自闭症生物标志物及其检测试剂盒的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体地，本发明涉及自闭症生物标志物及其检测试剂盒。

背景技术：

自闭症(asd，autismspectrumdisorders)或称孤独症或者孤独症谱系障碍，是广泛性发育障碍的一种亚型，以男性多见，起病于婴幼儿期，主要表现为不同程度的言语发育障碍、人际交往障碍、兴趣狭窄和行为方式刻板，约有3/4的患者伴有明显的精神发育迟滞。据美国疾病监控与预防中心(cdc)数据，2015年其发病率1/45(即2.24％)。我国尚缺乏全国性流行病调查数据，若以1/100估算，预估我国asds患者将超过1000万。

自闭症(asd)作为一种儿童精神疾病严重影响患儿的社会功能，给患儿家庭和社会带来沉重负担，但是目前自闭症通常根据量表进行评估，没有血液诊断方法和有效的治疗方案，这样诊断将依靠主观经验判断，不仅不能对自闭症的发病提供有效预警，而且诊断准确率很低。因此研究自闭症发病机理和可以体现其严重程度的生物标志物，并及时针对病因进行干预与治疗是治疗疾病、减轻社会负担的关键因素。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供了自闭症生物标志物；本发明还提供了用于诊断自闭症的试剂盒；本发明进一步还提供一种筛选易患自闭症的生物样品的系统。

本发明第一方面提供了自闭症生物标志物，其包括肠道中的iga水平。

本发明第二方面提供了所述的生物标志物在筛选易患自闭症的生物样品的系统中的应用。

本发明第三方面提供了检测肠道中的iga水平的试剂组合在制备用于诊断自闭症的试剂盒中的用途。

在一优选例中，所述检测肠道中的iga水平的试剂组合包括elisa检测试剂。

在一优选例中，所述elisa检测试剂包括含1ug/ml羊抗人iga，igg，igm(h+l)抗体的磷酸盐缓冲液。

在一优选例中，所述elisa检测试剂还包括hrp标记的羊抗人iga的溶液，其是采用品牌为jackson且货号为109-036-011的hrp标记的羊抗人iga以体积比1∶10000稀释于含2.5％脱脂牛奶的pbs中获得。

在一优选例中，所述elisa检测试剂还包括含0.2％吐温-20的磷酸盐缓冲液。

在一优选例中，所述elisa检测试剂还包括含2.5％脱脂牛奶的磷酸盐缓冲液。

在一优选例中，所述elisa检测试剂还包括磷酸缓冲盐溶液。

在一优选例中，所述elisa检测试剂还包括tmb显色液。

在一优选例中，所述elisa检测试剂还包括终止液。

在一优选例中，所述终止液为浓度为2m的h2so4溶液。

在一优选例中，所述用于诊断自闭症的试剂盒的使用包括以下步骤：

获取来自受测个体肠道的第一生物样品和来自正常个体肠道的第二生物样品；

将第一生物样品和第二生物样品进行匀浆处理从而提取上清；

将上清分别进行等同稀释后进行elisa检测；

根据elisa检测的结果对第一生物样品和第二生物样品所含的肠道中的iga水平进行差异显著性分析。

在一优选例中，所述第一生物样品和第二生物样品均为肠道固体排泄物。

在一优选例中，将第一生物样品和第二生物样品进行匀浆处理从而提取上清包括如下步骤：所述称取健康对照和自闭症患者的粪便各0.3克左右，均用两倍体积的磷酸缓冲盐溶液进行匀浆处理，然后20000g离心10分钟，取上清作为生物样本提取液。

在一优选例中，所述elisa检测包括如下步骤：

步骤一：在elisa反应板中加入含1ug/ml羊抗人iga，igg，igm(h+l)抗体的pbs，4℃密封孵育16小时；拍干反应板，用含0.2％吐温-20的pbs洗涤板孔，拍干反应板，再用含0.2％吐温-20的pbs洗涤板孔，拍干反应板，得到包被好的elisa板；

步骤二：在包被好的elisa板孔中加入75ul含2.5％脱脂牛奶的pbs和25ul生物样本提取液于反应板孔中，于37℃孵育1小时；

步骤三：用含0.2％吐温20的pbs洗涤elisa板孔，拍干反应板，重复四次。洗板后在各反应板孔加入100ulhrp标记的羊抗人iga的溶液于37℃孵育1小时；

步骤四：用含0.2％吐温-20的pbs洗涤板孔，拍干反应板，重复五次。洗板后在各反应板孔均加入tmb显色液100ul显色，置于37℃保温15min，然后每孔加入50ul终止液终止反应；

