga分离成功，得到siga；2、兔抗猪siga的制备及标记步骤：将经分离纯化的siga免疫新西兰大耳兔，首免将2mgsiga加入等体积的弗氏不完全佐剂乳化后多点免疫兔子，两周后取4mgsiga与等体积弗氏完全佐剂乳化后多点免疫兔子，二免后三周进行三免，6mg/只，颈背部多点注射；三免两周后采血分离血清，得到siga兔抗猪阳性血清；将血清用hrp标记试剂盒进行标记，得到hrp-兔抗猪siga。实施例1：实施例1为制备hrp-兔抗猪siga的具体方法：1、siga的分离纯化：收集母猪的初乳，在4～8℃的条件下，转速11000r/min，离心25min，弃掉上层脂肪和下层沉淀，取中间层乳清；以滴加的方式往乳清中加入0.05-0.2m的醋酸并搅拌，使得乳清的最终ph为3.2-5.6，则蛋白被沉于杯底；再于4℃的条件下，转速11000r/min，离心15min，取上清液，将上清液调至ph＝7；将得到的上清液进行凝胶过滤层析纯化：先设定流速为0.5ml/min，柱压报警设定为3mpa，先采用去离子水对整个管道及亲和层析柱子进行洗涤，每次30ml，洗2次；再用pbs洗2次，每次洗涤体积为30ml；取0.6mlsiga粗品溶液，注入上样环中，设置流速为0.22ml/min，收集各吸收峰的洗脱液，峰图如图1所示，第1-3峰分别为：igm、iga、igg；对洗脱液进行sds-page电泳鉴定；sds-page电泳的检测结果如图2所示，泳道1-6为不同时间收集的洗脱液，从中可以看出，第2泳道和第3泳道中均有明显的80kd条带，对该蛋白经质谱分析表明该蛋白为siga的分泌片蛋白，证实该蛋白为siga。将第2峰对应的洗脱液进行蛋白质电泳，然后通过转膜仪将蛋白质转至pvdf膜上，用稀释1000倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗猪iga的多克隆抗体对膜上的蛋白质进行孵育，用dab显色，以蛋白质印迹法检测分离结果，如图3所示：泳道1为阳性对照，可明显检测出siga中的iga重链的免疫印迹，上述结果表明siga分离成功，纯度较高。对以上蛋白质印迹法结果呈阳性的洗脱液送生物公司进行质谱分析，分析结果并与国际公布的iga的序列进行比对，比对结果具有较高的同源性，可以确定，现已成功从猪的初乳中获得了较高纯度的iga。由于现有技术中，未有对猪初乳中的siga进行分离纯化的技术，本发明在现有技术基础上进行了改进，针对猪初乳物质特性，研究出上述能够高效稳定分离纯化猪初乳中siga的方法。2、兔抗猪siga的制备及标记：将经分离纯化的siga免疫新西兰大耳兔，首免将2mgsiga加入等体积的弗氏不完全佐剂乳化后多点免疫兔子，两周后取4mgsiga与等体积弗氏完全佐剂乳化后多点免疫兔子，二免后三周进行三免，6mg/只，颈背部多点注射；三免两周后采血分离血清，得到siga兔抗猪阳性血清；将血清用hrp标记试剂盒进行标记，得到hrp-兔抗猪siga。实施例2：实施例2为制备抗原pedvs1蛋白的具体方法：1、设计特异性引物：通过采用生物学软件对pedv毒株进行了在线(www.expasy.org)分析，最终确定了pedvs1蛋白的435-789位氨基酸为该毒株的潜在b细胞抗原表位所在区域；再利用primer5.0软件设计扩增截短s1基因435-789位氨基酸序列的特异性引物，上下游引物分别引入限制性内切酶位点bamhi和sali(下划线部分)，2、pedv截短s1基因的扩增和重组表达载体的构建：以pedv为模板扩增b细胞抗原表位所在的pedv截短s1基因的435-789位氨基酸序列，具体为：先进行rt-pcr扩增，10μl的rt-pcr扩增体系为：5×rt-buffer2μl，dntps2μl，引物s1-down1μl，rnaseinhibitor1μl，revertraace1μl，pedv核酸模板1μl，depcwater2μl，42℃作用50min，得到cdna；然后进行pcr扩增，20μl的pcr扩增反应体系为：10×kod-plus-neobuffer2μl，2mmdntps2μl，25mmmgso41.2μl，s1-up1μl，s1-down1μl，kod-plus-neo0.5μl，cdna1μl，d2h2o11.3μl；扩增条件为：95℃预变性5min；进入循环：94℃变性45sec，50-62℃退火45sec，72℃延伸1min，30次循环；72℃再延伸10min后，4℃保存，得到目的片段，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，在1560bp左右出现了目的条带，与预期结果相符；用dna凝胶回收试剂盒回收和纯化目的片段，得到pcr产物。