本发明涉及类胡萝卜素的提取方法，具体地说，涉及月季花瓣中类胡萝卜素的高效提取及测定方法。
背景技术：
：：月季(rosaspp.)是一种具有重要经济价值的观赏植物，花色是其最重要的观赏性状之一。黄色月季是月季育种史上的一大奇迹，胡萝卜素是赋予月季黄色和橙色的重要物质。类胡萝卜素是一种由多个异戊二烯骨架串联而成的萜类化合物(多数为c40)。由于存在共轭体系，因此在可见光下类胡萝卜素呈现黄色、橙色或红色。对植物而言，类胡萝卜素具有核心的生物学功能，例如在光合作用中对光能传递、光保护及自由基清除等方面发挥重要作用，同时胡萝卜素是合成植物激素脱落酸和独脚金内酯的前体物质。并且类胡萝卜素可赋予植物花朵、果实及种子各种颜色，对于吸引传粉者、传播种子等具有重要作用。对人类而言，类胡萝卜素是合成维生素a的前体，是一种优良的天然色素，同时在抗氧化、提高免疫力、保护视力及防癌等方面具有显著功效。月季长势健壮，适应性广、四季开花，因此月季花瓣有望成为胡萝卜素制备的重要材料。建立月季花瓣中类胡萝卜素提取及测定方法，对黄色月季育种和黄色月季中类胡萝卜素的提取利用具有重大意义。前期检索结果显示，现有研究多数关注月季果实中类胡萝卜素的提取和测定，且存在操作步骤繁琐、样品损耗大、提取效率低等缺点。eugster等(1991)利用经典的纸层析技术对月季花瓣中的胡萝卜素进行分离鉴定，此方法不仅类胡萝卜素降解较多而且分离效果较差。近几年，hodisan等(1997)、andersson等(2011)和horváth等(2012)先后利用有机溶剂提取蔷薇果实中类胡萝卜素，类胡萝卜素提取液不经皂化直接用c18色谱柱进行高效液相色谱分析，其中horváth分离出的类胡萝卜素种类最多，但是也仅有9种。因此，急需建立一种月季花瓣中类胡萝卜素的高效提取和测定方法。技术实现要素：本发明的目的是提供月季花瓣中类胡萝卜素的高效提取及测定方法。为了实现本发明目的，本发明提供的月季花瓣中类胡萝卜素的高效提取及测定方法，包括以下步骤：s1、称取类胡萝卜素标准品，用甲醇-甲基叔丁基醚溶液溶解，制备类胡萝卜素标准品溶液；其中，所述甲醇-甲基叔丁基醚溶液中甲醇和甲基叔丁基醚的体积比为1:1；s2、将月季花瓣样品在液氮中迅速研磨，依次用甲醇、正己烷和正己烷-乙醚溶液振荡提取；收集有机相，挥干，得到胡萝卜素干粉；向胡萝卜素干粉中加入含有6％koh的甲醇溶液，在黑暗条件下进行皂化反应；向皂化后的样品中加入10％nacl水溶液，震荡后静置，然后加入正己烷-乙醚溶液振荡提取1～2次，直到残渣为白色，收集有机相，挥干，得到皂化后的胡萝卜素干粉样品；其中，所述正己烷-乙醚溶液中正己烷和乙醚的体积比为3:1；s3、高效液相色谱分析(hplc)；s4、液质联用分析(lc-ms)，获得月季花瓣中类胡萝卜素的质谱信息；s5、根据保留时间、紫外可见吸收光谱图、质谱图、类胡萝卜素标准品和和文献资料对月季花瓣样品中类胡萝卜素的结构进行鉴定；s6、根据类胡萝卜素标准品的线性回归方程，对月季花瓣样品中的类胡萝卜素进行定量分析。步骤s2中使用koh进行皂化反应，主要考虑到氢氧化钾的皂化反应速度比氢氧化钠等其他碱类物质更快。本发明的各步操作中使用的有机试剂中均含有0.1％bht(抗氧化剂2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)，整个提取过程均在避光或黄光以及温度不超过23℃的条件下进行，如果环境温度过高可将操作在冰上进行。本发明中制备类胡萝卜素标准品溶液的具体方法为：称取1mg类胡萝卜素标准品，加入10ml甲醇-甲基叔丁基醚溶液溶解，配制成浓度为100μg/ml的母液，然后逐级稀释2倍，制备6个浓度梯度的标准品溶液，用以绘制标准曲线。本发明中使用的类胡萝卜素标准品包括但不限于β-胡萝卜素、紫黄质、花药黄质、玉米黄质和叶黄素。