步骤五：分别于终止后，将各反应板置酶标仪中，读取od450值。

本发明第四方面提供了一种自闭症检测试剂盒，包括适用于检测权利要求1所述的生物标志物的试剂。

在一优选例中，还包括分析所述生物标志物在体内是否异常的工具。

在一优选例中，所述适用于检测权利要求1所述的生物标志物的试剂包括elisa检测试剂。

在一优选例中，所述elisa检测试剂包括含1ug/ml羊抗人iga，igg，igm(h+l)抗体的磷酸盐缓冲液。

在一优选例中，所述elisa检测试剂还包括hrp标记的羊抗人iga的溶液，其是采用品牌为jackson且货号为109-036-011的hrp标记的羊抗人iga以体积比1∶10000稀释于含2.5％脱脂牛奶的pbs中获得。

在一优选例中，所述elisa检测试剂还包括含0.2％吐温-20的磷酸盐缓冲液。

在一优选例中，所述elisa检测试剂还包括含2.5％脱脂牛奶的磷酸盐缓冲液。

在一优选例中，所述elisa检测试剂还包括磷酸缓冲盐溶液。；

在一优选例中，所述elisa检测试剂还包括tmb显色液。

在一优选例中，所述elisa检测试剂还包括终止液。

在一优选例中，所述终止液为浓度为2m的h2so4溶液。

在一优选例中，所述试剂盒的使用包括以下步骤：

获取来自受测个体肠道的第一生物样品和来自正常个体肠道的第二生物样品；

将第一生物样品和第二生物样品进行匀浆处理从而提取上清；

将上清分别进行等同稀释后进行elisa检测；

根据elisa检测的结果对第一生物样品和第二生物样品所含的肠道中的iga水平进行差异显著性分析；

任选的，所述第一生物样品和第二生物样品均为肠道固体排泄物；

在一优选例中，将第一生物样品和第二生物样品进行匀浆处理从而提取上清包括如下步骤：所述称取健康对照和自闭症患者的粪便各0.3克左右，均用两倍体积的磷酸缓冲盐溶液进行匀浆处理，然后20000g离心10分钟，取上清作为生物样本提取液。

在一优选例中，所述elisa检测包括如下步骤：

步骤一：在elisa反应板中加入含1ug/ml羊抗人iga，igg，igm(h+l)抗体的pbs，4℃密封孵育16小时；拍干反应板，用含0.2％吐温-20的pbs洗涤板孔，拍干反应板，再用含0.2％吐温-20的pbs洗涤板孔，拍干反应板，得到包被好的elisa板；

步骤二：在包被好的elisa板孔中加入75ul含2.5％脱脂牛奶的pbs和25ul生物样本提取液于反应板孔中，于37℃孵育1小时；

步骤三：用含0.2％吐温20的pbs洗涤elisa板孔，拍干反应板，重复四次。洗板后在各反应板孔加入100ulhrp标记的羊抗人iga的溶液于37℃孵育1小时；

步骤四：用含0.2％吐温-20的pbs洗涤板孔，拍干反应板，重复五次。洗板后在各反应板孔均加入tmb显色液100ul显色，置于37℃保温15min，然后每孔加入50ul终止液终止反应；

步骤五：分别于终止后，将各反应板置酶标仪中，读取od450值。

本发明第五方面提供了所述的试剂盒在筛选易患自闭症的生物样品的系统中的应用。

本发明第六方面提供了一种筛选易患自闭症的生物样品的系统，包括：

匀浆处理装置，所述匀浆处理装置用于将待测样品和对照样品进行匀浆处理从而提取上清；

elisa检测装置，所述elisa检测装置与所述匀浆处理装置相连，用于检测待测样品和对照样品各自上清经elisa检测试剂处理后的酶标值；以及

分析装置，所述分析装置与所述elisa检测装置相连，基于酶标值对其所含的生物标志物进行差异显著性分析，根据分析结果判断所述生物样品是否易患自闭症。

在一优选例中，所述待测样品和对照样品均为肠道固体排泄物。

在一优选例中，将待测样品和对照样品进行匀浆处理包括如下步骤：称取所述待测样品和对照样品各0.3克左右，均用两倍体积的磷酸缓冲盐溶液进行匀浆处理，然后20000g离心10分钟，取上清作为生物样本提取液。

