一种基于电荷效应的适体传感器及其构建方法和应用与流程

本发明涉及一种生物传感器，特别涉及一种基于电荷效应的适体传感器及其构建方法，以及用所述传感检测肿瘤标志物的电化学方法；属于电化学生物传感器领域。

背景技术：

阿尔茨海默症(ad)是一种进行性和致命性的神经突变型疾病。而在常规临床实践中还没有明确的诊断测试。ad脑的标志物包括有胞外β-淀粉样蛋白(aβ)蛋白聚集体和细胞内高度磷酸化的tau神经纤维缠结组成的斑块。目前对于影响ad的淀粉样蛋白aβ研究表明，aβ的聚集过程大致是aβ从单体到寡聚体再到纤维的聚集过程。而与淀粉样蛋白原纤维相比，可溶性淀粉样蛋白寡聚体是最具有细胞毒性的聚集体，而且在阿尔茨海默症患者脑脊液中的含量明显比正常人中的含量高。因此发明一种能快速检测aβ寡聚体的含量，且灵敏性高，易于操作，并能特异性识别aβ寡聚体的方法就显得尤为重要。目前存在的荧光，spr检测aβ的方法，均有其优势也有其劣势，有效性，易于操作，无辐射是共有的优势，但由于aβ物种通常为aβ单体，aβ寡聚体，aβ聚集体的混合物，如果检测方法不能准确的识别aβ寡聚体，会使其灵敏性降低。而对于传统的电化学方法而言，典型的是利用巯基与金电极结合固定在电极表面，这种方法在电化学测试的过程中不稳定而容易脱落，而且修饰巯基的分子成本比较高。因此对于快速，灵敏，成本低的检测aβ寡聚体仍然是一个巨大的挑战。

技术实现要素：

针对现有技术存在的缺陷，本发明的目的是在于提供一种稳定性好、灵敏度高、检测限低的电化学生物传感器。

本发明的另一个目的是在于提供一种操作简单、成本低的构建基于电荷效应的适体生物传感器的方法。

本发明的第三个目的是在于提供一种基于电荷效应的适体生物传感器在检测肿瘤标记物中的应用，其具有简单、快速、高灵敏度、低检测限的优点。

为了实现上述技术目的，本发明提供了一种基于电荷效应的适体传感器的构建方法，该方法包括以下步骤：

1)将金电极浸泡在含4-[(三甲基硅基)乙炔基]苯甲酸和四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液中，在避光及室温环境中反应，得到4-羧基苯基乙炔基修饰的金电极；

2)将dna1与dna2进行杂交反应，得到dsdna；所述dna1一端修饰氨基，dna2一端修饰biotin；所述dna1与dna2完全互补；

3)所述4-羧基苯基乙炔基修饰的金电极与dsdna进行酰胺化反应后，采用mch溶液封闭金电极表面；

4)在3)处理后的电极表面滴加含纳米金-链霉亲和素、巯基二茂铁及肿瘤标志物适体的复合物溶液，进行biotin-streptavidin特异性反应，即得。

优选的方案，1)中，反应时间为0.5～2h

优选的方案，2)中，dna1与dna2在缓冲溶液中，在25～40℃温度下，孵育2～4h。

优选的方案，dna1在缓冲溶液中的浓度为1～10μm。

优选的方案，dna2在缓冲溶液中的浓度为1～10μm。

较优选的方案，所述肿瘤标志物适体为aβ1-40寡聚体适体。

本发明还提供了一种基于电荷效应的适体传感器，由上述构建方法得到。

本发明还提供了一种基于电荷效应的适体传感器的应用，将其应用于检测肿瘤标志物。

优选的方案，根据肿瘤标志物与所述基于电荷效应的适体传感器反应前后的电化学信号的变化量来检测肿瘤标志物的量。

优选的方案，所述肿瘤标志物为aβ1-40寡聚体。

本发明的基于电荷效应的适体传感器的构建方法包括以下具体步骤：

1)将金电极浸泡在含4-[(三甲基硅基)乙炔基]苯甲酸和四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液中，在避光及室温环境中反应0.5～2h(优选为1h)，得到4-羧基苯基乙炔基修饰的金电极；

2)一端修饰有氨基的dna1与一端修饰有biotin的dna2在25～40℃温度下，混合孵育1～4h(优选为在37℃孵育2h)，得到孵育的dsdna混合溶液；所述的孵育混合溶液中dna1和dna2的浓度分别为1～10μm和1～10μm；

(3)所述的4-羧基苯基乙炔基修饰的金电极与dsdna溶液进行酰胺反应，用水冲洗；

(4)再将(3)处理后的金电极放置于mch溶液中封闭，然后将纳米金-链霉亲和素与巯基二茂铁以及肿瘤标志物适体的复合物滴加于电极上，进行biotin-streptavidin的特异性反应，在室温下反应3～7h；即得基于电荷效应的适体传感器。

本发明的方法构建的基于电荷效应的生物传感采用适体来作用于相应的蛋白，具有更高的特异性和识别力，检测的灵敏度更高；同时引入二茂铁信号分子，来检测对应的肿瘤标记物，检测限低，效率高。

本发明的dna1和dna2可以直接通过购买得到，如生工生物工程上海(股份)有限公司。本发明采用的dna1为一端修饰氨基；dna2一端修饰biotin。两条单链dna杂交得到dsdna。dna1上的-nh2可以与4-羧基苯基乙炔基修饰的金电极上的-cooh发生酰胺反应，从而使得dsdna固定到电极表面。