前述的方法，步骤s2具体为：(1)将月季花瓣样品在液氮中迅速研磨成粉末，称取0.2-0.3g样品，加入4ml甲醇，置于振荡培养箱中振荡提取20min；(2)向(1)所得体系中加入4ml正己烷，置于振荡培养箱中振荡提取20-30min；(3)向(2)所得体系中加入10％nacl水溶液2ml，手动摇晃约30s，静置分层，收集上层有机相；(4)向(3)所得下层溶液中加入2ml正己烷-乙醚溶液，置于振荡培养箱中振荡提取20-30min，静置分层，收集上层有机相；用正己烷-乙醚溶液重复提取，直到残渣为白色；(5)将(3)和(4)收集的上层有机相混合，用氮吹仪吹干，得到胡萝卜素干粉；(6)向胡萝卜素干粉中加入含有6％koh的甲醇溶液1ml，置于振荡培养箱中振荡12h，进行皂化反应；(7)向皂化后的样品中加入10％nacl水溶液1ml，然后加入1ml正己烷-乙醚溶液，置于振荡培养箱中振荡提取1h，取出后静置分层取上清；(8)向(7)的上清中加入0.5ml正己烷-乙醚溶液，置于振荡培养箱中振荡提取1h，取出后静置分层取上清；用正己烷-乙醚溶液重复提取，直到残渣为白色；(9)收集(8)的有机相用真空离心浓缩仪浓缩至干燥，将皂化后的胡萝卜素干粉置于棕色离心管中，于-80℃保存。前述的方法，步骤s3先将皂化后的胡萝卜素干粉样品用甲醇-甲基叔丁基醚溶液溶解，然后用0.22μm微孔滤膜过滤，装于2ml安捷伦上样瓶中用于高效液相色谱检测分析。本发明中采用waters2695的hplc，waters996pda检测器，进行hplc检测分析。所用色谱柱为c30，规格250mm×4.6mm，5μm(ymc，日本)；流动相为：a，含0.1％bht的甲醇；b，含0.1％bht的甲醇-甲基叔丁基醚；c，超纯水；梯度洗脱，流速为1ml/min，进样量20μl，柱温箱温度25℃，200-600nm全波长扫描。优选地，梯度洗脱条件为：0-2min，95％a+5％c，10min，95％a+3％b+2％c；21min，95％a+5％b；27min，90％a+10％b；37min，70％a+30％b；40min，50％a+50％b；40.01-50min，95％a+5％c。前述的方法，步骤s3中提取450nm下的液相色谱图，同时得到每个峰对应的200-600nm紫外可见吸收光谱图。本发明中采用hplc-microtof-qms液质联用仪获得质谱信息。全扫描大气压力化学电离(apci)，干燥温度350℃，毛细管电压3000v，毛细管出口电压500v，四级杆电压3.0ev，碰撞能量8.0ev，正离子模式，扫描范围100-1100m/z，干燥和喷雾气体为氮气，流速为8.0l/min。对正离子模式下的扫描结果基于保留时间进行离子提取，得到每个峰对应的质谱信息。对类胡萝卜素待测样品进行定性定量分析的方法如下：(1)定性分析根据高效液相色谱图中每个峰的保留时间、紫外可见吸收光谱图信息、质谱信息，同时参考各种类胡萝卜素标准品和文献资料对类胡萝卜素的结构进行鉴定。(2)定量分析记录各种类胡萝卜素标准品每个浓度对应的峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制各种标准品的标准曲线，得到相应的线性回归方程；然后将鉴定出的类胡萝卜素的峰面积代入对应标准品的回归方程中，计算得到待测液中对应物质的含量，如果鉴定出的类胡萝卜素与5种标准品均不相同，则利用与其结构最相近的标准品的回归方程来计算含量。在本发明的一个优选实施方式中，按以下方法提取待测样品中的类胡萝卜素：(1)将样品在液氮中迅速研磨成粉末，准确称量0.2-0.3g样品并记录重量，加入4ml甲醇(含0.1％bht)，置于振荡培养箱中(23℃、黑暗、150rpm)振荡提取20-30min；(2)然后加入4ml正己烷(含0.1％bht)，置于振荡培养箱中(23℃、黑暗、150rpm)振荡提取20min；(3)然后加入2mlnacl水溶液(10％，w/v)，手动摇晃30s左右，静置至分层，收集上层有机相；(4)重复提取，加入2ml正己烷-乙醚(3:1，v/v，含0.1％bht)，置于振荡培养箱中(23℃、黑暗、150rpm)振荡提取20min，取出后静置分层，收集上层有机相；(5)如果完成步骤(4)后样品仍有颜色，可再次重复步骤(4)，直到样品呈白色；如果完成步骤(4)后样品已成白色，可不必重复步骤(4)；(6)将(3)、(4)和(5)收集的上层有机相混合，用氮吹仪吹干；(7)进行皂化处理。