在一优选例中，所述检测待测样品和对照样品各自上清经elisa检测试剂处理后的酶标值包括如下步骤：

步骤一：在elisa反应板中加入含1ug/ml羊抗人iga，igg，igm(h+l)抗体的pbs，4℃密封孵育16小时；拍干反应板，用含0.2％吐温-20的pbs洗涤板孔，拍干反应板，再用含0.2％吐温-20的pbs洗涤板孔，拍干反应板，得到包被好的elisa板；

步骤二：在包被好的elisa板孔中加入75ul含2.5％脱脂牛奶的pbs和25ul生物样本提取液于反应板孔中，于37℃孵育1小时；

步骤三：用含0.2％吐温20的pbs洗涤elisa板孔，拍干反应板，重复四次。洗板后在各反应板孔加入100ulhrp标记的羊抗人iga的溶液于37℃孵育1小时；

步骤四：用含0.2％吐温-20的pbs洗涤板孔，拍干反应板，重复五次。洗板后在各反应板孔均加入tmb显色液100ul显色，置于37℃保温15min，然后每孔加入50ul终止液终止反应；

步骤五：分别于终止后，将各反应板置酶标仪中，读取od450值。

在本文中，术语“生物标志物”应做广义理解，其包括任何能够反映异常状态的任何可检测生物指标，可以包含基因标志物，物种标志物(种标志物/属标志物)以及功能标志物(ko/og标志物)，其具有非常广泛的用途，可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次发现自闭症的致病与肠道中的iga含量有关，因此将肠道中的iga含量作为自闭症的检测标志物，这样自闭症的诊断将不依靠主观经验判断，不仅可以对自闭症的发病提供有效预警，而且可对其进行确诊，克服了自闭症的诊断较大程度的依赖于主观经验判断的缺陷，极大提高了诊断准确率。

附图说明

图1是实施例1中发现阶段自闭症组和对照组的肠道iga含量的对比图，其elisa检测时采用标本1(1∶4)，纵轴代表od450值，每个点代表一个样品。***代表p值小于0.0001，t检验。

图2是实施例1中发现阶段自闭症组和对照组的肠道iga含量的对比图，其elisa检测时采用标本2(1∶40)，纵轴代表od450值，每个点代表一个样品。***代表p值小于0.0001，t检验。

图3是实施例1中验证阶段自闭症组和对照组的肠道iga含量的对比图，其elisa检测时采用标本1(1∶4)，纵轴代表od450值，每个点代表一个样品。***代表p值小于0.0001，t检验。

图4是实施例1中验证阶段自闭症组和对照组的肠道iga含量的对比图，其elisa检测时采用标本2(1∶40)，纵轴代表od450值，每个点代表一个样品。***代表p值小于0.0001，t检验。

具体实施方式

除非特殊说明，本发明所用术语具有本发明所属领域中的一般含义。

下面参考具体实施例和附图，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw，molecularcloning：alaboratorymanual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

本实施例运用elisa检测分析健康人群和自闭症患者的粪便样本，继而进行统计检验，从而确定与自闭症患者群相关的生物标志物。具体步骤如下：

1.样品来源

自闭症组：来自深圳市儿童医院心理科及言语治疗科门诊asd患儿，收集时间为2015年7～12月。纳入标准：①根据国际最新诊断标准，即《美国精神障碍诊断与统计手册第5版》(diagnosticandstatisticalmanualofmentaldisorders，5thedition，dsm-5)，诊断为asd”需要非常多支持”的患儿；②年龄＜14岁；③性别不限。排除标准：①患有其他精神疾病(如精神分裂症等)；②患有其他神经发育障碍疾病；③患有遗传代谢性疾病；④患有严重神经疾病以及颅脑损伤史等重大躯体疾病史。

对照组：来自深圳市儿童医院儿保科体检儿童。纳入标准：①无精神疾病，身体健康；②与患者组年龄及性别匹配。排除标准同患者组。所有入组儿童家长对本研究知情并签署知情同意书。

本研究经深圳市儿童医院伦理委员会批准。

本研究分两期：发现阶段和验证阶段。

第一期为发现阶段，共收集22例自闭症患儿，男18例，女4例；年龄2～6岁，平均(2±1)岁。共收集15名对照儿童，男8名，女7名；年龄1～6岁，平均(2±1)岁。两组性别(fisher精确检验p＞0.05)、年龄(student’sttest，p＞0.05)差异无统计学意义。