本发明采用的分子探针，fc是还原性物质，于pbs中测量方波，在0.30v左右会有明显的fc的峰；根据方波电流的变化量，可以定量检测aβ寡聚体的量。

本发明的技术方案关键在于通过4-[(三甲基硅基)乙炔基]苯甲酸作为“桥键”将含纳米金-链霉亲和素、巯基二茂铁及肿瘤标志物适体的复合物的dsdna键接到金电极表面，大大提高了肿瘤标志物适体传感器界面的稳定性，同时提高了电子传递，有利于获得更宽检测范围和提高灵敏度。4-[(三甲基硅基)乙炔基]苯甲酸通过脱保护基后通过碳-金键结合在金电极表面，大量实验表面，通过碳-金键稳定性特别好，能够大大提高界面稳定性，同时将dsdna与金电极之间引入了具有大共轭体系基团，能够加速电子传递，使电流增大，有利于获得更宽检测范围和检测灵敏度，传感器界面通过碳-金键结合带来的效果远远要好于现有技术中常规的硫-金键结合。

相对现有技术，本发明技术方案带来的有益技术效果：

1)本发明的基于电荷效应的传感器的构建方法将两种含不同的dna孵育杂交后，再通过碳-金键修饰至金电极表面，构建的传感器界面稳定性高。

2)通过本发明的方法构建的基于电荷效应的传感界面，在-0.2～0.8v范围内进行方波伏安扫描，基底表面呈现正电性，而dsdna远离界面端修饰的纳米金-链霉亲和素与巯基二茂铁以及肿瘤标志物适体的复合物带负电，从而产生较大的电流相应，肿瘤标志物的适体能对标志物进行准确检测，没有干扰物质，检测限低，灵敏度更高。

3)本发明的基于电荷效应的传感界面构建方法简单、重复性好，且采用dna上修饰-nh2，进行酰胺反应以便固定于电极上，成本相对更低。

4)本发明的基于电荷效应的传感界面修饰的探针分子即适体，可直接用来检测标志物。

5)本发明的基于电荷效应的传感界面通过肿瘤标志物适体(aptamer)来作用于肿瘤标志物，同时根据分子探针的电化学信号的大小来检测肿瘤标志物的含量，具有灵敏度高、检出限低、特异性强的特点。

6)本发明引入适体，稳定性好，且适体与相应的肿瘤标志物能形成稳定的聚合体，灵敏度高、检出限低。且适体相比较于抗体，其处理过程更为简单，且易合成。

7)本发明技术引入的两种适体序列可变，适体更换序列后可以推广到检测相对应的其他标志物，如多肽，dna，rna，使得传感器能得到更广泛的应用，具有一定的普遍性。

附图说明

【图1】为构建传感界面的过程示意图；

【图2】为传感界面构建过程的eis表征；

【图3】为在构建的传感界面表面加入一系列不同浓度的aβ寡聚体后的swv图；

【图4】为在一定的浓度范围内aβ寡聚体的线性关系图。

具体实施方式

以下实施例旨在进一步说明本发明内容，而不是限制本发明权利要求的保护范围。

实施例1

(1)在电极上构建的生物传感器的方法，步骤如下：

取小型离心管，将5μl50μm的4-[(三甲基硅基)乙炔基]苯甲酸thf溶液与50μl20μm的四丁基氟化铵thf溶液混合，然后倒扣于打磨干净的电极上，使电极完全浸泡在混合溶液中，室温下反应1h，使之形成au-c键。

分别配置10μmdna1和10μmdna2溶液，两者在37℃到下混合孵育2h，得到dsdna混合液。

将电极用四氢呋喃thf冲洗干净，将孵育好的dsdna溶液与50μmedc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和50μmnhs(n-羟基琥珀酰亚胺)溶液相同体积混合，倒扣于电极上，放置3小时，是dna1上的氨基与4-[(三甲基硅基)乙炔基]苯甲酸的-cooh发生酰胺反应，从而使得dsdna固定于电极表面，然后用1mm的mch封闭电极表面的空位点，以及除去非特异性吸附的dsdna。最后滴加15μl的纳米金-链霉亲和素与巯基二茂铁以及肿瘤标志物适体的复合物(200μl纳米金-链霉亲和素与5μl适体混合过夜，然后加入巯基二茂铁在振荡器上振荡2天，使之充分反应。纳米金-链霉亲和素与适体浓度比为：1:416)于电极上。

对aβ寡聚体的定量分析步骤如下：

(2)分别配制不同浓度的aβ寡聚体(0.1nm,1nm,10nm,100nm,1μm,5μm,40μm)，分别依次加入到以上构建的生物传感器上，由于纳米金-链霉亲和素与巯基二茂铁以及肿瘤标志物适体的复合物中的适体为aβ寡聚体的aptamer，它能够和aβ寡聚体形成稳定的聚合结构。从而使得纳米金-链霉亲和素与巯基二茂铁以及肿瘤标志物适体的复合物中的适体从复合物中脱落，从而使得复合物所带的负电荷减少，二茂铁的信号减小，根据二茂铁信号的变化量来定量分析aβ寡聚体。

从图2可以看出dsdna组装后，阻抗明显增大，mch组装后阻抗有所减小，说明dna的非特异性吸附已被除去，复合物组装后，阻抗进一步减小，这是由于纳米金的导电性很强，加快了电子的传递。通过阻抗谱可以说明表面传感界面成功构建。

从图3随着加入的肿瘤标志物aβ寡聚体的量逐渐增多，其响应信号逐渐增大。

从图4可以看出在一定的浓度范围内aβ寡聚体浓度越大，其电流的变化量越大，达到某一浓度后会趋于平衡，在低浓度范围内有很好的其线性关系。