向胡萝卜素干粉中加入含有6％koh的甲醇溶液(含0.1％bht)1ml，置于振荡培养箱中(23℃、黑暗、150rpm)振荡12h左右；(8)将皂化后的样品取出，加入1mlnacl水溶液(10％，w/v)，手动震荡30s后静置5min；(9)加入1ml正己烷-乙醚(3:1，v/v，含0.1％bht)，置于振荡培养箱中(23℃、黑暗、150rpm)振荡提取1h，取出后静置分层取上清；(10)重复提取，加入0.5ml正己烷-乙醚(3:1，v/v，含0.1％bht)，重复(9)，此时样品呈白色；(11)将(9)和(10)收集的上层有机相混合，用真空离心浓缩仪(concentratorplus，eppendor)浓缩至干燥，将皂化后的胡萝卜素干粉置于棕色离心管中，于-80℃冰箱保存。利用本发明方法在月季花瓣中共鉴定出19种类胡萝卜素(表1)，其中c1-16为含氧类胡萝卜素，c17-19为只含碳氢元素的胡萝卜素。表1注：rt代表保留时间；λmax代表特征吸收波长；％ⅲ/ⅱ代表最大吸收峰峰高与中间吸收峰峰高的比值；％ab/aⅱ顺式峰的峰高与最大吸收峰峰高的比值；[m+h]+代表母离子加一个氢离子的质核比；(di-z)代表双顺式异构体，13/13'z和9/9'z分别代表13/13'位和9/9'位顺式异构体。本发明具有以下优点：(一)本发明采用含0.1％bht的甲醇、正己烷和正己烷-乙醚(体积比3:1)三种不同极性的有机溶剂反复振荡提取，能够同时提取多种不同类型的类胡萝卜素，利用含有6％koh的甲醇溶液，在黑暗条件下皂化反应12h，充分释放胡萝卜素酯中包含的胡萝卜素，实现了月季花瓣中类胡萝卜素的高效提取。(二)本发明利用高效液相色谱分析和液质联用分析，得到每种物质的保留时间、紫外可见吸收光信息、质谱信息，然后结合标准品和参考文献等进行联合分析，对类胡萝卜素的结构进行推测鉴定，首次在月季花瓣中分离鉴定出19种胡萝卜素。附图说明图1为本发明实施例1中不同提取剂提取效果比较，其中数字分别代表：1甲醇(含0.1％bht)；2甲醇-四氢呋喃(1:1，v/v，含0.1％bht)；3乙醇(含0.1％bht)；4乙醇-正己烷(4:3，v/v，含0.1％bht)；5丙酮(含0.1％bht)；6四氢呋喃-正己烷(1:1，v/v，含0.1％bht)；7正己烷-丙酮-乙醇(2:1:1，v/v，含0.1％bht)和8正己烷-丙酮(1:1，v/v，含0.1％bht)，字母a、b、c、d代表方差分析邓肯新复极差检验在p＝0.05显著性水平下的差异显著。图2为本发明实施例1中类胡萝卜素提取液皂化前后高效液相色谱图。图3为本发明实施例1中不同溶剂复溶胡萝卜素效果比较，字母a、b、c、d代表方差分析邓肯新复极差检验在p＝0.05显著性水平下的差异显著。图4为本发明实施例2中混合类胡萝卜素标准溶液的高效液相色谱图。图5为本发明实施例2中类胡萝卜素标准品的标准曲线。图6为本发明实施例3中黄色月季‘太阳城’花瓣类胡萝卜素提取液高效液相色谱图。图7为本发明实施例4中橙色月季1-3花瓣类胡萝卜素提取液高效液相色谱图。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。本发明中所用试剂：甲醇、甲基叔丁基醚为色谱纯级别，购自美国fisher公司，正己烷、乙醚、氯化钠(nacl)和氢氧化钾(koh)均为色谱纯，购自北京化工厂，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(bht)购自美国sigma-aldrich公司，超纯水由pallcascadals实验室超纯水系统制备得到；β-胡萝卜素标准品购自美国sigma-aldrich公司，紫黄质、花药黄质、玉米黄质和叶黄素四种标准品购自瑞士carotenature公司。实施例1类胡萝卜素提取测定条件优化1.设计8种浸提剂对月季花瓣中类胡萝卜素进行提取，筛选最优的浸提剂。8种浸提剂分别为：分别为：甲醇(含0.1％bht)、甲醇-四氢呋喃(1:1，v/v，含0.1％bht)、乙醇(含0.1％bht)、乙醇-正己烷(4:3，v/v，含0.1％bht)、丙酮(含0.1％bht)、四氢呋喃-正己烷(1:1，v/v，含0.1％bht)、正己烷-丙酮-乙醇(2:1:1，v/v，含0.1％bht)和正己烷-丙酮(1:1，v/v，含0.1％bht)。