3、pcr产物与原核表达载体pgex4t1分别进行双酶切：20μl双酶切体系为：10×buffer-t3μl，bamhi1μl，sali1μl，pcr产物或pgex4t110μl，d2h2o5μl，37℃反应3h，对酶切产物进行回收和纯化，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。4、连接：通过t4连接酶在16℃的条件下进行酶切产物的连接，10μl酶切产物的连接体系为：10×t4dna连接酶buffer1μl，s1基因pcr酶切产物5μl，原核表达载体pgex4t1酶切产物3μl，t4dna连接酶1μl；各组分混匀后，离心，金属浴16℃条件下连接至少8h，得到重组表达载体pgex4t-s1。用重组表达载体转化bl21(de3)感受态细胞，然后进行蓝白斑筛选，挑取菌落进行重组质粒提取，并对重组质粒进行bamhi和sali双酶切的鉴定，鉴定结果如图4所示，在第1、2泳道出现5300bp、在第3泳道出现1560bp的特异性条带，证明重组成功。5、重组质粒的诱导表达及检测：将含有重组质粒的bl21(de3)细胞接种于amp+lb液体培养基中，以转化pgex4t1空载体的大肠杆菌为阴性对照，于37℃的条件下培养至od600nm为0.6时，分别于30℃、37℃的条件下加入0.2-1.0mm范围内梯度设置iptg的浓度，继续培养4h；每隔1h取1ml菌液，离心收集菌体，以pbs重悬，超声破碎后，测定蛋白的表达量，得出本步骤优选的实验参数为：以0.8mm的iptg，在37℃条件下培养4h，可以得到最高的蛋白表达量。进行sds-page电泳鉴定，结果如图5所示，第1、2泳道为重复，第3泳道为空载体诱导对照，第1、2泳道在74kd左右出现了一条明显的目的条带，分子量与预期大小一致。sds-page电泳鉴定后，将凝胶上的蛋白质转印至硝酸纤维素膜上，用封闭液室温封闭1h，加入用tbst按1:500稀释的猪抗pedv阳性血清，于37℃下，与nc膜孵育1h后，用tbst洗涤3次；再加入用tbst1：10000倍稀释的hrp标记的羊抗猪igg，于37℃下，与nc膜孵育1h，用tbst洗3次；加入dab显色液于暗室显色5-10min，终止显影；蛋白质印迹法结果如图6所示，第2泳道为空白对照，第1泳道在74kd处出现了一条特异性条带，证明重组s1蛋白成功表达，且具有良好的反应原性。实施例3：实施例3为抗原最适包被浓度和乳汁稀释度的确定取酶标板(8*12)，横排将抗原pedvs1蛋白稀释至50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.6μg/ml、0.8μg/ml、0.4μg/ml，每孔加入100μl，37℃1h后4℃包被至少8h。封闭好的elisa板取出后用pbst洗涤3次，每次1min；加入含体积百分比1％bsa的pbs封闭液，150μl每孔，在37℃的条件下封闭1.5h，然后弃去封闭液；用pbst洗涤3次，每次1min；竖排将阴阳性乳汁从1:10、1:20、1:40倍系列稀释至1:1280，每孔100μl，然后37℃的条件下反应1h；用pbst洗涤3次，每次1min；每孔加入100μl1:10000倍稀释的实施例1制备的hrp-兔抗猪siga，37℃的条件下反应30min；用pbst洗涤3次，每次1min；每孔加入100ul显色剂，20℃避光显色10min后，每孔加入50ul终止液，测定od450nm。最佳的抗原包被浓度和抗体稀释度选择标准是阳性乳汁od450nm值在1附近，且阳性od450nm值/阴性od450nm值(p/n)比值最大，od450nm值结果如表格1所示：表格1od值检测结果从表格1得出，稀释度为1:40时，p/n的比值为19.4(1.243/0.064)最大，确定抗原的最适包被浓度为12.5μg/ml、乳汁的最佳稀释度为1:40。实施例4：实施例4为封闭液的选择和封闭时间确定以12.5μg/ml为抗原pedvs1蛋白的浓度进行包被，进行间接elisa，分别以含5％新生牛血清、5％鸭血清、5％脱脂奶粉、1％bsa的pbs作为封闭液，37℃条件下反应1h，显色10min后每孔加入50ul终止液，测定od450nm，结果如表格2所示，比较阴性阳性乳汁的od450nm值和p/n值，选择p/n值最大作为最佳封闭液，确定最佳封闭液为1％。