一种定量检测奶粉中β‑乳球蛋白的方法与流程

本发明属纳米材料、荧光传感技术和生物分析检测领域，具体涉及基于磁性纳米粒和碳点的荧光适配体传感平台定量测定奶粉中β-乳球蛋白(β-lg)的方法。

背景技术：

在当今社会，食物过敏是人们所关注的食品安全问题之一。其中，牛乳蛋白过敏是儿童早期最常见的过敏反应。据统计，在婴儿出生后的头几年里，牛奶蛋白过敏率会达到2-3％。β-乳球蛋白(β-lg)被认为是牛奶中主要的致敏蛋白，即使在低浓度的情况下，也能引起过敏反应，症状有：胃肠道病变、特应性皮炎、荨麻疹、过敏性鼻炎、哮喘、血管性水肿、慢性咳嗽等。为了减少牛奶过敏的发生率，相关人员研发了低敏配方奶粉(hf)，且已有市售，以作为牛奶的替代品。这些低敏配方奶粉通常将牛乳清蛋白或酪蛋白经酶或酸处理，以消除它们的致敏性。但仍然会存在极少量的β-lg，在某些情况下，用这些配方喂养的婴儿仍会发生过敏反应。因此，建立一种能够检测低敏配方奶粉中存在的β-lg含量的方法，以评估其安全性是非常必要的。

现有的β-lg的检测方法，包括hplc、基于表面等离子体共振(spr)、电化学免疫传感、荧光免疫传感等方法，在这些分析方法中，荧光生物传感器被认为是最具前景的分析工具之一，由于其反应速度快、成本低、使用简单、灵敏度高，因此被广泛的应用于各个领域。

近年来，作为一种新型的荧光纳米材料，碳点(cds)由于具有良好的光稳定性、低毒性、良好的生物相容性和良好的水溶性等特性，引起了人们的极大关注。由于其出色的物理和化学特性，cds已被广泛用于检测蛋白质、金属离子和其他小分子。然而，荧光分析技术的发展由于缺乏选择性而受到限制，适配体的引入克服了这一缺点。

适配体(aptamer)是从随机序列的核酸库中，通过指数富集系统进化技术(selex)筛选得到的dna或rna寡核苷酸，可以与目标分子特异性结合。与抗体相比，适配体具有成本低、稳定性高、易合成和易标记等优势。近年来有许多基于aptamer的分析方法用于各种目标分子的检测，但据我们所知，目前还没有基于碳点的荧光适配体传感平台用于β-乳球蛋白的检测。

技术实现要素：

针对现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种定量检测奶粉中β-乳球蛋白(β-lg)的方法，基于磁性纳米粒和碳点的荧光适配体传感平台，具有灵敏度高、选择性好、检测简便的优点，可以直接应用于奶粉中β-乳球蛋白(β-lg)的检测。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种定量检测奶粉中β-乳球蛋白的方法，步骤如下：

(1)、制备fe3o4磁性纳米粒-适配体复合物:合成羧基修饰的fe3o4磁性纳米粒，将fe3o4磁性纳米粒在edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)的作用下，与适配体通过酰胺键共价结合，形成fe3o4-适配体复合物；

(2)、制备cds标记的荧光探针cds-cdna：以柠檬酸为碳源，二乙烯三胺为钝化剂合成cds，将cds在edc、nhs的作用下，与cdna通过酰胺键共价结合，形成cds-cdna复合物；

(3)、将步骤(1)所得的fe3o4-适配体复合物与步骤(2)所得的cds-cdna复合物共孵育，形成复合物fe3o4-适配体-cdna-cds；

(4)、将复合物fe3o4-适配体-cdna-cds与奶粉中的β-lg孵育后，磁性分离，测定上清液的荧光强度，根据标准曲线，得到奶粉中β-lg的含量。

具体而言，各步骤具体如下：

(1)制备fe3o4-适配体复合物:

羧基修饰的fe3o4磁性纳米粒(浓度为0.1-1.0mg/ml)中加入edc、nhs后在微酸性环境活化30min，然后调节ph至微碱性，加入适配体，室温孵育过夜，磁性分离，得到fe3o4-适配体复合物，用pbs清洗去除多余的适配体和杂质后复溶于pbs中备用。