制备待测样品溶液的具体步骤为：(1)将‘太阳城’盛花期花瓣在液氮中迅速研磨成粉末，准确称量0.2-0.3g样品并记录重量，加入4ml浸提剂，置于振荡培养箱中振荡提取20min；(2)然后加入4ml正己烷(含0.1％bht)，置于振荡培养箱中振荡提取20min；(3)然后加入2mlnacl水溶液，手动摇晃30s左右，静置至分层，收集上层有机相；(4)重复提取，加入2ml正己烷-乙醚(3:1，v/v，含0.1％bht)，置于振荡培养箱中振荡提取20min，取出后静置分层，收集上层有机相，重复提取，直到残渣为白色；(5)将(3)和(4)收集的有机相混合，用氮吹仪吹干；(6)加入2ml正己烷(含0.1％bht)溶解胡萝卜素干粉，用紫外可见分光光度计测定其450nm处的吸光度值，然后利用公式：y＝20000×a/(2638×m)计算类胡萝卜素总含量。其中，a表示450nm处的吸光度值，m表示样品质量，单位为g。结果如图1所示，甲醇(含0.1％bht)和甲醇-四氢呋喃(1:1，v/v，含0.1％bht)两种浸提剂提取到的类胡萝卜素总含量显著高于另外6种浸提剂，考虑到试剂安全性和操作的便捷性，最终选择甲醇作为月季花瓣中类胡萝卜素的浸提剂。2.皂化对类胡萝卜素高效液相色谱图的影响将步骤1提取得到的胡萝卜素干粉进行皂化，具体步骤为：(1)向胡萝卜素干粉中加入1ml6％koh甲醇溶液(含0.1％bht)，置于振荡培养箱中振荡12h，进行皂化反应；(2)将皂化后的样品取出，加入1mlnacl水溶液，然后加入1ml正己烷-乙醚(3:1，v/v，含0.1％bht)，置于振荡培养箱中振荡提取1h，取出后静置分层取上层有机相；(3)重复提取，加入0.5ml正己烷-乙醚(3:1，v/v，含0.1％bht)，置于振荡培养箱中振荡提取1h，取出后静置分层取上层有机相，重复提取，直到残渣为白色；(9)将(2)和(3)收集的上层有机相混合，用真空离心浓缩仪(concentratorplus，eppendor)浓缩至干燥，将皂化后的胡萝卜素干粉置于棕色离心管中。高效液相色谱分析(hplc)：将未皂化以及皂化后的胡萝卜素干粉用1ml甲醇-甲基叔丁基醚(1:1，v/v，含0.1％bht)复溶，然后用0.22μm微孔滤膜过滤，装于2ml安捷伦上样瓶中用于hplc检测分析。液相色谱条件为：waters2695的hplc，waters996pda检测器；色谱柱为c30(250mm×4.6mm，5μm，ymc，日本)；流动相为：a，含0.1％bht(w/v)的甲醇；b，含0.1％bht(w/v)的甲基叔丁基醚；c，超纯水；洗脱梯度为：0-2min，95％a+5％c，10min，95％a+3％b+2％c；21min，95％a+5％b；27min，90％a+10％b；37min，70％a+30％b；40min，50％a+50％b；40.01-50min，95％a+5％c，流速为1ml/min，进样量20μl，柱温箱温度25℃，200-600nm全波长扫描；提取450nm下的色谱图。结果如图2所示，皂化后的样品分离效果更佳，因此月季花瓣中类胡萝卜素的提取需要皂化。3.复溶溶剂对类胡萝卜素高效液相色谱图的影响将步骤2得到的皂化后的胡萝卜素干粉用甲醇(含0.1％bht)、二氯甲烷(含0.1％bht)、甲基叔丁基醚(含0.1％bht)、甲醇-甲基叔丁基醚(1:1，v/v，含0.1％bht)和甲醇-甲基叔丁基醚(1:2，v/v，含0.1％bht)共5种溶剂复溶，然后用0.22μm微孔滤膜过滤，装于2ml安捷伦上样瓶中用于hplc检测分析。液相色谱条件与步骤2相同，分离结果如图3所示，用甲醇-甲基叔丁基醚(1:1，v/v，含0.1％bht)复溶时，紫黄质、(9/9’z)-环紫黄质和β-胡萝卜素相对含量显著高于用其他四种溶剂复溶，因此将甲醇-甲基叔丁基醚(1:1，v/v，含0.1％bht)作为复溶溶剂。实施例2类胡萝卜素标准曲线绘制准确称取1mg类胡萝卜素标准品，具体为β-胡萝卜素、紫黄质、花药黄质、玉米黄质和叶黄素，加入10ml甲醇-甲基叔丁基醚(1:1，v/v，含0.1％bht)得到浓度为100μg/ml的母液，然后依次稀释2倍，制备6个浓度梯度的标准品溶液，用以绘制标准曲线。标准品溶液经高效液相色谱分析得到混合标准溶液高效液相色谱图(图4)，并且记录5种胡萝卜素标准品每个浓度对应的峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制5种标准品的标准曲线，得到相应的线性回归方程(图5)。