第二期为验证阶段，收集22例自闭症患儿，男18例，女3例；年龄2～6岁，平均(2±1)岁。共收集16名对照儿童，男9名，女7名；年龄1～6岁，平均(2±1)岁。两组性别(fisher精确检验，p＞0.05)、年龄(student’sttest，p＞0.05)差异无统计学意义。

2.粪便采集与获取上清

称取健康对照和自闭症患者的粪便各0.3克左右，均用两倍体积的pbs(磷酸缓冲盐溶液，phosphatebuffersaline))进行匀浆处理，然后20000g离心10分钟，取上清作为生物样本提取液，进行后续iga含量检测。

3.elisa检测

(1)反应板包被：在elisa反应板(品牌为coming，货号为9018)中加入含1ug/ml羊抗人iga，igg，igm(h+l)抗体(品牌为jackson，货号为109-006-064)的pbs，4℃密封孵育16小时；拍干反应板，用含0.2％吐温-20的pbs洗涤板孔，拍干反应板，再用含0.2％吐温-20的pbs洗涤板孔，拍干反应板，得到包被好的elisa板。

(2)加入标本：在包被好的elisa板孔中加入标本1(1∶4)，或标本2(1∶40)于反应板孔中，于37℃孵育1小时。

所述标本1(1∶4)包括75ul含2.5％脱脂牛奶的pbs和25ul生物样本提取液；所述标本2(1∶40)包括97.5ul含2.5％脱脂牛奶的pbs和2.5ul生物样本提取液。

(3)加入酶标抗体：用含0.2％吐温20的pbs洗涤elisa板孔，拍干反应板，重复四次，洗板后在各反应板孔加入100ulhrp标记的羊抗人iga的溶液(hrp标记的羊抗人iga，具有α链特异性，品牌为jackson货号为109-036-011，其以体积比1∶10000稀释于含2.5％脱脂牛奶的pbs中得到hrp标记的羊抗人iga的溶液)于37℃孵育1小时。

(4)显色：用含0.2％吐温-20的pbs洗涤板孔，拍干反应板，重复五次，洗板后在各反应板孔均加入tmb显色液100ul显色，置于37℃保温15min，然后每孔加入50ul终止液(2m硫酸)终止反应。

(5)检测：分别于终止后，将各反应板置酶标仪中，读取od450值。

上述各步骤涉及到的试剂的配制方法如下：

pbs：称取磷酸二氢钾(kh2po4)0.2g，磷酸氢二钠(na2hpo4·12h20)2.9g，氯化钠(nacl)8.0g，氯化钾(kcl)0.2g，加水至1000ml。

含0.2％吐温-20的pbs：称取磷酸二氢钾(kh2po4)0.2g，磷酸氢二钠(na2hpo4·12h20)2.9g，氯化钠(nacl)8.0g，氯化钾(kcl)0.2g，吐温-202ml，加水至1000ml。

含2.5％脱脂牛奶的pbs：称取磷酸二氢钾(kh2po4)0.2g，磷酸氢二钠(na2hpo4·12h20)2.9g，氯化钠(nacl)8.0g，氯化钾(kcl)0.2g，脱脂奶粉25g，加水至1000ml。

4.统计分析

通过t检验法分析自闭症组和对照组的iga水平是否差异显著。

结果：

(1)发现阶段

第一期为发现阶段，共收集22例患儿，男18例，女4例；年龄2～6岁，平均(2±1)岁。共收集15名对照儿童。发现阶段，通过t检验法分析发现，自闭症患者肠道排泄物iga总含量显著高于健康对照，1∶4和1∶40两个稀释度的检测结果差异的p值均小于0.0001.自闭症患者粪便中iga含量显著高于健康对照，如图1和图2所示。

(2)验证阶段

第二期为验证阶段，收集22例患儿，16名对照儿童，通过t检验法分析发现，自闭症患者肠道排泄物iga总含量显著高于健康对照，1∶4稀释度的检测结果差异的p值均小于0.05，如图3和图4所示。

综上所述，自闭症患者肠道排泄物iga总含量显著高于健康对照，通过elisa方法且采用标本1(1∶4)来检测粪便iga总含量在疾病组和对照组差异显著(p值小于0.05)，可以作为疾病诊断标志物，或者作为疾病治疗的靶标，或者作为治疗评估的指标，为自闭症的诊断和治疗提供新的思路。