表格2不同封闭液的od值检测结果od450nm≥0.4为阳性，﹤0.4为阴性。以12.5μg/ml为抗原的浓度进行包被，进行间接elisa，用含1％bsa的pbs分别于37℃条件下封闭30min、60min、90min、120min后，进行elisa反应，测定od450nm，比较阴性阳性乳汁的od450nm值和p/n值，结果如表格3所示，选择p/n值最大时的酶标抗体浓度，确定最佳封闭时间为1.5h。表格3不同封闭时间的od值检测结果od450nm≥0.4为阳性，﹤0.4为阴性。实施例5：实施例5为酶标抗体最佳稀释浓度和反应时间的确定以12.5μg/ml为抗原的浓度进行包被，进行间接elisa，hrp-兔抗猪iga二抗分别作l:5000、l:10000、l:15000、1:20000稀释，37℃条件下反应1h，显色10min后每孔加入50ul终止液，测定od450nm。结果如表格4所示，比较阴性阳性乳汁的od450nm值和p/n值，选择p/n值最大作为酶标抗体最佳浓度，确定最佳稀释度为1:20000。表格4不同酶标抗体稀释度的od值检测结果od450nm≥0.4为阳性，﹤0.4为阴性。将酶标抗体的反应条件分别设为37℃条件下30min、45min、60min、90min，比较阴性阳性乳汁的od450nm值和p/n值，结果如表格5所示，选择p/n值最大作为最佳反应时间，确定最佳反应时间为45min。表格5酶标抗体不同反应时间的od值检测结果od450nm≥0.4为阳性，﹤0.4为阴性。实施例6：实施例6为一种猪流行性腹泻病毒抗体siga的elisa检测方法，包括以下步骤：一、加入抗原：将抗原pedvs1蛋白和包被液加入酶标板，在37℃的条件下1h，然后4℃的条件下包被至少8h，抗原pedvs1蛋白的浓度为12.5μg/ml，加入量为100μl/每孔；然后用pbst洗涤3次，每次1min；二、封闭：加入含体积百分比1％bsa的pbs作为封闭液，在37℃的条件下封闭1.5h，然后弃去封闭液，并用pbst洗涤3次，每次1min；三、加样：加入待检猪初乳样品后37℃的条件下反应1h，然后用pbst洗涤3次，每次1min；待检猪初乳样品浓度为12.5μg/ml，加入量为100μl/每孔；四、加入酶标抗体：加入酶标抗体hrp-兔抗猪siga，酶标抗体hrp-兔抗猪siga的稀释度为1:20000，加入量为100μl；在37℃的条件下反应45min后，用pbst洗涤3次，每次1min；五、显色和测定：加入显色剂100μl，避光显色10min后加入50μl终止液，然后测定od450nm。以相同的方法对样品进行重复检测，测定od450nm如表格6所示：表格6重复检测的od值检测例1：检测例1为重复性试验取以实施例6的方式分别检测3份阳性乳汁和2份阴性乳汁，结果如表格7所示：3份阳性乳汁的变异系数为3.05％、3.82％、2.09％，均小于10％，表明该方法的重复性好。表格7重复性试验结果od450nm≥0.4为阳性，﹤0.4为阴性。检测例2：检测例2为特异性试验以实施例6的elisa检测方法分别检测猪传染性胃肠炎(tgev)、猪轮状病毒(porv)、猪伪狂犬(prv)、猪瘟(hcv)、猪繁殖与呼吸综合征(prrsv)的阳性乳汁和pedv阳性乳汁，试验结果如表格8所示：猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒、猪伪狂犬、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征的阳性乳汁elisa检测结果均为阴性，证实该方法的特异性好。表格8特异性试验结果阳性乳汁tgevporvprvhcvprrsvpedvod450nm0.130.160.200.180.211.65od450nm≥0.4为阳性，﹤0.4为阴性。对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。sequencelisting<110>广东海大畜牧兽医研究院有限公司<120>一种猪流行性腹泻病毒抗体siga的elisa检测方法<130>2017<160>2<170>patentinversion3.3<210>1<211>28<212>dna<213>人工合成<400>1aaggatccatgtgcactggttacgctgc28<210>2<211>28<212>dna<213>人工合成<400>2aagtcgacttaatggtagaagaaaccag28当前第1页12