色谱条件同实施例1中步骤2。实施例3月季品种‘太阳城’花瓣中类胡萝卜素的提取和测定1.制备待测溶液将现代月季品种‘太阳城’盛花期花瓣在液氮中迅速研磨成粉末，准确称量0.2-0.3g样品并记录重量，制备待测样品溶液，方法同实施例1，浸提剂为甲醇(含0.1％bht)。2.分离检测(1)高效液相色谱分析(hplc)将胡萝卜素干粉用1ml甲醇-甲基叔丁基醚(1:1，v/v，含0.1％bht)复溶，然后用0.22μm微孔滤膜过滤，装于2ml安捷伦上样瓶中用于hplc检测分析。液相色谱条件同实施例1。得到的色谱图如图6所示。(2)液质联用分析(lc-ms)采用hplc-microtof-qms液质联用仪获得质谱信息。全扫描大气压力化学电离(apci)，干燥温度350℃，毛细管电压是3000v，毛细管出口电压是500v，四级杆电压3.0ev，碰撞能量8.0ev，正离子模式，扫描范围100-1100m/z，干燥和喷雾气体(n2)流速为8.0l.min-1。3.定性定量分析(1)定性分析根据高效液相色谱图中每个峰的保留时间、紫外可见吸收光谱图信息、质谱信息，同时参考5种类胡萝卜素标准品和文献资料对类胡萝卜素化合物的结构进行鉴定。结果如表1所示。(2)定量分析记录5种类胡萝卜素标准品每个浓度对应的峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制5种标准品的标准曲线，得到相应的线性回归方程。然后将鉴定出的类胡萝卜素的峰面积代入对应标准品的回归方程中，计算得到待测液中对应物质的含量，如果鉴定出的类胡萝卜素与5种标准品均不相同，则利用与其结构最相近的标准品的回归方程来计算含量，结果如表1所示，‘太阳城’花瓣中检测到19种类胡萝卜素，相对标准偏差均小于3％，说明方法重复性好。实施例4橙色月季花瓣中类胡萝卜素提取和测定以‘太阳城’与‘云蒸霞蔚’杂交得到的橙色子代1-3为试材，制备待测溶液、分离检测、定性定量分析方法同实施例3，所得样品溶液的色谱图见图7，胡萝卜素含量含量见表2，橙色月季花瓣中共检测到12种类胡萝卜素，相对标准偏差均小于3％，说明方法重复性好。表2月季花瓣中类胡萝卜素含量分析注：rsd代表相对标准偏差。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。参考文献[1]horváth,g.,p.molnár,e.radó-turcsi,j.deli,m.kawase,k.satoh,t.tanaka,s.tani,h.sakagami,andn.gyémánt,2012,carotenoidcompositionandinvitropharmacologicalactivityofrosehips:actabiochimpol,v.59,p.129-132.[2]andersson,s.c.,k.rumpunen,e.johansson,andm.e.olsson,2011,carotenoidcontentandcompositioninrosehips(rosaspp.)duringripening,determinationofsuitablematuritymarkerandimplicationsforhealthpromotingfoodproducts:foodchemistry,v.128,p.689-696.[3]hodisan,t.,c.socaciu,i.ropan,andg.neamtu,1997,carotenoidcompositionofrosacaninafruitsdeterminedbythin-layerchromatographyandhigh-performanceliquidchromatography:journalofpharmaceuticalandbiomedicalanalysis,v.16,p.521-528.[4]eugster,c.h.,ande.fischer,1991,thechemistryofrosepigments:angewandtechemieinternationaleditioninenglish,v.30,p.654-672。当前第1页12当前第1页12