一种聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物的分析检测方法与流程

本发明涉及一种高效液相色谱分析方法，尤其是一种聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物的分析检测方法。
背景技术：
：聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物属于长效型glp-1类似物，用于治疗人2型糖尿病。该药物以已上市glp-1类似物byetta结构为基础，通过不同序列比对和计算机模拟，化学合成不同氨基酸序列的byetta类似物多肽，利用体外活性比较和稳定性考察等方法筛选得到了一种最优的促胰岛素分泌肽类似物氨基酸序列多肽。该多肽具有较优的与胰岛β细胞的亲和性、稳定性和体内外生物活性。聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物的化学式为c172h265n49o58s2，结构式如下：到目前为止，国内外药典和文献中均没有记载聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物的分析检测方法，但聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物的分析检测对反应控制和收率提高有着重要的作用，同时也直接影响着产品质量，所以建立一种稳定有效的分析检测方法对聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物进行质量控制是非常必要的。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物的高效液相色谱分析检测方法，用于聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物的质量控制。为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验，最终获得如下技术方案：一种聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物的分析检测方法，是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱(c18，4.6×250mm，3.5μm)，以a-(高氯酸钠+磷酸二氢钠缓冲溶液)：四氢呋喃＝95:5～90:10，b-乙腈：四氢呋喃＝9:1，以检测波长为210～220nm，进行高效液相色谱法分析检测，执行梯度洗脱程序，设置如下：时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)075～6525～353060～5040～503545～3055～704075～6525～355075～6525～35所述的高氯酸钠+磷酸二氢钠缓冲溶液中，高氯酸钠的浓度为0.005～0.02mol/l，磷酸二氢钠的浓度为0.01～0.02mol/l。进一步地，流动相a优选为(0.015m高氯酸钠+0.02m磷酸二氢钠)：四氢呋喃＝92:8。所述的梯度洗脱程序优选为：时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)07030306040354060407030507030所述的检测波长优选为214nm。本发明所述的分析检测方法，可通过以下步骤实现：a、取聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物样品适量，用40％乙腈溶解，配制成每1ml含聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物0.8～2mg的样品溶液；b、设置流动相流速为0.8～1.2ml/min，检测波长210～220nm，柱温为25～35℃；c、取a的样品溶液20μl注入液相色谱仪，完成聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物的分析检测；其中：高效液相色谱仪：agilent1260液相色谱系统；色谱柱：watersxbridgepeptidebehc18(3.5μm，4.6mm×250mm)；流动相：a-(0.015m高氯酸钠+0.02m磷酸二氢钠)：四氢呋喃＝92:8，b-乙腈：四氢呋喃＝9:1，梯度洗脱设置如下：检测波长：214nm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min。本发明涉及的分析检测方法，可以有效的将聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物及其杂质分开，而且该方法线性关系良好，操作简单，重复性及耐用性好，结果稳定可靠，从而可用于聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物的质量控制，为最终成品的质量提供有效保障。附图说明图1实施例1的聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物hplc图谱。图2实施例2的聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物hplc图谱。图3实施例3的聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物hplc图谱。图4实施例7的聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物线性工作曲线。具体实施方式以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。实施例1仪器与条件：agilent1260液相色谱系统，dad检测器，色谱柱：watersxbridgepeptidebehc18(3.5μm，4.6mm×250mm)；检测波长：214nm；柱温为30℃；流速1.0ml/min；流动相：a-(0.015m高氯酸钠+0.02m磷酸二氢钠)：四氢呋喃＝92:8，b-乙腈：四氢呋喃＝9:1，梯度洗脱设置如下：时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)07030306040354060407030507030实验步骤：将聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物用40％乙腈溶解并定量稀释制成每1ml中含聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物1mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液20μl注入液相色谱仪，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图1。附图1表明，在该色谱条件下，聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物峰和杂质峰可以完全分离，且聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物峰的保留时间在25.438min左右。