(2)碳点标记荧光探针(cds-cdna)的制备：

制备方法同步骤(1)，不同之处在于羧基修饰的fe3o4磁性纳米粒替换为碳点，其浓度更改为0.05-1.0mg/ml。

(3)奶粉中β-lg的定量检测

取步骤(1)中制备的fe3o4-适配体与步骤(2)中制备的cds-cdna在4-55℃孵育0.5-3.0h，磁性分离，去除未反应的物质后复溶于pbs中。将待测奶粉样品加入上述溶液中，室温孵育1h后，磁性分离，测定上清液的荧光强度，根据标准曲线，即可确定奶粉中β-lg的含量。

本发明定量检测奶粉中β-lg的原理是：首先，羧基化的fe3o4磁性纳米粒(magneticnanoparticles,mnps)与β-lg的适配体(aptamer)通过酰胺键连接，形成fe3o4-适配体复合物；然后，以柠檬酸为碳源、二乙烯三胺为钝化剂合成碳点(cds)，并将其与β-lg适配体的互补链(cdna)通过酰胺键连接，形成荧光标记探针cds-cdna；接着，将fe3o4-适配体与cds-cdna通过适配体和cdna杂交形成复合物fe3o4-适配体-cdna-cds；如果没有加入β-lg，则复合物fe3o4-适配体-cdna-cds可以通过磁性分离出来，因此，上清液中不含cds，不能检测到荧光。然而，当加入β-lg后，β-lg会与适配体结合，形成适配体-β-lg复合物，从而使部分cds-cdna从fe3o4-适配体表面脱离。在检测系统中，β-lg越多，与之结合的fe3o4-适配体也就越多，从而释放到上清液中的cds-cdna也就越多。因此，可以通过测定上清液的荧光强度对奶粉中β-lg进行定量检测。

有益效果：本发明采用羧基修饰的fe3o4磁性纳米粒作为载体，负载β-lg的适配体，用以识别β-lg；同时将cds与cdna相结合形成cds-cdna作为荧光标记物，用以衡量溶液中β-lg的含量。与传统的检测方法相比，具有灵敏度高、选择性好、检测简便的优点，可以直接应用于奶粉中β-lg的测定。且cds固有的低毒，良好的水溶性和较高的单粒子亮度特性使整个检测过程更加环保、安全、方便。

附图说明

图1是实施例1制备得到的fe3o4磁性纳米粒的透射电子显微镜图；如图所示，fe3o4磁性纳米粒粒径约在170nm，呈近球形。

图2a是实施例2制备得到的cds的透射电子显微镜图；如图所示，cds粒径约在1.5-3nm，均匀分散，高倍透射电镜结果显示其晶格为0.21nm。

图2b是实施例2制备得到的cds的紫外吸收以及荧光激发和发射图；如图所示，在240nm和360nm处有特征紫外吸收峰，最大激发波长为354nm，最大发射波长为437nm。

图3afe3o4磁性纳米粒的浓度对目标物响应的影响曲线，可见随着浓度的增加，荧光强度先增后减。

图3bcds的浓度对目标物响应的影响曲线；可见随着浓度的增加，荧光强度先增后减。

图3c杂化温度对目标物响应的影响曲线；可见随着温度的增加，荧光强度先增后减。

图3d杂化时间对目标物响应的影响曲线；可见随着时间的增加，荧光强度先增后维持基本不变。

图4a是实施例4中加入不同量β-lg后上清液荧光强度的变化图，如图所示，随着β-lg的增加(0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50ng/ml)，上清液的荧光强度逐渐增加。

图4b是实施例4制备得到的β-lg浓度与荧光强度的线性相关图；由图可知，在一定浓度范围内，β-lg浓度的对数与荧光强度呈线性，线性回归方程为f＝183.1logc+159.9，相关系数r²＝0.9965。