实施例2仪器与条件：agilent1260液相色谱系统，dad检测器，色谱柱：watersxbridgepeptidebehc18(3.5μm，4.6mm×250mm)；检测波长：210nm；柱温为25℃；流速0.8ml/min；流动相：a-(0.005m高氯酸钠+0.01m磷酸二氢钠)：四氢呋喃＝95:5，b-乙腈：四氢呋喃＝9:1，梯度洗脱设置如下：时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)06535305050353070406535506535实验步骤：将聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物用40％乙腈溶解并定量稀释制成每1ml中含聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物1mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液20μl注入液相色谱仪，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图2。附图2表明，在该色谱条件下，聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物峰和杂质峰可以完全分离，且聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物峰的保留时间在25.878min左右。实施例3仪器与条件：agilent1260液相色谱系统，dad检测器，色谱柱：watersxbridgepeptidebehc18(3.5μm，4.6mm×250mm)；检测波长：220nm；柱温为35℃；流速1.2ml/min；流动相：a-(0.02m高氯酸钠+0.02m磷酸二氢钠)：四氢呋喃＝90:10，b-乙腈：四氢呋喃＝9:1，梯度洗脱设置如下：实验步骤：将聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物用40％乙腈溶解并定量稀释制成每1ml中含聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物1mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液20μl注入液相色谱仪，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图3。附图3表明，在该色谱条件下，聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物峰和杂质峰可以完全分离，且聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物峰的保留时间在25.190min左右。实施例4系统适应性实验仪器与条件：agilent1260液相色谱系统，dad检测器，色谱柱：watersxbridgepeptidebehc18(3.5μm，4.6mm×250mm)；检测波长：214nm；柱温为30℃；流速1.0ml/min；流动相：a-(0.015m高氯酸钠+0.02m磷酸二氢钠)：四氢呋喃＝92:8，b-乙腈：四氢呋喃＝9:1，梯度洗脱设置如下：时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)07030306040354060407030507030实验步骤：取本品适量，精密称定，加40％乙腈溶解并稀释制成每1ml中含1mg的溶液，作为供试品溶液。取供试品溶液，连续进样六次，分别计算聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物峰峰面积以及保留时间的相对标准偏差，实验结果见表1。表1聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物系统适用性实验结果由表1可知，聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物峰面积的相对标准偏差为0.72％，保留时间的相对标准偏差为0.17％。可见，该色谱条件下，聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物的分析结果稳定可靠。实施例5重复性实验仪器与条件：同实施例4。实验步骤：取本品适量，精密称定，加40％乙腈溶解并稀释制成每1ml中含1mg的溶液，作为供试品溶液，同法配制6份供试品溶液。取供试品溶液，连续进样六次，按面积归一化法计算聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物含量，并计算其相对标准偏差，实验结果见表2。表2聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物重复性实验结果由表2可知，各供试品溶液中聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物的含量没有明显差异，相对标准偏差为0.27％，可见本分析检测方法的重复性良好。实施例6耐用性实验仪器与条件：agilent1260液相色谱系统，dad检测器，色谱柱：watersxbridgepeptidebehc18(3.5μm，4.6mm×250mm)；流动相：a-(0.015m高氯酸钠+0.02m磷酸二氢钠)：四氢呋喃＝92:8，b-乙腈：四氢呋喃＝9:1，梯度洗脱设置如下：时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)07030306040354060407030507030实验步骤：取本品适量，精密称定，加40％乙腈溶解并稀释制成每1ml中含1mg的溶液，作为供试品溶液。分别通过改变柱温、流速和色谱柱批号，记录聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物含量的变化情况(按面积归一化法计算)，实验结果见表3。表3聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物耐用性实验结果由表3可知，改变柱温、流速和检测波长后，聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物含量的测定结果没有明显差异，可见本发明分析检测方法的耐用性良好。实施例7线性与范围实验仪器与条件：同实施例4。实验步骤：取聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物样品50mg，精密称定，置于10ml容量瓶中，加40％乙腈溶解并稀释至刻度，作为线性储备液。精密量取线性储备液0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.5ml分别置于5ml容量瓶中，用40％乙腈稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，将供试品溶液注入液相色谱仪，按上述条件进行高效液相色谱分析。以供试品溶液的浓度(mg/ml)为横坐标，以聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物峰峰面积为纵坐标进行线性回归，得线性回归方程a＝3806.85c-117.65，结果见附图4。由附图4可知，图中趋势线的相关系数r＝0.999，可见在该色谱条件下，聚乙二醇化促胰岛素分泌肽类似物在0.41mg/ml～1.53mg/ml的浓度范围内线性关系良好。当前第1页12