具体实施方式

β-乳球蛋白(90％，上海源叶生物科技有限公司)；六水三氯化铁、醋酸钠、乙二醇、乙醇、一水合柠檬酸、二乙烯三胺、丙酮、edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)(国药集团化学试剂有限公司)；本发明中所使用的dna均由上海生工生物工程有限公司合成。

dna序列如下：

β-lg适配体:

5’-nh2-(ch2)6-cgacgatcggaccgcagtacccacccaccagccccaacatcatgcccatccgtgtgtg-3’

cdna(与适配体部分互补):

5’-nh2-(ch2)6-cacacacggatgggcatgatgttggggct-3’

实施例1羧基化四氧化三铁磁性纳米粒制备，步骤如下：

0.54g六水三氯化铁和1.44g醋酸钠分别溶解在10ml乙二醇中。随后，将醋酸钠溶液在搅拌下缓慢滴加到三氯化铁溶液中。搅拌30分钟后，置于高压反应釜中，200℃反应4h，冷却到室温，用乙醇和去离子水清洗几次，40℃真空干燥12h。为了在fe3o4表面修饰羧基，将10.5g一水合柠檬酸超声溶解于100ml超纯水中，加入0.5g上述制备的fe3o4，并在室温下机械搅拌4h。最后，将所得产物用去离子水和乙醇清洗几次，40℃真空干燥即得羧基修饰的fe3o4磁性纳米粒。其透射电镜图如图1所示。

实施例2碳点cds的制备，步骤如下：

取一水合柠檬酸1.2g、二乙烯三胺0.6ml和超纯水20ml于30ml高压反应釜内，超声溶解，200℃反应4h；将反应釜取出放置至室温，得到棕褐色溶液，即为cds溶液；为纯化cds，将所得cds溶液浓缩，加入丙酮提纯后50℃真空干燥；所得到的cds为浅黄色粉末。其透射电镜图、紫外吸收以及荧光激发和发射图如图2所示。

实施例3制备fe3o4-适配体复合物，步骤如下:

将羧基修饰的fe3o4磁性纳米粒溶解在酸性pbs中，配制成0.1、0.2、0.5、1.0mg/ml的溶液，将edc、nhs加入到上述溶液中，室温活化30min；用1mnaoh调节ph至弱碱性，加入适配体，室温孵育过夜。最后磁性分离，用pbs清洗去除多余的适配体和杂质后复溶于pbs中备用，考察羧基修饰的fe3o4磁性纳米粒的浓度对目标物响应的影响，结果如图3a所示。

实施例4碳点标记荧光探针的制备，步骤如下:

将碳点溶解在酸性pbs中，配制成0.05、0.1、0.2、0.5、1.0mg/ml的溶液，将edc、nhs加入到上述溶液中，室温活化30min；用1mnaoh调节ph至弱碱性，加入适配体，室温孵育过夜。最后超滤离心，用pbs清洗去除多余的适配体和杂质后复溶于pbs中备用，考察碳点浓度对目标物响应的影响，结果如图3b所示。

实施例5制备fe3o4-适配体-cdna-cds复合物，步骤如下:

将所制备的fe3o4-适配体和cds-cdna分别于4℃、25℃、37℃、55℃反应2h，形成复合物fe3o4-适配体-cdna-cds；将所得产物磁性分离，去除未反应的物质后复溶于pbs中，考察杂化温度对目标物响应的影响，结果如图3c所示。

实施例6制备fe3o4-适配体-cdna-cds复合物，步骤如下:

将所制备的fe3o4-适配体和cds-cdna于37℃反应0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h，形成复合物fe3o4-适配体-cdna-cds；将所得产物磁性分离，去除未反应的物质后复溶于pbs中，考察杂化时间对目标物响应的影响，结果如图3d所示。

实施例7对奶粉中β-lg的定量检测，步骤如下：

将不同浓度的β-lg溶液(0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50ng/ml，图4a中a到h)加入到复合物fe3o4-适配体-cdna-cds中，室温孵育1h后，磁性分离，测定上清液的荧光强度，所得荧光图如图4a所示，荧光强度与浓度的相关性结果如图4b所示。

sequencelisting

<110>南京医科大学

<120>一种定量检测奶粉中β-乳球蛋白的方法

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